WO2012099311A1 - Ｂｃｌ３를 이용한 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Ｂｃｌ３를 이용한 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질의 스크리닝 방법 Download PDF

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백성희
김근일
김정화
최희준
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서울대학교 산학협력단
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening anti-apoptotic or apoptosis-inducing substances using Bcl3 and CtBP1.
  • Apoptosis is a major barrier to cancer formation because abnormal cells with activated oncogenes are eliminated by this pathway; In order for abnormal cells to develop into cancer cells, cell death must be bypassed. Thus, resistance to apoptosis is a major feature of cancer cells [1]. Resistance to apoptosis has been reported to be obtained through various strategies, including most of the p53 pathway [2]. Apoptosis inducing regulators in cancer cells typically have functional mutations or modified expression patterns; Such modulators may be downstream effectors of p53 (eg, PTEN, Bax, Bak or Apaf-1) or upstream regulators (eg, ATM, Chk2, Mdm2 or p19ARF) [2]. Various evidence suggests that numerous p53-independent pathways are also important for cancer cell progression [3].
  • p53 eg, PTEN, Bax, Bak or Apaf-1
  • upstream regulators eg, ATM, Chk2, Mdm2 or p19ARF
  • Bcl3 is a primary tumor-forming gene belonging to the I ⁇ B group, and the first abnormal expression in chronic B-cell lymphocytic leukemia (B-CLL) has been reported. Increased levels of Bcl3 have been detected in numerous cancers, including breast cancer [5], and the anti-apoptotic effect of Bcl3 has been reported [6]. In addition, Bcl3 enhances the transcription of Hdm2 in normal and cancer cells, resulting in downregulation of p53 activity, leading to inhibition of DNA damage-induced apoptosis [7]. The anti-apoptotic action of Bcl3 suggests that overexpression of Bcl3 can provide survival benefits to cancer cells, thereby providing a possible molecular mechanism for the proto-tumor gene function of Bcl3.
  • B-CLL chronic B-cell lymphocytic leukemia
  • CtBP1 cloned into the original E1A-interacting molecule inhibits the promotion of tumorigenic gene modification by E1A [8].
  • CtBP1-interacting molecules include transcription factors, corepressors and histone-modifying enzymes, the binding of which reflects CtBP1's role in transcription inhibition [9]. It has been suggested that inhibition by CtBP1 will play an important role in cell survival. Decreased expression of CtBP1 makes cancer cells susceptible to cell death [10]. In addition, a decrease in the amount of CtBP1 protein is sufficient to induce apoptosis in p53-null cells [11].
  • CtBP1 is proteasome-dependently degraded, activating apoptosis inducing genes and allowing apoptosis to proceed [12].
  • Bcl3 and CtBP1 play an anti-apoptotic role, the functional correlation between these two molecules in apoptosis regulation has not been extensively studied.
  • Bcl3 binds to CtBP1 and blocks CtBP1 from ubiquitination, leading to stabilization of CtBP1.
  • overexpression of Bcl3 was to maintain the CtBP1-mediated inhibition of apoptosis inducing genes to make cells resistant to apoptosis stimulation.
  • the present invention presents a new model explaining how abnormal expression of Bcl3 can regulate CtBP1 stability to confer resistance to apoptosis.
  • the inventors have discovered the molecular mechanisms underlying the tumorigenic gene action of Bcl3 (B-cell lymphoma 3), and using such mechanisms for anti-apoptosis or pro-apoptosis. Efforts have been made to develop methods for screening materials. As a result, we found a PXDLS / R motif in Bcl3 that mediates the interaction between Bcl3 and CtBP1 and confirmed that the motif induces the stability of CtBP1 by blocking proteasome-dependent degradation, thereby identifying the present invention. It was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening apoptosis inducing substance.
  • the present invention provides a method for screening an anti-apoptosis substance comprising the following steps:
  • Bcl3 which possesses anti-apoptosis inducing function, interacts with CtBP1, and as a result, Bcl3 binds to CtBP1 and uses anti-mechanisms to regulate stabilization of CtBP1. It was confirmed that apoptosis or apoptosis-inducing substances can be screened efficiently.
  • B-cell lymphoma 3 (Bcl3) is a primary tumor forming gene that is upregulated in various cancers, including breast cancer. Although Bcl3 is known to promote cell proliferation and inhibit apoptosis, the molecular mechanisms underlying Bcl3's prototumor gene action are not fully understood. In order to elucidate the role of proto-tumor genes of Bcl3, we attempted a proteomic approach to identify C-terminal binding protein 1 (CtBP1), a binding partner of Bcl3. We found a PXDLS / R motif in Bcl3 that mediates the interaction between Bcl3 and CtBP1, and found that the motif caused the stability of CtBP1 by blocking proteasome-dependent degradation.
  • CtBP1 C-terminal binding protein 1
  • a test substance to be analyzed is first contacted with a cell comprising the Bcl3 and CtBP1 genes or proteins.
  • the cells comprising the Bcl3 and CtBP1 genes or proteins are cancer cells, more preferably breast cancer cells.
  • test material is used in screening to examine whether the expression levels of Bcl3 and CtBP1 genes, the amount of Bcl3 and CtBP1 proteins or the ubiquitination of CtBP1 proteins are affected. It means an unknown substance.
  • the test substance includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.
  • Test substances can be obtained from libraries of synthetic or natural compounds. Methods of obtaining libraries of such compounds are known in the art. Synthetic compound libraries are commercially available from Maybridge Chemical Co. (UK), Comgenex (USA), Brandon Associates (USA), Microsource (USA), and Sigma-Aldrich (USA), and libraries of natural compounds are available from Pan Laboratories (USA). ) And MycoSearch (USA).
  • Test materials can be obtained by a variety of combinatorial library methods known in the art, for example, biological libraries, spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries, deconvolution By the required synthetic library method, “1-bead 1-compound” library method, and synthetic library method using affinity chromatography screening. Methods of synthesizing molecular libraries are described in DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem.
  • Bcl3 and CtBP1 are positively correlated with the increase in the amount of Bcl3 expression or protein production, or the amount of CtBP1 expression or protein production associated therewith, or the amount of Bcl3 expression or protein production. As it decreases, the amount of CtBP1 expression or protein production decreases in association with it.
  • Methods for confirming the binding or complex formation between Bcl3 and CtBP1 according to this step includes a variety of methods known in the art, preferably tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western Western blotting, immunoprecipitation or co-immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc. It can be used, and more preferably, the binding of Bcl3 and CtBP1 can be confirmed by immunoprecipitation or co-immunoprecipitation assay.
  • tissue immunostaining preferably tissue immunostaining, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), Western Western blotting, immunoprecipitation or co-immunoprecipitation assay, immunodiffusion assay, complement fixation assay, FACS, protein chip, etc.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immuno
  • the site that mediates interaction with CtBP1 in the Bcl3 site is preferably the N-terminal site of Bcl3, more preferably the PXDLS / R sequence at the Bcl3 N-terminal, most preferably in the first sequence of SEQ ID NO: PVDLR sequences 13-17 of the Bcl3 amino acid residues.
  • P is proline
  • D is asparagine
  • L is leucine
  • S is serine
  • R is arginine
  • X can be any amino acid sequence.
  • the sequence is a common motif that allows proteins that bind CtBP1 to bind CtBP1, and in one embodiment of the present invention, binding of Bcl3 and CtBP1 by a PXDLS / R sequence located in the N-terminal domain of Bcl3 This mediation was confirmed.
  • the term “upregulation” refers to a state in which the expression level of Bcl3 or the amount of Bcl3 protein is increased compared to before the test substance is contacted, and "downregulation" means contacting the test substance. As compared with the former, the expression level of Bcl3 or the amount of Bcl3 protein is reduced.
  • upregulation refers to a condition where the amount of Bcl3 expression measured by RT-PCR, or the amount of Bcl3 protein measured by ELISA method is increased compared to before contacting the test substance.
