KR20040071812A - ＨＢｘ 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을유도시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 세포사멸 억제물질 및 유전자를 탐색하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)의 유전자 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 HBx 유전자가 발현되는 간세포의 완전한 세포사멸을 세포 배양상에서 유도시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS) 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하여 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포사멸 유도 방법을 이용하여 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 물질 및 유전자를 탐색하는 시스템에 관한 것이다.

Description

ＨＢｘ 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법 및 이 방법을 이용하여 세포사멸 억제 물질 및 유전자를 탐색하는 방법{METHOD FOR INDUCING THE COMPLETE APOPTOSIS OF LIVER CELLS EXPRESSING PROTEIN HBx AND SCREENING DRUG AND GENE FOR INHIBITING APOTOSIS}
본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, HBV)의 유전자 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 HBx 유전자가 발현되는 간세포의 세포사멸을 세포 배양상에서 유도시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS) 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하여 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 유도시키는 방법에 관한 것이다.
지금까지 보고된 바이러스성 B형 간염 및 간암의 발생기전을 종합해 보면,바이러스가 감염되면 간세포의 세포사멸로 인해 간염(Hepatitis)이 발생하고, 이중 일부의 간세포가 사멸기전으로부터 회피하게 되면 간암(liver cancer)으로 발전할 수 있다고 추정된다(Chisari,Curr. Topics. Microbiol. Immunol.,206, 149-173, 1996).
바이러스성 간염 및 간암은 한국인에게 가장 많이 발생하는 질환으로 간암을 치료하기 위한 여러 연구가 시도되고 있다. 간암의 주요 인자인 B형 간염 바이러스는 HBs, HBc, HBx 및 중합효소의 4개의 단백질로 구성되며, 그 중 HBx 단백질이 바이러스성 간염, 간경변 및 간암의 주요 유발인자로 알려져 있다. HBx 단백질이 세포사멸, 세포사멸 억제 및 세포성장 중지를 직접 또는 간접적으로 조절하고 있으며, 세포사멸을 유도하는 물질에 대해 과민화 반응을 일으킨다고 보고되었다(Su 및 Schneider,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 8744-8749, 1997). 또한 HBx 유전자로 형질전환시킨 쥐에서 간암이 유발된다는 보고가 있다.
HBx 단백질에 의해 유도되는 간세포의 사멸 현상은 TNF-α(tumor necrosis factor-α)에 의한 염증 반응을 통해 일어나는 것으로 알려져 있다(Su 및 Schneider,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 8744-8749, 1997). 또한, 간세포에서 HBx 단백질이 TNF-α에 의한 세포사멸을 촉진시킨다는 보고도 있다(Chisari,Curr.Topics. Microbiol. Immunol.,206, 149-173, 1996). 이는 HBx 단백질이 TNF-α의 양을 직접 또는 간접적으로 증가시키거나, TNF-α에 의한 세포사멸로 이르는 신호 전달의 중간 매개체를 조절함으로써 일어난다.
TNF-α는 HBx 단백질에 의한 세포 내 신호전달 조절과 관련된 대표적인 사이토카인으로서, TNF-α의 신호전달은 세포사멸, 세포증식, 분화 및 생존으로 가는 다양한 신호 전달 과정에 관여한다. 우선, TNF-α가 TNF-α수용체 I(TNFR I)과 결합할 경우, 케스페이즈(caspase)를 활성화시키는 전형적인 세포사멸 과정을 거치게 된다. 반면, TNF-α수용체 II(TNFR II)와 결합할 경우, 전사인자인 NF-κB(nuclear factor kappa B)를 활성화시키면서 세포생존을 촉진하게 된다. 최근 이러한 세포사멸 및 세포생존 조절과 관련된 TNF-α신호 전달의 중간 매개체가 활성 산소(Reactive oxygen species; ROS)라는 결과들이 보고되었다(Chandel 등,J. Biol. Chem., 276, 42728-42736, 2001; Fraisse 등,Oncogene,17, 1639-1651, 1998). 예를 들어, TNF-α에 의해 유도되는 간세포의 세포사멸이 D-갈락토사민(D-galactosamine)에 의해 과민화되는 현상을 보이는데, 그 주요 원인이 활성 산소의 증가이며(Osawa 등,J. Cell. Physiol., 187, 374-385, 2001), 이러한 활성 산소의 증가는 NF-κB의 활성을 억제하면서 TNF-α에 의한 세포사멸을 촉진시킨다고 보고되었다(Ginis 등,Mol. Med.,6(12), 1028-1041, 2000). 즉 HBx 단백질과 관련된 TNF-α에 의한 세포생존 및 세포사멸을 조절하는 신호 전달 체계에서, HBx 단백질은 상황에 따라 NF-κB의 활성을 촉진하거나 억제하여 세포사멸을 조절할 수 있다(Su 등,J. virol.,75, 215-225, 2001; Su 및 Schneider,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 8744-8749, 1997).