  • the term "stabilization" or "stability" of CtBP1 means that the degradation of CtBP1 is blocked or reduced, preferably that the degradation of CtBP1 is blocked or reduced, more preferably the proteasome, in response to apoptosis stimulation. Proteasome-dependent degradation is blocked or reduced. Blocking or reducing the degradation of CtBP1 may be induced by inhibiting the ubiquitination of CtBP1, Bcl3 of the present invention binds to CtBP1 to regulate the stability of CtBP1 by regulating the ubiquitination of CtBP1. According to one embodiment of the present invention, the inventors confirmed that in vivo ubiquitination assay, Bcl3 contributes to the stabilization of CtBP1 by inhibiting the ubiquitination of CtBP1.
  • the stabilization of the CtBP1 is to inhibit the expression of apoptosis inducing gene.
  • apoptosis inducing gene refers to a gene expressed and induces apoptosis, preferably a CtBP1-dependent apoptosis inducing gene, more preferably p53 , p21 or NOXA , most preferably Is p21 or NOXA .
  • apoptosis inducing gene when Bcl3 of the present invention is overexpressed, apoptosis was inhibited by significantly reducing the induction of CtBP1-dependent apoptosis inducing genes even when the apoptosis-inducing agent, etoposide, was treated. .
  • test substances that caused upregulation of the Bcl3 and / or stabilization of CtBP1 are selected.
  • the test substance that caused the upregulation and / or stabilization may be determined as an anti-cell killing substance
  • the test substance that caused the downregulation and / or stabilization inhibition may be determined as an apoptosis-inducing substance.
  • a method for screening a pro-apoptosis substance comprising the following steps:
  • the inhibition of stabilization of CtBP1 is induced by Bcl3 not inhibiting the ubiquitination of CtBP1.
  • the inhibition of stabilization of CtBP1 is induced by proteasome-dependent degradation of CtBP1.
  • the inhibition of stabilization of the CtBP1 is to promote the expression of apoptosis inducing gene.
  • the apoptosis inducing gene is p53 , p21 or NOXA .
  • the screening-in material by the screening method of the present invention is a material that induces apoptosis or has anti-apoptotic activity, which is used as a therapeutic agent for various diseases and diseases that can be treated by inducing apoptosis. Or may be screened as an anti-cell killing agent (eg, a carcinogen).
  • diseases that can be treated by causing cell death include cancer and fibrosis, and the fibrosis includes, but is not limited to, liver fibrosis, pulmonary fibrosis and kidney fibrosis.
  • the method of the present invention by effectively screening the lead compounds of the new drug inducing apoptosis, it is possible to improve the hit-ratio in preclinical and clinical trials, and consequently induce apoptosis The cost and time required to develop new drugs that work can be greatly reduced.
  • the present invention provides for the first time a method for screening through the molecular mechanisms underlying the proto-tumor gene action of Bcl3.
  • the screening method of the present invention is a novel approach that enables simple and efficient screening of anti-apoptotic substances, such as substances or carcinogens, which are effective in the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention presents new possibilities in the development of cancer treatment methods by adopting Bcl3 and CtBP1 as novel therapeutic targets.
  • Panel 1 shows CtBP1 as a binding part of Bcl3.
  • Panel A shows the results of immunoblotting analysis using anti-CtBP1 antibody after endogenous immunoprecipitation of Bcl3 using anti-Bcl3 antibody from MCF7 cell lysate.
  • Panel B shows autoradiography photographs of GST-pull-down assays with 35 S-methionine-labeled CtBP1 and recombinant GST-tagged Bcl3 modified on in vitro .
  • Panel C shows autoradiographic images of GST-pull-down assays using 35 S-methionine-labeled Bcl3 mutations and recombinant GST-CtBP1 protein modified on in vitro, respectively.
  • On the right is a schematic showing each Bcl3 construct.
  • Panel D is a schematic showing the conserved PXDLS / R motifs between CtBP1-binding proteins.
  • Panel E is the result of co-immunoprecipitation of Bcl3 with Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT in HEK293 cells.
  • Panel A is the result of an immunoblotting assay showing the effect of knocked down Bcl3 on CtBP1 protein levels in U20S cells. Cells were treated with MG132 (5 ⁇ g / ml) for 12 hours to block proteasome degradation. Panel B shows test results analyzed by real-time PCR to determine the effect of knocked down Bcl3 on CtBP1 transcription levels in U20S cells.
  • Panel C shows in vivo ubiquitin using HERK293T cells co-expressing HA-CtBP1, HisMax-ubiquitin and Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT after treatment with MG132 (5 ⁇ g / ml) for 6 hours and gradually increasing the dose. The results of the analysis are shown Anti-HA antibodies were used for ubiquitination CtBP1 detection.
  • Panel D shows the results of real-time RT-PCR analysis of Bcl3 transcription levels in U20S cells when cultured for 8 hours after treatment with increasing UV dose.
  • Panel E shows immunoblotting results for endogenous protein levels of Bcl3 and CtBP1 in U20S cells when incubated for the indicated time after 50 or 2000 J / m 2 UV treatment.
  • Panels F and G were treated with etoposide (500 ⁇ M) for 12 hours (panel F) or for the indicated time (panel G) and then for endogenous protein levels of CtBP1 in U20S cells with or without Flag-Bcl3 overexpression. Immunoblotting results are shown.
  • Panel H is a line graph showing the relative protein levels of CtBP1 shown in Panel G as a percentage ratio compared to the etoposide non-treated control using a densitometer.
  • Figure 3 shows the inhibition of CtBP1-mediated apoptosis by Bcl3.
  • Panels A and B show NOXA and p21 (CtBP1-dependent genes) stably expressing Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT in U20S cells without 18 hours of culture conditions or incubation in the presence of etoposide (500 ⁇ M) (panel) Transcription levels of A) or PUMA (CtBP1-independent genes) (Panel B) were analyzed by real-time quantitative RT-PCR. Results were expressed in activated folds compared to etoposide non-treated controls.
  • Panels C and D show ctbp +/- and ctbp - /- MEFs (Panel C) and H1299 cells expressing Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT with 18 hours of culture after 500 J / m 2 UV treatment.
  • panel D the transcription level of NOXA was analyzed by real-time quantitative RT-PCR. Results were expressed in activated folds compared to UV non-treated controls.
  • Panel E was stained with propidium iodide (PI) and FACS in ctbp +/- and ctbp - /- MEFs expressing Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT after 12 hours of UV treatment at 500 J / m 2 . Analysis of cell cycle distribution is shown.
  • the sub-G group was considered to be apoptosis group.
  • Panel 4 is a diagram showing the positive correlation between Bcl3 and CtBP1 expressed in breast cancer tissues.
  • Panel A shows the results of immunoblotting analysis of endogenous CtBP1 and Bcl3 protein levels using antibodies specific for proteins in normal breast cell lines (MCF10A) and breast cancer cell lines (MCF7, HCC1419, HCC38, BT20 and KPL4), respectively. ⁇ -actin was used as a loading control.
  • Panel B shows the results of immunoblotting analysis of CtBP1 after knocking down Bcl3.
  • Panel C shows the results of immunoblotting analysis of endogenous CtBP1 and Bcl3 protein levels of human breast patient samples and corresponding normal mucosal samples, respectively, using antibodies specific for the protein.
  • Panels D and E are the results of statistical analysis of the relative protein levels of Bcl3 and CtBP1 in the human breast cancer tissues compared to normal tissues through a paired t-test. The data are expressed as bars and whiskers representing the median and 50% (bar) and 99.3% (whisker) distributions of all samples examined. Comparison of cancer and normal tissues p value was p ⁇ 0.001.
  • Panel F shows the results of a scatter plot of the correlation between expression levels of Bcl3 (x-axis) and CtBP1 (y-axis) in breast cancer and normal tissues. The R 2 value was calculated to be 0.8643, indicating a significant positive correlation.
  • the following antibodies were prepared: anti-Flag and anti-b-actin (Sigma-Aldrich), anti-GFP and anti-Bcl3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-CtBP1 (Millipore), anti-HA (Roche), And anti-tubulin (Abfrontier). Proteins were separated using SDS-PAGE for immunoblotting and transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore). Immunoblot detection was carried out using light chains specific for HRP-binding secondary antibodies and HRP-binding secondary antibodies (The Jackson Laboratory), and chemiluminescence system (Animal Genetics).
  • HEK 293T cells (ATCC) were infected using plasmids encoding Flag-Bcl3 WT or Flag-Bcl3 MT, HA-CtBP1, and HisMax-ubiquitin. After 48 hours of incubation, cells were treated with MG132 (5 ⁇ M) for 6 hours. Cells were disrupted using lysis buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tri-HCl at pH 7.8, 0.15 Nonidet P40 and 1 mM EDTA) and then reacted at 4 ° C. for 2 hours using Talon metal affinity resin (Clontech). . The resin was removed by centrifugation and washed with lysis buffer for 4 hours. Then, the samples were subjected to SDS-PAGE and immunoblot analysis.
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 25 mM Tri-HCl at pH 7.8, 0.15 Nonidet P40 and 1 mM EDTA
  • sequence of primer pairs is as follows: CtBP1 5'-GGTCCTGAACGAGGCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 2) and 5'-TGTTGTCAAAACCACTGCCAA-3' (SEQ ID NO: 3); p21 5'-GCAGACCAGCATGACAGATTTC-3 '(SEQ ID NO: 4) and 5'-GGATTAGGGCTTCCTCTTGGA-3' (SEQ ID NO: 5); And NOXA 5'-CAAACTGAACTTCCGGCAGAA-3 '(SEQ ID NO: 6) and 5'-TCCCCTCATGCAAGTTTTTGA-3' (SEQ ID NO: 7).
  • the present inventors have sought to identify Bcl3-interacting molecules that contribute to the proto-oncogenic function of Bcl3. After performing Affinity purification-mass mass spectrometry four times with Flag-tagged Bcl3, the results were obtained from liquid chromatography / tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) analysis. Various Bcl3 binding proteins were obtained [13] (Table 1).
  • Flag-Bcl3 was transiently expressed in HEK293 cells, and cell lysates were reacted with anti-Flag antibodies for 30 minutes and eluted using Flag peptides. Elution was analyzed by LC-MS / MS. The whole process was repeated four times and the frequency of each protein was specified.
  • the PXDLS / R sequence located at the N-terminal region of Bcl3.
  • the PXDLS / R sequence was a common motif in the CtBP1-binding protein that allowed the CtBP1-binding proteins to bind CtBP1 [9] (FIG. 1D).
  • the sequence was mutated to PVASR. These mutations are the same amino acid changes as in the E1A common motif where E1A does not bind CtBP1.
  • Wild type Bcl3 (Bcl3 WT) bound to CtBP1, but the mutation (Bcl3 MT) failed to interact with CtBP1 as assessed in the GST pull-down (FIG. 1C) and co-immunoprecipitation (FIG. 1E) assays.
  • the direct binding of Bcl3 to CtBP1 was found to be mediated by the PXDLS / R sequence located in the N-terminal domain of Bcl3.
  • Bcl3 stabilizes CtBP1 by inhibiting ubiquitination of CtBP1.
  • Bcl3 and CtBP1 suggested a functional link between the two anti-apoptotic molecules. Since inhibition of apoptosis inducing genes requires CtBP1, the degradation of CtBP1 by ubiquitination has been shown to play an important role in promoting cell death [12]. Since Bcl3 has been shown to regulate the turnover of p50 homodimers by ubiquitination [17], we hypothesized that Bcl3 would regulate stabilization of CtBP1 by regulating ubiquitination of CtBP1.
  • Bcl3 inhibits the induction of apoptosis inducing genes via CtBP1
  • Bcl3 WT overexpression inhibited UV-stimulated induction of NOXA in ctbp +/ ⁇ MEFs, but not overexpression of Bcl3 MT (FIG. 3C).
  • little or no difference was observed between the control, Bcl3 WT-overexpression, and Bcl3 MT-overexpressing ctbp ⁇ / ⁇ MEFs (FIG. 3C).
  • FACS analysis consolidated CtBP1-mediated inhibition of apoptosis by Bcl3.
  • Overexpression of Bcl3 WT in ctbp +/- MEFs reduced sub-G1 of apoptotic cells, but overexpression of Bcl3 MT did not cause an identifiable change compared to the control (FIG. 3E).
  • the data suggest that Bcl3 binds directly to CtBP1 and blocks apoptosis, and the anti-apoptotic function of Bcl3 is mediated at least in part by stabilization of CtBP1.
  • the present invention provides an interpretation of the novel linkages between two anti-apoptotic molecules called Bcl3 and CtBP1 and the molecular mechanisms underlying tumorigenicity.
  • Abnormal Bcl3 upregulation in cancer can be explained, at least in part, by the protective function of Bcl3, which inhibits ubiquitination of Bcl3's binding partner, CtBP1, how Bcl3 is involved in the prototumor gene function.
  • the inventors have discovered novel inhibitory pathways for CtBP1 ubiquitination.
  • the present invention reveals a complex interaction of protein functions in the regulation of CtBP1 function and cancer progression.
  • the clinical application of the present invention will provide a new pathway in the development of cancer treatment methods by adopting Bcl3 and CtBP1 as novel therapeutic targets.
  • CtBP C-terminal binding protein

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Abstract

본 발명은 항-세포사멸 물질 또는 세포사멸 유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 Bcl3의 원종양 형성 유전자 작용의 근간을 이루는 분자적 메커니즘을 통한 스크리닝하는 방법을 최초로 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 암의 예방 또는 치료에 효과적인 물질 또는 발암물질과 같은 항-세포사멸 물질을 간편하고도 효율적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

Ｂｃｌ３를 이용한 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 Bcl3 및 CtBP1을 이용한 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
세포사멸(apoptosis)은 암 형성의 주요 장벽에 해당되는데, 이는 활성화된 발암유전자를 갖는 비정상적인 세포들이 상기 경로에 의해 제거되기 때문이다; 비정상적인 세포가 암세포로 발달할 수 있기 위해서는 세포사멸을 우회하여야만 한다. 따라서, 세포사멸에 대한 저항성은 암세포의 주요한 특징에 해당된다[1]. 세포사멸에 대한 저항성은 p53 경로를 대부분 포함하는, 다양한 전략을 통하여 획득된다고 보고되었다[2]. 암세포에서 세포사멸 유도 조절자(regulator)는 전형적으로 기능적 돌연변이 또는 변형된 발현양상을 갖는다; 이러한 조절자들은 p53의 다운스트림(downstream) 작동자(effector)(예를 들어, PTEN, Bax, Bak 또는 Apaf-1)가 되거나 업스트림(upstream) 조절자(예를 들어, ATM, Chk2, Mdm2 또는 p19ARF)가 될 수 있다[2]. 다양한 증거들은 암세포 진행에 있어 수많은 p53-비의존성 경로 역시 중요하다고 제시한다[3].
Bcl3은 IκB 군에 속한 원(原)종양 형성 유전자로, 만성적 B-세포 림프구성 백혈병(B-CLL; B-cell lymphocytic leukemia)에서 비정상적인 발현이 최초로 보고되었다. 유방암을 포함하는 수많은 암에서 Bcl3가 증가된 수치로 검출되었으며[5], Bcl3의 항-세포사멸 효과가 보고되었다[6]. 게다가, Bcl3은 일반 세포 및 암세포에서 Hdm2의 전사를 향상시켜 p53 활성이 하향조절(downregulation) 되게 하여, DNA 손상-유도 세포사멸이 억제되도록 유도한다[7]. 상기 Bcl3의 항-세포사멸 작용은 Bcl3의 과발현이 암세포에게 생존 혜택을 줄 수 있다는 것을 제시함으로써, Bcl3의 원종양 형성 유전자 기능에 대한 가능적 분자 메커니즘을 제공한다.