일반적으로 NF-κB는 IκB와 복합체를 이루어 비활성 상태로 세포질에 존재하다가, TNF-α와 같은 사이토카인에 의한 세포 신호 전달에 의해 IκB가 인산화되어 분해되면서 IκB로부터 분리되어 활성화된다. 결국, 활성화 상태의 NF-κB는핵으로 이동하여 세포 주기 조절과 관련된 유전자들의 프로모터/인핸서(enhancer) 부위에 결합, 유전자 발현을 활성화시킨다. NF-κB 억제제인 설파살라진(sulfasalazine)은 IκB의 인산화를 억제하여 NF-κB의 활성화를 차단하게 된다. 설파살라진은 강력한 NF-κB의 특이적 억제제로 사용되고 있다(Wahl 등,J. Clin. Invest.,101(5), 1163-1174, 1998).
또한, TNF-α에 의한 신호 전달에 있어서 세포사멸 효과의 중간 매개체로 알려진 활성 산소를 특이적으로 증가시키는 활성 산소 유도제 메나다이온(menadione)이 보고되었다(Nishikawa 등,Jour. Biol. Chem.,270(47), 28304-28310, 1995).
본 발명자들은 NF-κB를 활성을 억제하여 세포생존의 경로는 차단시킴과 동시에, 활성 산소를 증가시켜 HBx 단백질에 의한 간세포의 세포사멸 경로를 활성화시킴으로써, HBx가 발현되는 간세포를 완전히 세포사멸시키는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포사멸 경로의 중간 매개체인 활성 산소를 특이적으로 증가시키는 활성 산소 유도제 및 세포생존에 관여하는 전사인자 NF-κB의 억제제를 처리하여 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포사멸 유도 방법을 이용하여 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 약물 및 유전자를 탐색하는 시스템을 제공하는 것이다.
도 1은 인간 간 세포주 Chang V9 및 Chang X31에서 HBx 단백질의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블럿팅 결과이다.
도 2는 메나다이온, TNF-α및 설파살라진을 단독으로 처리한 후 24시간이 경과한 때의 인간 간 세포주 Chang V9 및 Chang X31의 세포 생존율에 관한 그래프이다.
도 3은 메나다이온 및 설파살라진을 동시에 처리한 후 24시간 경과한 때의 인간 간 세포주 Chang V9 및 Chang X31의 세포 생존율에 관한 그래프이다.
도 4는 메나다이온 및 설파살라진을 동시에 처리한 후 시간 경과에 따른 인간 간 세포주 Chang V9 및 Chang X31의 세포 생존율에 관한 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 메나다이온 및 설파살라진을 처리한 인간 간 세포주 Chang V9 및 Chang X31에 DAPI 염색을 한 결과이다.
도 6a 내지 도 6e는 Chang X31의 DAPI 염색 사진으로, 도 6a는 메나다이온및 설파살라진을 처리한 경우, 도 6b, 도 6c, 도 6e 및 도 6f는 메나다이온 및 설파살라진을 처리하기 전에 각각 글루타티온, NAC, 스타우스포린, 및 스타우스포린 및 글루타티온를 처리한 Chang X31이고, 도 6d는 비처리 Chang X31의 사진이다.
도 7은 GP293 및 Chang X31 세포주에서 레트로바이러스 cDNA 라이브러리의 역가를 확인한 사진이다.
도 8a는 페록시레독신 II 유전자를 형질도입시킨 Chang X31의 세포사멸 억제 효과를 확인한 것이고, 도 8b는 상기 방법으로 형질도입시킨 Chang X31의 클론의 세포사멸 억제 효과를 확인한 것이다.