최초 E1A-상호작용 분자로 클로닝된 CtBP1은 E1A에 의한 종양형성 유전자 변형 촉진을 억제한다[8]. CtBP1-상호작용 분자는 전사요소(transcription factor), 보조억제인자(corepressor) 및 히스톤-변형 효소를 포함하며, 상기 분자에 결합하는 것은 CtBP1이 전사 억제 역할을 한다는 것을 반영한다[9]. CtBP1에 의한 억제가 세포생존에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 것이 제안되었다. CtBP1의 발현양이 감소되면 암세포가 세포사멸에 민감해 진다[10]. 또한, CtBP1 단백질양의 감소는 p53-눌 세포(null cell)에서 세포사멸을 유발하는데 충분하다[11]. ctbp-눌 세포를 이용한 마이크로에레이 분석은 p21 및 NOXA를 포함하는 세포사멸 유도 유전자 집단이 CtBP1에 의해 전사적으로 억제된다는 것을 나타내었다[10]. 세포사멸 자극에 의해, CtBP1은 프로테아좀-의존성 분해되어, 세포사멸 유도 유전자를 활성화시키고 세포사멸이 진행되도록 한다[12].
비록 Bcl3 및 CtBP1 모두 항-세포사멸 역할을 하지만, 세포사멸 조절에 있어서 이들 두 분자간의 기능적인 상호 연관성은 광범위하게 연구되지 않았다. 본 발명자들은 Bcl3가 CtBP1에 결합하여 CtBP1이 유비퀴틴화되는 것을 차단함으로써, CtBP1의 안정화를 유도한다는 것을 발견하였다. 또한, Bcl3의 과발현은 세포사멸 유도 유전자의 CtBP1-중재 억제를 지속적으로 유지하도록 하여 세포사멸 자극에 대해 세포가 저항성을 갖도록 하였다. 본 발명은 Bcl3의 비정상적인 발현이 어떻게 CtBP1 안정성을 조절하여 세포사멸에 대한 저항성을 부여할 수 있는지를 설명하는 새로운 모델을 제시한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 Bcl3(B-cell lymphoma 3)의 원종양 형성 유전자 작용의 근간을 이루는 분자적 메커니즘을 밝히고, 상기 메커니즘을 이용하여 항-세포사멸(anti-apoptosis) 또는 세포사멸-유도(pro-apoptosis) 물질을 스크리닝하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Bcl3 및 CtBP1간 상호작용을 중재하는 Bcl3 내 PXDLS/R 모티프를 발견하였으며, 상기 모티프가 프로테아좀-의존 분해를 차단함으로써 CtBP1의 안정성을 유도한다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항-세포사멸 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 세포사멸 유도 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 항-세포사멸(anti-apoptosis) 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합을 확인하는 단계;
(c) 상기 시험물질의 접촉으로 Bcl3가 상향조절(upregulation)되는지 여부 및 상기 상향조절을 통하여 CtBP1의 안정화가 유도되는지 여부를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 상향조절 및 안정화를 유발한 시험물질을 선별하는 단계.
본 발명자들은 항-세포사멸 유도 기능을 보유한 Bcl3가 CtBP1과 어떻게 상호작용하는지에 관하여 분자적 메커니즘을 발굴하고자 노력하였고, 그 결과 Bcl3가 CtBP1에 결합하여 CtBP1의 안정화를 조절하는 메커니즘을 이용하여 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질을 효율적으로 스크리닝할 수 있다는 것을 확인하였다.
Bcl3(B-cell lymphoma 3)는 유방암을 포함하는 다양한 암에서 상향조절(upregulated)되는 원(原)종양 형성 유전자이다. 비록 Bcl3가 세포 증식을 촉진하고 세포사멸(apoptosis)을 억제한다고 알려져 있지만, Bcl3의 원종양 형성 유전자 작용의 근간을 이루는 분자적 메커니즘에 대해서는 완전히 밝혀지지 않았다. Bcl3의 원종양 형성 유전자 역할을 밝히기 위하여, 본 발명자들은 Bcl3의 결합 파트너인 CtBP1(C-terminal binding protein 1)을 동정하는 프로테오믹(proteomic) 접근을 시도하였다. 본 발명자들은 Bcl3 및 CtBP1간 상호작용을 중재하는 Bcl3 내 PXDLS/R 모티프를 발견하였으며, 상기 모티프가 프로테아좀-의존 분해를 차단함으로써 CtBP1의 안정성을 유발한다는 것을 확인하였다. CtBP1의 세포사멸 자극-유도 분해는 Bcl3의 상향조절에 의해 유의적으로 차단되었으며, 세포사멸 유도 유전자 발현의 지속적 억제 및 궁극적으로 세포사멸을 차단하였다. 흥미롭게도, Bcl3 및 CtBP1의 단백질 수준 간 강한 양의 상관관계(positive correlation)가 유방암 환자 샘플에서 검출되었다. 본 발명은 Bcl3 및 CtBP1의 신규한 조합 작용을 밝혔으며, 상기 조합작용은 암의 발달에 있어 필수요소인 암세포에서의 세포사멸 저항성 획득에 대한 설명을 제공한다.
본 발명의 방법을 각각의 단계에 따라 상세하게 설명하면 다음과 같다;
단계 (a): Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉
본 발명의 방법에 따르면, 우선 Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시킨다. 바람직하게는, Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포는 암세포이며, 보다 바람직하게는 유방암 세포이다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험 물질”은 Bcl3 및 CtBP1 유전자의 발현량, Bcl3 및 CtBP1 단백질의 양 또는 CtBP1 단백질의 유비퀴틴화에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험 물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시험 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.
시험 물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, “1-비드 1-화합물” 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
단계 (b): Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합 확인
이어서, 상기 세포에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합을 확인한다. 이는 상기 두 단백질이 서로 상호작용하는 지 여부를 확인하기 위한 첫 단계로, 시험 물질 접촉으로 유발된 Bcl3의 발현양 또는 단백질 생산량의 증가/감소에 따라 CtBP1의 발현양 또는 단백질 생산량이 이에 연관되어 증가/감소되는데 서로 연관되어 상호작용하는 지를 확인하는 것이다. 바람직하게는, Bcl3 및 CtBP1은 양의 상관관계(positive correlation)에 있어 Bcl3의 발현양 또는 단백질 생산량의 증가에 따라 CtBP1의 발현양 또는 단백질 생산량이 이에 연관되어 증가되거나 Bcl3의 발현양 또는 단백질 생산량의 감소에 따라 CtBP1의 발현양 또는 단백질 생산량이 이에 연관되어 감소되는 것이다.
본 단계에 따른 Bcl3과 CtBP1 간의 결합 또는 복합체 형성을 확인하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 포함하며, 바람직하게는 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법 (ELISA), 웨스턴 블롯팅(Western Blotting), 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법(Immunoprecipitation or Co-immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip)등을 이용할 수 있고, 보다 바람직하게는 면역침전 또는 공동-면역침전 분석법을 이용하여 Bcl3 및 CtBP1의 결합여부를 확인할 수 있다.
Bcl3 부위 중 CtBP1과의 상호작용을 중재하는 부위는, 바람직하게는 Bcl3의 N-말단 부위이며, 보다 바람직하게는 Bcl3 N-말단의 PXDLS/R 서열이고, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열의 Bcl3 아미노산 잔기 중 13번 내지 17번의 PVDLR 서열이다. 상기 PXDLS/R 서열에서 P는 프롤린, D는 아스파라긴, L은 류신, S는 세린, R은 아르기닌을 의미하며, X는 어떠한 아미노산도 서열도 될 수 있다. 상기 서열은 CtBP1에 결합하는 단백질들이 CtBP1과 결합할 수 있도록 하는 공통된 모티프(motif)이며, 본 발명의 일 실시예에서 Bcl3의 N-말단 도메인에 위치하는 PXDLS/R 서열에 의해 Bcl3 및 CtBP1의 결합이 중재됨을 확인하였다.