도 9은 인간 간 세포주 Chang X31에 페록시레독신 II 유전자를 발현시킨 후 웨스턴 블럿팅을 수행한 결과이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 활성 산소 유도제 및 NF-κB의 억제제를 처리하는 것을 포함하는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, HBx 단백질을 발현하는 간세포에 활성 산소 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하기 이전 또는 이후에 시험 물질을 처리하는 것을 포함하는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 물질을 탐색하는 방법, 및 HBx 단백질을 발현하는 간세포에 시험 유전자를 형질도입한 후 활성 산소 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하는 것을 포함하는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 유전자를 탐색하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, B형 간염 바이러스 유전자 산물 중 간암 유발의 주인자로 알려진 HBx 단백질을 발현하는 세포주를 확립하기 위하여, HBx 유전자를 포함하는 벡터를 인간 간 세포주인 창 세포(Chang cell)에 도입한 뒤, 클론의 단백질을 분리하고 웨스턴 블럿팅을 수행하여 간암 유발 인자 HBx 단백질이 발현하는 것을 확인하여 HBx 단백질을 영구적으로 발현하는 클론을 선별한다.
본 발명에서는 상기 방법으로 HBx 단백질을 영구적으로 발현하는 바이러스성 간 세포주를 확립하여 이를 Chang X31이라 명명하고, HBx 유전자를 포함하지 않는벡터만 도입된 대조 세포주를 Chang V9이라 명명하였다.
HBx 단백질을 발현하는 간세포에서, HBx 단백질은 TNF-α의 발현을 촉진시키고 이를 통하여 세포 내 유해 활성 산소가 증가되어 세포사멸이 유도된다. HBx 단백질에 의해 TNF-α의 양이 증가되면 세포사멸에 대한 민감화를 나타낸다고 한다(Su 및 Schneider,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,94, 8744-8749, 1997). 그러나 TNF-α는 활성 산소를 증가시킬 뿐만 아니라, 동시에 전사인자인 NF-κB의 활성을 증가시켜 세포생존으로 이르게 한다. 따라서, HBx 단백질에 의해 그 발현이 촉진되는 TNF-α는 세포사멸 및 세포생존이라는 상반된 두 가지 신호전달을 매개시키는 역할을 한다.
본 발명에서는 HBx 단백질을 발현하는 세포주에 TNF-α를 처리하여 세포사멸을 관찰하였는데, 높은 농도의 TNF-α를 처리한 경우에도 세포사멸은 관찰되지 않았다. 이는 TNF-α가 세포사멸 및 세포생존에 모두 관여함을 뒷받침하며, 결과적으로 TNF-α는 완전한 세포사멸을 유도시키는 데에는 부적합함을 확인하였다.
따라서, HBx 단백질을 발현하는 간세포를 완전한 세포사멸로 유도하기 위해서는 TNF-α에 의한 세포생존을 유발하는 신호전달을 억제함과 동시에 세포사멸은 유도시키는 물질의 처리가 요구된다.
이에 따라, 본 발명에서는 세포생존 신호전달에 관여되는 전사인자인 NF-κB를 효과적으로 저해하는 NF-κB 저해제 및 활성 산소 유도제를 처리하여 세포사멸을 보다 효과적으로 유도한다. 바람직하게는, NF-κB 저해제로 설파살라진을, 활성 산소 유도제로 메나다이온을 사용한다.
본 발명에서는 B형 간염 바이러스의 유전자 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 HBx 유전자가 발현되는 세포에 활성 산소 유도제인 메나다이온 및 NF-κB 억제제인 설파살라진의 농도를 달리하여 처리함으로써 세포 배양상에서 유도되는 완전한 세포사멸의 조건을 확립하였다. 이는 HBx 단백질을 발현하지 않는 간세포에서는 세포사멸이 유도되지 않고, HBx 단백질을 발현하는 간세포에서만 완전한 세포사멸이 유도되는 조건을 말한다.
본원에서 "완전한 세포사멸"이란 세포사멸이 100% 이루어지는 것을 의미한다.
이러한 완전한 세포사멸의 조건을 확립하기 위해서 각기 다른 농도의 메나다이온 및 설파살리진을 Chang X31 및 Chang V9 세포주에 처리하여 이들의 세포 생존율을 측정하였다. 본원에서는 세포 생존율은 배양 플레이트 상에 남아있는 세포수를 세어서 측정한다.
그 결과, 활성 산소 유도제인 메나다이온이 7 내지 10μM 및 NF-κB 억제제인 설파살라진이 1mM인 세포 배양 조건에서 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸이 유도됨을 확인하였다.
또한 활성 산소 유도제인 메나다이온의 농도 및 NF-κB 억제제인 설파살라진의 농도에 따라 세포사멸이 완전히 유도되는 데 걸리는 시간의 차이를 확인하기 위해 각각 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진, 및 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리한 Chang X31 및 Chang V9의 세포 생존율을 24시간 간격으로 5일 동안 측정하였다.
그 결과, 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하는 경우에는 HBx 단백질을 발현하는 세포주는 약물처리 후 24시간 이내에 100% 세포사멸이 유도됨에 반해, 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 동시에 처리하는 경우에는 HBx 단백질을 발현하는 세포주는 48시간 후에 세포사멸이 5 내지 10% 정도로 관찰되고, 96시간 후에 세포의 형태학적 모양 변화가 관찰되면서 세포사멸이 10 내지 20%로 증가되고, 120시간이 지난 후에야 100% 세포사멸이 유도되었다.
따라서 HBx 단백질을 발현하는 간세포에 있어서, 단시간 내에 세포사멸을 유도하기 위해서는 메나다이온 9 내지 10 μM 및 설파살라진 1.0mM을 처리하고, 장시간에 걸쳐서 세포사멸을 유도하기 위해서는 메나다이온 7 내지 8 μM 및 설파살라진 1.0mM을 처리하는 조건을 확립하였다. 본원에서는 "단시간"은 "24시간 이내"를, "장시간"은 "120시간 이상"을 말한다.
본 발명에서는 세포사멸시 관찰되는 형태학적 특징을 DAPI 염색방법으로 확인하였다. DAPI 염색이란 세포를 고정액으로 고정한 후, DAPI 염색액으로 암실에서 일정시간 세포를 염색 반응시키고 형광 현미경을 통해 세포사멸시 전형적으로 나타나는 세포핵 응축, 쪼그라듬, 알알이 깨짐(fragmentation) 등의 현상을 관찰함으로써 세포사멸을 확인할 수 있는 방법이다.
또한, 본 발명에서는 상기에서 확립된 세포사멸 유도 방법을 이용하여 HBx 단백질이 발현되는 간세포에서 일어나는 세포사멸을 억제하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 물질을 탐색하는 방법은, 1) HBx 단백질을 발현하는 간세포의 배양 배지에 활성 산소 유도제와 NF-κB 억제제, 및 세포사멸 억제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 2) 세포사멸의 억제 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
즉, 상기에서 확립된 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸 유도 조건(활성 산소 유도제 및 NF-κB 억제제의 첨가) 배양에서 세포사멸을 억제할 것이라고 추측되는 후보 물질을 첨가하여 세포사멸이 억제된다면, 이 물질은 HBx 단백질이 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 기능을 하는 것으로 추정할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 세포사멸 억제제로의 활성을 탐색하는 방법은 B형 간염 바이러스에 의한 간염 등을 치료하는 약물을 탐색하는 데 이용될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기와 같은 방법에 의해 세포사멸을 억제하는 것으로 확인된 물질을 활성 성분으로 포함하는 간염 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에서 확립된 세포사멸 유도 방법을 이용하여 HBx 단백질이 발현되는 간세포의 세포사멸을 억제하는 유전자를 탐색하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 유전자를 탐색하는 방법은, 1) HBx 단백질을 발현하는 간세포에 후보 유전자를 도입하는 단계; 2) 1)에서 얻은 세포의 배양 배지에 활성 산소 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하는 단계; 및 3) 세포사멸의 억제 여부를 확인하는 단계를 포함한다.
상기 단계 1)에서 HBx 단백질을 발현하는 간세포에 시험 유전자를 도입하는 방법은 레트로바이러스 cDNA 라이브러리로 감염시키거나 유전자 발현 벡터를 형질도입시킴에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서는 레트로바이러스 cDNA 라이브러리 벡터를 이용하여 유전자의발현을 탐색할 수 있는지 살펴보기 위해, 레트로바이러스 벡터에 대한 본 발명에 따른 HBx 단백질을 발현하는 세포주 Chang X31의 역가(titer)를 조사하였다. 그 결과, Chang X31 세포주를 대상 세포주로 사용할 때 1x104cfu/㎖ 이상 역가의 레트로바이러스가 감염됨을 확인하였으므로 레트로바이러스 cDNA 라이브러리를 본 발명에 이용할 수 있다.