단계 (c): Bcl3의 상향조절 및 이와 연관된 CtBP1의 안정화 유도 측정
이어서, 상기 시험물질의 접촉으로 Bcl3가 상향조절되는지 여부 및 상기 상향조절을 통하여 CtBP1의 안정화가 유도되는지 여부를 측정한다. 본 명세서에서 용어 “상향조절(upregulation)”은 시험 물질을 접촉시키기 전과 비교하여 Bcl3의 발현량 또는 Bcl3 단백질의 양이 증가된 상태를 의미하며, “하향조절(downregulation)”은 시험 물질을 접촉시키기 전과 비교하여 Bcl3의 발현량 또는 Bcl3 단백질의 양이 감소된 상태를 의미한다. 예컨대, 용어 “상향조절”은 RT-PCR에 의해 측정된 Bcl3의 발현량, 또는 ELISA 방법에 의해 측정된 Bcl3 단백질의 양이 시험 물질을 접촉시키기 전과 비교하여 증가된 상태를 의미한다.
측정 결과, Bcl3 유전자의 발현량 또는 Bcl3 단백질의 양이 상향조절되는 것이 측정되면, Bcl3에 결합된 CtBP1의 안정화가 유도되는지 확인한다.
본 명세서에서, 용어 CtBP1의“안정화” 또는 “안정성”은 CtBP1의 분해가 차단 또는 감소된다는 것을 의미하며, 바람직하게는 세포사멸 자극에 대해 CtBP1이 분해가 차단 또는 감소, 보다 바람직하게는 프로테아좀-의존 분해(proteasome-dependent degradation)가 차단 또는 감소되는 것을 말한다. 상기 CtBP1의 분해 차단 또는 감소는 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제함으로써 유도될 수 있으며, 본 발명의 Bcl3은 CtBP1에 결합하여 CtBP1의 유비퀴틴화를 조절함으로써 CtBP1의 안정성을 조절하게 된다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 인 비보 유비퀴틴화 분석시험으로 Bcl3가 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하여 CtBP1의 안정화에 기여한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CtBP1의 안정화는 세포사멸 유도 유전자의 발현을 억제하는 것이다.
본 명세서에서, 용어 “세포사멸 유도 유전자”는 발현되어 세포사멸을 유도하는 유전자를 의미하며, 바람직하게는 CtBP1-의존 세포사멸 유도 유전자이고, 보다 바람직하게는 p53, p21 또는 NOXA이며, 가장 바람직하게는 p21 또는 NOXA이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Bcl3가 과발현될 경우 세포사멸-유도 시약인 에토포사이드(etoposide) 처리시에도 CtBP1-의존 세포사멸 유도 유전자들의 유도를 유의하게 감소시켜 세포사멸이 억제되었다.
단계 (d): 상향조절 및 안정화를 유발한 실험물질의 선별
최종적으로, 상기 Bcl3의 상향조절 및/또는 CtBP1의 안정화를 유발한 시험물질을 선별한다. 구체적으로는, 상기 상향조절 및/또는 안정화를 유발한 시험물질은 항-세포사멸 물질로 판정할 수 있으며, 하향조절 및/또는 안정화 억제를 유발한 시험물질은 세포사멸-유도 물질로 판정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 세포사멸 유도(pro-apoptosis) 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) Bcl3 및 CtBP1 유전자를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합을 확인하는 단계;
(c) 상기 Bcl3의 하향조절(upregulation)을 통하여 상기 CtBP1의 안정화가 억제되는지 여부를 측정하는 단계; 및
(d) 상기 하향조절 및 안정화 억제를 유발한 시험물질을 선별하는 단계.
본 발명의 방법 중 상기 스크리닝 방법과 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 Bcl3가 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하지 못하여 유도되는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 CtBP1의 프로테아좀-의존 분해로 유도되는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 세포사멸 유도 유전자의 발현을 촉진하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포사멸 유도 유전자는 p53, p21 또는 NOXA인 것이다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝-인(screening-in)된 물질은 세포사멸를 유도하거나 항-세포사멸 활성을 갖는 물질이며, 이는 세포사멸을 유발하여 치료될 수 있는 다양한 질환 및 질병의 치료제로서 이용될 수 있거나, 항-세포사멸 물질(예를 들어, 발암물질)로 선별할 수 있다. 예를 들어, 세포사멸를 유발하여 치료될 수 있는 질환은, 암 및 섬유증(fibrosis)을 포함하며, 상기 섬유증은 간섬유증, 폐섬유증 및 신장 섬유증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 따르면, 세포사멸을 유도하는 신약의 선도 화합물(lead compounds)을 효과적으로 스크리닝하여, 전임상 및 임상 시험에서의 적중률(hit-ratio)을 향상시킬 수 있으며, 결과적으로 세포사멸을 유도하여 작용하는 신약을 개발하는데 요구되는 비용 및 시간을 크게 줄일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 Bcl3의 원종양 형성 유전자 작용의 근간을 이루는 분자적 메커니즘을 통한 스크리닝하는 방법을 최초로 제공한다.
(ii) 본 발명의 스크리닝 방법은 암의 예방 또는 치료에 효과적인 물질 또는 발암물질과 같은 항-세포사멸 물질을 간편하고도 효율적으로 스크리닝할 수 있는 새로운 접근법이다.
(iii) 본 발명은 신규한 치료 타겟으로서 Bcl3 및 CtBP1을 채택하여 암 치료방법을 개발하는데 있어서 새로운 가능성을 제시한다.
도 1은 Bcl3의 결합 파트로서 CtBP1을 동정한 도면이다. 패널 A는 MCF7 세포 파쇄물로부터 항-Bcl3 항체를 이용한 Bcl3의 내생 면역침전 후, 항-CtBP1 항체를 이용한 면역블롯팅 분석 결과이다. 패널 B는 인 비트로 상에서 변형된 35S-메티오닌-라벨된 CtBP1와 재조합 GST-태깅된 Bcl3를 이용한 GST-풀-다운 분석시험의 자가 방사 기록 사진을 나타낸다. 패널 C는 각각 인 비트로 상에서 변형된 35S-메티오닌-라벨된 Bcl3 돌연변이와 재조합 GST-CtBP1 단백질을 이용한 GST-풀-다운 분석시험의 자가 방사 기록 사진을 나타낸다. 오른쪽은 그림은 각각의 Bcl3 컨스트럭트를 나타낸 개요도이다. 패널 D는 CtBP1-결합 단백질 간 보존된 PXDLS/R 모티프를 나타낸 개요도이다. 패널 E는 HEK293 세포에서 Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT를 이용한 Bcl3의 공동-면역침전 결과이다.
도 2는 Bcl3에 의한 CtBP 유비퀴틴화 억제에 관한 도면이다. 패널 A는 U20S 세포에서 CtBP1 단백질 수준에 대한 넉다운된 Bcl3의 영향을 나타내는 면역블롯팅 분석 시험 결과이다. 세포들은 프로테아좀 분해를 차단하기 위해 12시간 동안 MG132(5 ㎍/㎖)로 처리하였다. 패널 B는 U20S 세포에서 CtBP1 전사 수준에 대한 넉다운된 Bcl3의 영향을 실시간-PCR로 분석한 시험결과를 나타낸다. 패널 C는 6시간 동안 MG132(5 ㎍/㎖)로 처리 후 HA-CtBP1, HisMax-유비퀴틴 및 투여용량을 점차 증가시킨 Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT를 공동 발현하는 HERK293T 세포를 이용한 생체내 유비퀴틴화 분석 결과를 나타낸다. 유비퀴틴화된 CtBP1 검출에는 항-HA 항체를 이용하였다. 패널 D는 UV 투여용량을 점점 증가되게 처리 후 8시간 배양한 경우 U20S 세포에서 Bcl3의 전사 수준을 실시간 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. 패널 E는 50 또는 2000 J/m2 UV 처리 후 표기된 시간만큼 배양한 경우 U20S 세포에서 Bcl3 및 CtBP1의 내생 단백질 수준에 대한 면역블롯팅 결과를 나타낸다. 패널 F 및 G는 12시간(패널 F) 또는 표기된 시간(패널 G) 동안 에토포사이드(500 μM)로 처리한 후 Flag-Bcl3의 과발현 존재 하 또는 비존재 하 U20S 세포에서 CtBP1의 내생 단백질 수준에 대한 면역블롯팅 결과를 나타낸다. 패널 H는 패널 G에 나타낸 CtBP1의 상대적인 단백질 수준을 농도계를 사용하여 에토포사이드 비-처리 대조군과 비교하여 퍼센트 비율로 나타낸 선 그래프이다.