또한, 발현벡터를 이용하는 경우에는, 탐색하려는 유전자를 포함하는 벡터를 리포펙타민을 이용한 방법 등의 통상적인 형질도입법에 의해 HBx 단백질을 발현하는 세포에 도입될 수 있다.
즉 상기 방법에 의해 탐색하려는 후보 유전자를 Chang X31 세포주에 도입시키는데, 후보 유전자가 세포사멸을 억제한다면 완전한 세포사멸 유도 조건에서도 살아남기 때문에, 세포사멸이 일어나는지 여부에 따라 후보 유전자가 세포사멸을 억제하는 유전자인지 여부를 조사하는 시스템을 구축할 수 있다. 따라서 이 시스템은 B형 간염 바이러스에 의한 간염 등을 치료하는 유전자를 탐색하는 데 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
<실시예 1> HBx 단백질을 발현하는 인간 간 세포주(Chang X31) 확립
B형 간염 바이러스 단백질 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 HBx 유전자 및 HBx 단백질에 표지되는 HA 유전자를 포함하는 벡터 pTetX(Kim et. al.,J. Bio. Chem., 273, 381-385) 및 HBx 유전자 및 HA 유전자를 포함하지 않는 벡터 pTRE(Clontech사, 미국)를 각각 인간 간 세포주인 창 세포(Chang cell, ATCC사, 미국)에 인산 칼슘 방법(profection mammalian transfection system, Promega사, 미국)에 따라 형질도입하였다.
형질도입시킨 창 세포 1x106개를 37℃, CO2배양기에서 100mm 배양 플레이트에 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 포함하는 배양액을 사용하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포들을 인산 완충 용액(Phosphate Buffer Saline, PBS)으로 2회 세척하고, 스크래이퍼로 긁어내어 수획하였다. 수획한 세포들을 100㎕의 세포 용해 용액(60mM Tris-Cl(pH 6.8), 1% SDS, 10% glycerol, 0.01% bromophenolblue)을 처리하여 용해시켰다.
이의 상등액인 세포 단백질 50㎎을 5배의 램리(Laemli) 완충 용액(60mM Tris-Cl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue)에 희석한 후, 5분 동안 중탕하고 SDS-폴리아크릴아미드 젤로 전기영동하였다. 분리 젤의 조성은 12% 아크릴아미드, 0.375M Tris-Cl(pH 8.8), 0.1% SDS이고, 쌓임 젤의 조성은 5% 아크릴아미드, 0.125M Tris-Cl(pH 6.8), 0.1% SDS이었다.
전기영동한 후, 전기적인 방법으로 폴리비닐이덴 다이플루오라이드 막(Polyvinylidene difluoride, PVDF, Bio.Rad사, 미국)에 옮겼는데, 옮기는 조건은 전이 완충 용액(25mM Tris, 192mM glycine, 20% v/v methanol, pH 8.3)에서 100V의 전압을 1시간 동안 적용하였다. 옮긴 후 웨스턴 블럿팅에 있어서 비특이적인 반응을 줄이기 위하여, 5% 탈지분유(skim milk) 용액으로 1시간 동안 막을 차단시켰다.
HA로 표지된 HBx 단백질 발현을 확인하기 위하여, 0.1% 트윈 20이 포함된 Tris 완충 용액에 1:1,000의 비율로 희석한 항 HA 1차 단일클론항체(clontech사, 미국)과 하루 동안 반응시켰다. 그 반응물을 Tris 완충 용액으로 3회 세척하고, Tris 완충 용액에 1:1,000으로 희석한 항 토끼 이차 항체(Bio.Rad사, 미국)와 1시간 동안 반응시켰다. 다시 이 반응물을 0.1% 트윈 20이 포함된 Tris 완충 용액으로 3회 세척한 후, 화학적 발광반응(Enhanced chemiluminescent(ECL)) 키트(Amersham사, 미국)를 이용하여, 발광반응을 시키고 엑스선 필름(Kodak사, 독일)에 감광하였다.
그 결과, HBx 유전자를 포함하는 벡터로 형질도입시킨 창 세포에서는 HBx 단백질로 확인되는 밴드를 보임에 반해, HBx 유전자를 포함하지 않는 벡터로 형질도입시킨 창 세포는 어떠한 밴드도 보이지 않았다(도 1).
이에 따라, HBx 단백질을 영구적으로 발현하는 인간 간 세포주를 확립하여 이를 Chang X31이라 명명하고, HBx 유전자를 포함하지 않는 벡터만 도입된 대조 세포주를 Chang V9이라 명명하였다.
<실시예 2> 간 세포주의 완전한 세포사멸에 이르는 조건 확립
본 발명에서는 활성 산소 유도제인 메나다이온 및 NF-κB의 활성 억제제인 설파살라진을 사용하여 완전한 세포사멸로 이르는 조건을 확립하였다.
Chang X31 세포주와 Chang V9 세포주의 성장속도 차이를 감안하여 6-웰 플래이트에 Chang X31 세포주는 1X105개, Chang V9 세포주는 0.8X105개의 세포를 각각 접종하였다. 세포 접종 48시간 후에 1, 10, 100ng의 TNF-α(Sigma사, 미국), 5, 10, 15μM의 메나다이온(Sigma사, 미국), 및 0.1, 0.5, 1mM의 설파살라진(Sigma사, 미국)을 각각을 처리한 뒤, 24시간 후에 세포사멸 현상을 관찰하였다(도 2).
그 결과, TNF-α를 처리한 경우에는 100ng의 높은 농도에서도 세포사멸은 관찰되지 않았다. 이는 TNF-α가 활성 산소를 증가시킬 뿐만 아니라 전사인자 NF-κB의 활성도 증가시키는데 기인하기 때문이다. 또한 메나다이온의 경우에는 15μM을 처리했을 때 세포사멸이 일어났지만, 이 경우에도 HBx 단백질을 발현하는 Chang X31에서 뿐만 아니라 HBx을 발현하지 않는 Chang V9에서도 세포사멸이 있어났다. 마지막으로, 설파살라진만을 처리한 경우에도 세포사멸은 관찰되지 않았다.
따라서 메나다이온 및 설파살라진을 동시에 처리하여 HBx 단백질을 발현하는 세포에서만 완전한 세포사멸을 유도하는 방법을 확립하였다. 5, 10, 15μM의 메나다이온(Sigma사, 미국) 및 0.1, 0.5, 1mM의 설파살라진(Sigma사, 미국)을 동시에 처리한 뒤, 24시간 후에 세포사멸 현상을 관찰하였다(도 3).
그 결과, 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 동시에 처리한 실험군에서Chang V9 세포주의 세포사멸은 유도되지 않는 반면, Chang X31 세포주는 100% 세포사멸이 유도되는 것을 관찰하였다(도 3의 9).
6-웰 플래이트에 Chang X31 세포주는 1X105개, Chang V9 세포주는 0.8X105개의 세포를 각각 접종하였다. 세포 접종 48시간 후에 각각 7μM 메타다이온 및 1mM 설파살라진, 및 10μM의 메나다이온 및 1mM의 설파살라진을 동시에 처리하고, 이 후 48시간 간격으로 새 약물 배양액으로 교환해 주면서 세포 변화를 지속적으로 관찰하였다.
그 결과, 10μM의 메나다이온 및 1mM의 설파살라진을 처리한 실험군의 Chang X31 세포주에서 약 24시간 후 100% 세포사멸이 유도되었고, 약 120시간 후 Chang V9 세포주에서도 50% 이상의 세포사멸 현상이 관찰되었다(도 4). 반면, 7μM의 메나다이온 및 1mM의 설파살라진을 처리한 실험군의 Chang X31 세포주에서는 48시간 후 세포사멸이 약 5 내지 10%로 관찰되다가, 96시간 후에 세포의 형태학적 모양 변화가 관찰되면서 세포사멸이 약 10 내지 20%로 점차 증가되었으며, 완전한 세포사멸이 유도되기까지는 약 120시간이 소요되었고, Chang V9 세포주의 세포사멸 현상은 관찰되지 않았다(도 4).
따라서, Chang X31 세포주에서 단기간(24시간 이내)에 세포사멸을 유도하기 위해서는 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하고, 장시간(120시간 이상)에 걸쳐 세포사멸을 유도하기 위해서는 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하는 세포사멸 조건을 확립하였다.