도 3은 Bcl3에 의한 CtBP1-중재 세포사멸 반응 억제를 나타내는 도면이다. 패널 A 및 B는 에토포사이드(500 μM)의 존재 하 18 시간의 배양 조건 또는 배양 없이 U20S 세포에서 Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT를 안정적으로 발현하는 NOXA 및 p21(CtBP1-의존 유전자)(패널 A) 또는 PUMA(CtBP1-비의존 유전자)(패널 B)의 전사수준을 실-시간 정량 RT-PCR로 분석한 것이다. 결과들을 에토포사이드 비-처리 대조군과 비교하여 활성화된 배수로 표현하였다. 패널 C 및 D는 500 J/m2의 UV 처리 후 18시간 배양 유무에 따라 Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT를 발현하는 ctbp +/- 및 ctbp - /- MEFs(패널 C)와 H1299 세포(패널 D)에서 NOXA의 전사수준을 실-시간 정량 RT-PCR로 분석한 것이다. 결과들을 UV 비-처리 대조군과 비교하여 활성화된 배수로 표현하였다. 패널 E는 500 J/m2의 UV 처리 후 12시간 배양 유무에 따라 Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT를 발현하는 ctbp +/- 및 ctbp - /- MEFs에서 PI(propidium iodide) 염색 및 FACS로 분석한 세포주기 분포를 나타낸 것이다. sub-G 군이 세포사멸 군으로 사료되었다.
도 4는 유방암 조직에서 발현하는 Bcl3 및 CtBP1의 양의 상관관계를 나타내는 도면이다. 패널 A는 정상 유방 세포주(MCF10A) 및 유방암 세포주(MCF7, HCC1419, HCC38, BT20 및 KPL4)에서 각각 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 내생 CtBP1 및 Bcl3 단백질 수준을 면역블롯팅 분석한 결과이다. 로딩 대조군으로 β-액틴을 이용하였다. 패널 B는 Bcl3를 넉다운 시킨 후에 CtBP1을 면역블롯팅 분석한 결과이다. 패널 C는 인간 유방임 환자 샘플 및 이에 대응하는 정상 점막 샘플을 각각 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 내생 CtBP1 및 Bcl3 단백질 수준을 면역블롯팅 분석한 결과이다. 패널 D 및 E는 정상조직과 비교하여 인간 유방암 조직에서 상대적인 Bcl3 및 CtBP1의 단백질 수준을 대응 t-검정(paired t-test)을 이용한 계산을 통하여 통계적으로 분석한 결과이다. 데이터는 조사된 모든 검체의 평균(median) 및 50%(바, bar)와 99.3%(휘스커, whisker) 분포를 나타내는 바 및 휘스커로 표현하였다. 암조직과 정상조직의 비교 p 값은 p<0.001. 패널 F는 유방암 및 정상조직에서 Bcl3(x-축) 및 CtBP1(y-축)의 발현 수준 간 상관관계를 분산 플롯(Scatter plot)으로 분석한 결과를 나타낸다. R 2 값은 0.8643으로 계산되었으며, 이는 유의적인 양의 상관관계를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
1. 항체 및 면역 블롯팅
다음과 같은 항체를 준비하였다: anti-Flag 및 anti-b-actin (Sigma-Aldrich), anti-GFP 및 anti-Bcl3 (Santa Cruz Biotechnology), anti-CtBP1 (Millipore), anti-HA (Roche), 및 anti-tubulin (Abfrontier). 면역블롯팅을 위해 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리하고 폴리비닐리덴 다이플로라이드 (polyvinylidene difluoride) 멤브레인(Millipore)으로 이동시켰다. 면역블롯팅(immunoblot) 검출에는 HRP-결합 이차 항체 및 HRP-결합 이차 항체에 특이적인 경쇄(The Jackson Laboratory), 및 화학발광 시스템(chemiluminescence system, Animal Genetics)을 이용하였다.
2. 인 비보 유비퀴틴화 분석
Flag-Bcl3 WT 또는 Flag-Bcl3 MT, HA-CtBP1, 및 HisMax-ubiquitin을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 HEK 293T 세포(ATCC)를 감염시켰다. 48 시간의 배양 후, 세포에 MG132(5 μM)를 6시간 동안 처리하였다. 용해완충액(150 mM NaCl, pH 7.8의25 mM Tri-HCl, 0.15 Nonidet P40 및 1 mM EDTA)을 이용하여 세포를 파쇄한 다음 Talon metal affinity resin(Clontech)을 이용하여 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 원심분리로 레진(resin)을 제거한 후 용해완충액으로 4시간 동안 세척하였다. 그러고 나서, 시료를 SDS-PAGE 시킨 후 면역블롯팅 분석을 하였다.
3. 실시간 RT-PCR
프라이머쌍의 서열은 다음과 같다: CtBP1 5’-GGTCCTGAACGAGGCTGTG-3’(서열목록 제2서열) 및 5’-TGTTGTCAAAACCACTGCCAA-3’(서열목록 제3서열); p21 5’-GCAGACCAGCATGACAGATTTC-3’(서열목록 제4서열) 및 5’-GGATTAGGGCTTCCTCTTGGA-3’(서열목록 제5서열); 및 NOXA 5’-CAAACTGAACTTCCGGCAGAA-3’(서열목록 제6서열) 및 5’-TCCCCTCATGCAAGTTTTTGA-3’(서열목록 제7서열).
4. PI(Propidium iodide)-염색 및 FACS(fluorescent-activated cell scan) 분석
배양된 세포를 신선하게 준비된 IP 염색 용액(20 ㎍/㎖ propidium iodide, 200 ㎍/㎖ DNase-free RNase A, 및 0.1% Triton X-100 in PBS)으로 염색을 하기 전에 트립신화한 후 70% 에탄올을 이용하여 4℃에서 밤새 고정하였다. DNA 함량은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다. 세포 선별은 FACSVantage 유세포 분석기(BD Biosciences)를 이용하였다. 데이터는 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
실험결과
1. Bcl3의 신규한 결합 파트너 CtBP1
본 발명자들은 Bcl3의 원(原)종양 형성 유전자 기능(proto-oncogenic function)에 공헌하는 Bcl3-상호작용 분자를 규명하고자 노력하였다. Flag-tagged Bcl3를 이용하여 Affinity purification-mass 질량분석법을 4회 수행한 후, 나노유체(nano-flow) 액체크로마토그래피/탄뎀 질량분석기(LC-MS/MS; liquid chromatography/tandem mass spectrometry) 분석으로부터 여러 가지의 Bcl3 결합 단백질을 수득하였다[13] (표 1).
표 1 Bcl3-상호작용 분자
유전자 빈도수/전체 LC-MS 단백질 이름
BCL3 4/4 B-cell CLL/lymphoma3
CTBP1 4/4 C-terminal binding protein 1
NFKB1 3/4 p50
NFKB2 3/4 p52
RUVBL1 3/4 Pontin (RuvB-like1)
RUVBL2 3/4 Reptin(RuvB-like2)
Flag-Bcl3는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현되었으며, 세포 파쇄물은 항-Flag 항체와 30분동안 반응시키고 Flag 펩타이드를 이용하여 용출하였다. LC-MS/MS로 용출을 분석하였다. 전체 프로세스는 4회 반복하였으며, 각 단백질의 빈도수를 명시하였다.