<실시예 3> 인간 간 세포주(Chang X31)의 완전한 세포사멸의 형태학적 확인
HBx 발현 인간 간 세포주(Chang X31)의 세포사멸을 형태학적으로 확인하기 위한 방법으로 세포핵 관찰이 가능한 DAPI 염색을 수행하였다. Chang X31과 Chang V9 세포주를 각각 6-웰 플래이트에 접종하고 48시간 후에 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하였다. 24시간 후에 세포를 고정액(1% 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드)에 5분간 방치한 후 인산 완충 용액으로 2회 세척하고 인산 완충 용액에 1mg/㎖로 희석된 DAPI 염색액(Sigma사, 미국)을 첨가하였다. 이 후 세포는 암실상태를 유지시켜 주면서 실온에서 5시간 동안 DAPI 염색을 진행하였다. 형광 현미경을 통해 세포핵의 DAPI 염색 관찰 결과 Chang V9 세포주에서와 달리 Chang X31에서만 세포사멸시 전형적으로 관찰되는 세포핵 응축, 쪼그라듬, 알알이 깨짐 (fragmentation) 현상이 관찰되었다(도 5).
<실시예 4> HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 물질의 탐색
Chang X31에 항산화제인 글루타티온(Gluthathione, GSH)(Sigma사, 미국) 0.2M 및 NAC(N-아세틸-L-시스테인)(Sigma사, 미국) 20mM을 처리한 후, 상기 실시예 2에서 확립된 완전한 세포사멸을 유도하기 위해 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하였다.
그 결과 글루타티온을 처리한 경우에는 세포사멸이 완전히 억제되었고, NAC를 처리한 경우에는 세포사멸이 부분적으로 억제되었으므로(도 6), 이 물질들은 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 것으로 확인되었다. 또한 상기 결과는 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸에 이르게 하는 주원인이 활성 산소라는 사실도 뒷받침한다.
그러나 Chang X31에 단백질 합성 억제제인 스타우로스포린(Staurosporine)(Sigma사, 미국) 0.5mM를 처리한 후, 10μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리한 경우에는 세포사멸이 억제되지 않았다(도 6).
이를 통해 글루타티온 및 NAC와 같은 항산화제는 간 세포주의 세포사멸을 억제하는 활성을 가지나, 스타우로스포린와 같은 단백질 합성 억제제는 세포사멸을 억제하는 활성을 가지지 않음을 확인하였다.
따라서 본 발명에서 확립한 완전한 세포사멸 억제 조건은 상기와 같이 세포사멸 억제 활성을 갖는 물질인지 확인하는 시스템에 이용될 수 있다.
<실시예 5> HBx 단백질을 발현하는 세포의 세포사멸을 억제하는 유전자의 탐색
(1) 레트로바이러스 cDNA 라이브러리 벡터의 이용가능성의 확인
Chang X31 세포주의 세포사멸을 억제하는 유전자를 탐색하는 데에 레트로바이러스 cDNA 라이브리리 벡터를 이용할 수 있는지 확인하기 위하여 레트로바이러스 라이브러리의 역가를 조사하였다. 이를 위하여 lacZ 유전자를 발현하는 리포터 레트로바이러스 벡터인 MFG/lacZ/puro(Oh et al.,Mol. Cells 11(2), 192-197, 2001, 한양대 의대 미생물학교실 정희용 박사로부터 입수) 이용하여 다음과 같은 실험하였다.
6-웰 플래이트에 레트로바이러스 포장 세포주 GP293 세포(clontech사, 미국) 8X105개를 접종한 후, 24시간 후 리포펙타민 플러스(lipofectamine Plus,invitrogen사, 미국)를 사용하여 MFG/LacZ/puro 0.5㎍과 소포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 외피 당단백질 발현벡터(pHCMV-G)(Aiken C.,J. Virol. 71(8), 5871-5877, 1997) 0.5㎍을 형질도입시켰다.