Bcl3의 결합 파트너로 알려진 p50, p52, reptin, 및 pontin의 존재는 본 발명자들의 정제 데이터가 타당하다는 것을 입증하였다[14,15]. Bcl3 및 CtBP1 양자 모두가 세포사멸 억제 효과를 발휘한다고 알려져 있기 때문에 CtBP를 확인 한 것은 흥미로운 일이었다[7,10]. Bcl3 및 CtBP1의 상호 결합은 면역침전법에 의한 내생 수준(endogenous level)에서 입증하였다(도 1A). Bcl3 및 CtBP1의 직접 결합은 GST 풀-다운(pull-down) 분석 시험으로 확인하였다(도 1B). CtBP1과의 결합에 관여하는 Bcl3 부위를 좁히기 위해, Bcl3 제거 돌연변이를 이용하여 GST 풀-다운 분석 시험을 수행하였다. Bcl3의 C-말단 부위 제거시(Bcl3 DC) 여전히 CtBP1에 결합하였으나, N-말단 부위를 추가 제거시(Bcl3 DNDC) 결합력을 상실하였다(도 1C). 상기의 결과는 Bcl3의 N-말단 부위가 Bcl3 및 CtBP1의 상호작용을 중재한다는 것을 시사하는 것이었다.
이러한 점에 있어서, 본 발명자들은 Bcl3의 N-말단 부위에 위치하고 있는 PXDLS/R 서열을 인식하였다. PXDLS/R 서열은 CtBP1-결합 단백질들이 CtBP1와 결합하도록 하는 CtBP1-결합 단백질 내 공통된 모티프(motif)였다[9](도 1D). Bcl3가 CtBP1에 결합하는 것이 실제로 PXDLS/R 모티프에 의해 중재되는지 여부를 조사하기 위해, 상기 서열을 PVASR로 돌연변이 시켜 보았다. 이러한 돌연변이는 E1A가 CtBP1에 결합하지 못하는 E1A 공통 모티프에서와 아미노산의 변화가 동일한 것이다. 야생형 Bcl3(Bcl3 WT)는 CtBP1에 결합하였으나, 돌연변이(Bcl3 MT)는 GST 풀-다운(도 1C) 및 공동-면역침전(도 1E) 분석 시험에서 평가된 것처럼 CtBP1과 상호작용하는데 실패하였다. 요컨대, Bcl3의 CtBP1에 대한 직접 결합은 Bcl3의 N-말단 도메인 내 위치하는 PXDLS/R 서열에 의해 중재되는 것을 알 수 있었다.
2. Bcl3는 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하여 CtBP1을 안정화시킨다.
Bcl3 및 CtBP1의 상호작용은 상기 두 항-세포사멸 분자 간 기능적 연결관계를 시사하였다. 세포사멸 유도 유전자의 억제에는 CtBP1이 요구되기 때문에, 유비퀴틴화에 의한 CtBP1의 분해는 세포사멸 촉진에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다[12]. Bcl3가 유비퀴틴화에 의해 p50 호모다이머(homodimer)의 턴오버(turnover)를 조절하는 것으로 나타났기 때문에[17], 본 발명자들은 Bcl3가 CtBP1의 유비퀴틴화를 조절하여 CtBP1의 안정화를 조절할 것이라고 가정하였다.
Bcl3가 CtBP1의 안정화를 조절하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 U2OS 세포에 프로테아좀 저해제인 MG132를 처리한 후, CtBP1 및 Bcl3의 발현 수준을 측정하였다(도 2A). 흥미롭게도, siRNA로 넉다운(knockdown)시킨 Bcl3는 CtBP1 단백질 수준을 감소시켰으나, MG132 처리 시 CtBP1의 하향조절을 억제하였다. 비록 Bcl3는 CtBP1의 단백질 수준을 조절하였으나, CtBP1의 전사 수준은 Bcl3에 대한 siRNA에 의해 영향을 받지 않았다(도 2B). 상기의 데이터는 Bcl3에 의해 단백질 수준에서 CtBP1을 조절하는 것은 프로테아좀-의존 방법으로 단백질 안정성을 조절하여 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.
다음으로, 본 발명자들은 Bcl3가 CtBP1 유비퀴틴화를 직접적으로 조절하는지 여부를 조사하기 위한 인 비보 유비퀴틴화 분석시험을 실시하였다. Bcl3 WT은 거의 완벽하게 CtBP1 유비퀴틴화를 억제하였음에도 불구하고, Bcl3의 CtBP1-결합 돌연변이는 유비퀴틴화를 차단하는데 실패하였다(도 2C). 상기의 데이터는 Bcl3가 PVDLR 서열을 이용하여 CtBP1에 직접적으로 결합하여 CtBP1의 유비퀴틴화를 차단하며, 이는 CtBP1 안정성의 증가를 유도한다는 것을 시사한다.
Bcl3의 하향조절은 CtBP1의 안정성을 감소시키는데 충분하였기 때문에, Bcl3가 CtBP1에 대한 유비퀴틴 기작을 조절하는 게이트키퍼(gatekeeper)로 작용하리라 생각되었다. UV 조사 시 프로테아좀-중재 경로를 통하여 CtBP1 수준이 감소된다는 것이 보고되었다[12]. 따라서, 본 발명자들은 CtBP1이 Bcl3로부터 어떻게 방출되는지 및 이러한 방출이 어떻게 세포사멸 자극에 CtBP1의 분해를 유도하는지 의문을 갖게 되었다. 상기의 경로를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 UV 처리시 Bcl3 mRNA 및 단백질 수준을 감소시키는지 여부를 조사하였다. UV 처리 강도 증가 시 용량 의존적 방법으로 Bcl3 mRNA 수준을 감소시켰다(도 2D). 50 J/m2로 UV 처리 후 8시간 배양한 경우 Bcl3 단백질 수준에서 약간의 증가를 나타내었으나, 2000 J/m2로 UV 처리 시 Bcl3 단백질 수준의 감소는 Bcl3 전사 수준의 감소를 반영하였다(도 2E). 상기의 결과는 본 발명자들이 이전에 보고한 40 J/m2 UV가 Bcl3를 안정화시키고 단백질 수준을 증가시킨다는 내용과 부합하였다[7]. 주목할 점은 2000 J/m2로 UV 처리 시 Bcl3 단백질이 감소되었을 때 CtBP1 단백질 수준이 이에 대응하여 감소되었다는 것이다(도 2E). 요컨대, 상기 데이터는 세포사멸 자극이 Bcl3의 하향조절을 유도하고 CtBP1이 분해되도록 하는 것을 나타낸다.
대조적으로, 이소성(ectopic)의 Bcl3의 도입은 세포사멸 자극에 대하여 CtBP1을 안정화 시켰다. Bcl3 WT의 과발현은 또 다른 세포사멸-유도 시약인 에토포사이드(etoposide)의 처리 후에도 CtBP1 단백질 수준을 유지하였다(도 2F). 게다가, CtBP1 단백질 수준의 시간-경로 검출은 Bcl3 WT의 과발현이 CtBP1의 분해를 차단하는 반면에, Bcl3 MT는 CtBP1의 안정화에 실패하여 CtBP1이 분해되도록 한다는 것을 확인하였다(도 2G 및 H). 상기의 결과는 CtBP1 분해의 억제가 Bcl3 및 CtBP1 간 직접결합에 의해 중재된다는 것을 뒷받침한다.
3. Bcl3는 CtBP1-중재 세포사멸 반응에 길항작용한다.
CtBP1는 세포사멸 유도 유전자를 억제한다고 보고되었기 때문에, 본 발명자들은 Bcl3가 CtBP1 분해를 억제함으로써 세포사멸 반응을 차단할 것이라는 가정을 세웠다. Bcl3에 의한 CtBP1 안정화 결과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 세포사멸 유도 CtBP1 타겟 유전자인 p21 및 NOXA의 전사 수준을 측정하였는데, 이들은 CtBP1 분해에 기인한 세포사멸 자극으로 유도되는 유전자들이다[10]. 실시간 RT-PCR 분석은 Bcl3 WT의 과발현이 에토포사이드 처리 시에도 p21 및 NOXA의 유도를 유의하게 감소시킨 반면, Bcl3 MT가 과발현 되었을 땐 상기 억제가 거의 나타나지 않았다는 것을 나타내었으며(도 3A), 이는 CtBP1-의존 세포사멸 유도 유전자의 억제에 Bcl3 및 CtBP1 간 상호작용이 요구된다는 것을 시사한다. 상기 상호작용은 명확하게 CtBP1-의존 세포사멸 유도 유전자를 조절하였으나, PUMA로 예시된 CtBP1-비의존 세포사멸 유도 유전자 조절[10]은 영향 받지 않았다(도 3B).
Bcl3이 CtBP1을 통해 세포사멸 유도 유전자의 유도를 억제하는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 UV 조사를 이용하여 ctbp +/- 및 ctbp - /- MEFs를 자극하였다. Bcl3 WT 과발현은 ctbp +/- MEFs에서 NOXA의 UV-자극 유도를 억제하였으나, Bcl3 MT의 과발현은 그러하지 않았다(도 3C). 그러나, 대조군, Bcl3 WT-과발현, 및 Bcl3 MT-과발현 ctbp - /- MEFs 간에는 차이가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다(도 3C). 상기의 데이터는 Bcl3가 CtBP1에 결합함으로써 세포사멸 유도 유전자의 도입를 억제한다는 가설을 지지한다. Bcl3에 의한 NOXA의 억제가 작동 가능한 p53이 없는 H1229 세포(ATCC)내에서 유지되었으므로, Bcl3의 CtBP1-중재 항-세포사멸 역할은 p53에 독립적인 것으로 보였다(도 3D).
게다가, FACS 분석은 Bcl3에 의한 세포사멸의 CtBP1-중재 억제를 공고히 하였다. ctbp +/- MEFs에서 Bcl3 WT의 과발현은 세포사멸 세포의 sub-G1을 감소시켰으나, Bcl3 MT의 과발현은 대조군과 비교하여 식별가능한 변화를 유발하지 못하였다(도 3E). 상기의 데이터는 Bcl3가 CtBP1에 직접적으로 결합하여 세포사멸을 차단하며, Bcl3의 항-세포사멸 기능은 CtBP1의 안정화에 의해 적어도 부분적으로는 중재된다는 것을 시사한다.
4. 유방암 조직에서 증가된 Bcl3 및 CtBP1 단백질 수준 간 양의 상관관계
세포사멸의 적시 조절이 파괴되면, 세포들은 암으로 보다 진행되는 경향이 있다[1]. Bcl3가 유방암을 포함하는 암 전반에 걸쳐 상향조절된다는 점을 고려하여[5], 본 발명자들은 유방암에서 CtBP1의 단백질 수준이 Bcl3의 단백질 수준과 양의 상관관계가 있는지 여부를 조사하였다. 다양한 유방암 세포주에서, Bcl3 및 CtBP1의 내생 단백질 수준을 조사하였다(도 4A). 기대했던 바와 같이, Bcl3의 수준은 정상 유방 세포주(MCF10A)에서 보다 암 세포주(MCF7, HCC1419, HCC38, BT20, 및 KPL4(ATCC))에서 높았다. Bcl3 및 CtBP1의 단백질 수준간 양의 상관관계는 MCF7 세포에서 Bcl3의 넉다운 이후 CtBP1 하향조절에 의해 입증되었다(도 4B).
유방암의 진행에 있어서 CtBP1의 Bcl3-의존 조절의 관련성은 임상적 증거에 의해 보다 뒷받침 되었다. Bcl3 및 CtBP1의 단백질 수준은 12명의 인간 유방암 조직 샘플 및 이에 대응한 정상 점막 표본을 이용하여 조사하였다(도 4C). 12개의 시료 중 9개에서, 정상 점막 보다 유방암 표본의 Bcl3가 더 발현되었다(도 4C 및 D). 주목할 만하게도, Bcl3 단백질이 증가된 거의 모든 샘플에서, CtBP1 단백질 또한 증가되었다(도 4C 및 E). 유방암 조직 표본에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질 수준 간 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타내었다(도 4F). 상기의 데이터는 인간 유방암에서 CtBP1 단백질 수준이 Bcl3의 단백질 수준과 아주 높게 상관되어 있다는 것을 증명한다. 요컨대, 상기의 증거는 Bcl3에 의한 CtBP1의 안정화가 Bcl3의 원종양 형성 유전자 작용의 기저를 이루는 강력한 분자적 메커니즘이 될 가능성을 나타내는 것이다.
결론
본 발명은 Bcl3 및 CtBP1이라는 두 항-세포사멸 분자간 신규한 연결관계 및 종양형성능의 기저를 이루는 분자적 메커니즘에 대한 해석을 제공한다. 암에 있어서 비정상적인 Bcl3 상향조절은 Bcl3의 원종양 형성 유전자 기능에 어떻게 연관되는지 Bcl3의 결합 파트너인 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하는 Bcl3의 보호 기능에 의해 적어도 부분적으로는 설명될 수 있다. 게다가, 본 발명자들은 CtBP1 유비퀴틴화에 대한 신규한 억제 경로를 찾아내었다. 본 발명은 CtBP1 기능 조절 및 암의 진행에 있어 단백질 기능들의 복잡한 상호작용을 밝힌다. 본 발명의 임상적 적용은 신규한 치료 타겟으로서 Bcl3 및 CtBP1을 채택하여 암 치료방법을 개발하는데 있어서 새로운 통로를 제공할 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (20)

  1. 다음의 단계를 포함하는 항-세포사멸(anti-apoptosis) 물질의 스크리닝 방법:
    (a) Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합을 확인하는 단계;
    (c) 상기 시험물질의 접촉으로 Bcl3가 상향조절(upregulation)되는지 여부 및 상기 상향조절을 통하여 CtBP1의 안정화가 유도되는지 여부를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 상향조절 및 안정화를 유발한 시험물질을 선별하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 Bcl3 및 CtBP1은 양의 상관관계(positive correlation)에 있음을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 결합은 Bcl3 N-말단에 위치하는 PXDLS/R 서열에 의해 중재되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 PXDLS/R서열은 서열목록 제1서열의 13번 내지 17번 서열인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화는 Bcl3가 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하여 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화는 CtBP1의 프로테아좀-의존 분해가 차단되어 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화는 세포사멸 유도 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 세포사멸 유도 유전자는 p53, p21 또는 NOXA인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  11. 다음의 단계를 포함하는 세포사멸 유도(pro-apoptosis) 물질의 스크리닝 방법:
    (a) Bcl3 및 CtBP1 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시험 물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포에서 Bcl3 및 CtBP1 단백질의 결합을 확인하는 단계;
    (c) 상기 Bcl3의 하향조절(downregulation)을 통하여 상기 CtBP1의 안정화가 억제되는지 여부를 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 하향조절 및 안정화 억제를 유발한 시험물질을 선별하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 암세포는 유방암 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 Bcl3 및 CtBP1은 양의 상관관계(positive correlation)에 있음을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 결합은 Bcl3 N-말단에 위치하는 PXDLS/R 서열에 의해 중재되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  16. 제 5 항에 있어서, 상기 PXDLS/R서열은 서열목록 제1서열의 13번 내지 17번 서열인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  17. 제 11 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 Bcl3가 CtBP1의 유비퀴틴화를 억제하지 못하여 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  18. 제 11 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 CtBP1의 프로테아좀-의존 분해로 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  19. 제 11 항에 있어서, 상기 CtBP1의 안정화의 억제는 세포사멸 유도 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  20. 제 11 항에 있어서, 상기 세포사멸 유도 유전자는 p53, p21 또는 NOXA인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
PCT/KR2011/006333 2011-01-17 2011-08-26 Ｂｃｌ３를 이용한 항-세포사멸 또는 세포사멸-유도 물질의 스크리닝 방법 WO2012099311A1 (ko)

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