형질도입 48시간 후에 바이러스가 포함된 세포 배양액을 수거하여, 하루 전에 2X105개 접종한 Chang X31 세포주에 감염시켰다. 37℃에서 48시간 배양한 후, lacZ 유전자가 감염된 Chang X31 세포를 고정액(1% 포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드)으로 5분간 방치하고 인산 완충 용액으로 2회 세척하여 고정액을 제거한 후, 염색액(4mM potassium ferrocyanide, 2mM 염화마그네슘, 0.625mg/㎖ X-gal)을 넣어주고 37℃에서 하루동안 염색하였다.
레트로바이러스 라이브러리의 Chang X31 세포주에 대한 역가는 필드(field)가 그려진 플레이트에서 한 필드에 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)에 염색된 세포수를 센 후, 전체 lacZ 유전자의 감염된 세포수를 결정하였다. Chang X31 세포주를 대상 세포주로 사용할 때 1X104cfu/㎖ 이상 역가의 재조합 레트로바이러스가 감염됨을 확인하였다(도 7).
이는 Chang X31 세포주를 대상으로 레트로바이러스 cDNA 라이브러리 벡터를 이용한 유전자 탐색 시스템을 사용할 수 있음을 의미한다.
(2) 발현벡터를 이용한 유전자 탐색
포유류 발현 벡터인 pCMV/myg/cyto(Invitrogen 사, 미국)에 항산화 유전자인 글루타티온 페록시다아제(Glutathion peroxidase), 페록시레독신 II(peroxiredoxinII), 및 페록시레독신 III(peroxiredoxin III)를 각각 클로닝 한 DNA(한국 생명공학연구원 권기선 박사로부터 입수)를 Chang X31에서 발현시킨 후, 세포사멸 조건을 유도했을 때 극복할 수 있는지 여부를 확인하였다.
Chang X31에 각각의 항산화 유전자 글루타티온 페록시다아제, 페록시레독신 II, 페록시레독신 III를 각각 발현하고 있는 벡터 1㎍씩을 리포펙타민 플러스(Invitrogen사, 미국)를 이용하여 형질도입한 뒤, 48시간 후 형질도입한 세포를 수합하여 1X105세포수로 접종하고, 2일 후에 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하였다. 대조군은 항산화 유전자를 도입시키지 않은 Chang X31에 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리하여 준비하였다.
그 결과, 약물처리 120시간 후 페록시레독신 II 발현벡터를 도입한 세포주에서만 세포사멸 억제 현상을 보였다(도 8a).
이러한 결과는 페록시레독신 II 발현 벡터를 제오신(zeocin)을 선별 유전자로 갖는 벡터(pVgRXR)(Invitrogen사, 미국)와 동시에 유전자 도입(cotransfection) 시킨 후, 제오신 200 ㎎/㎖에서 약 2주간 선별 과정을 거쳐서 얻은 페록시레독신 II 클론을 이용했을 때에도 동일하였다. 상기에서 수득된 페록시레독신 II 클론을 클론 1 및 2라고 하였다.
클론 1 및 2의 세포주에 7μM 메나다이온 및 1mM 설파살라진을 처리한 후 120시간이 경과하였을 때, 클론 1의 세포주는 약 20%의 세포사멸 억제 현상을, 클론 2의 세포주는 약 40%의 세포사멸 억제 현상을 보였다(도 8b).
또한 페록시레독신 II 유전자가 도입되어 세포사멸 억제 효과를 나타내는 세포군에서 페록시레독신 II 단백질이 과발현되는 것을 웨스턴 블럿팅으로 확인하였다(도 9). 대조군으로 상기 유전자를 형질도입시키지 않은 Chang X31 세포주를 사용하였다.
상기 방법으로 선별된 유전자는 바이러스성 간염의 증상을 약화시키거나 간암세포 발생에 기여하는 유전자 후보가 되어 간염 및 간암의 예방 및 치료에 이용될 수 있을 것이다.
본 발명은 세포배양 상에서 B형 간염 바이러스 감염된 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법에 관한 것으로, 이는 나아가 간세포의 세포사멸을 억제하는 약물 및 유전자를 탐색할 수 있는 시스템으로 간염 치료제 및 유전자 치료제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS) 유도제 및 NF-κB(nuclear factor kappa B) 억제제를 처리하는 것을 포함하는 HBx 단백질을 발현하는 간세포의 완전한 세포사멸을 유도시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    HBx 단백질을 발현하는 간세포가 세포주 Chang X31인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    활성 산소 유도제가 메나다이온(menadione) 및 NF-κB 억제제가 설파살라진(sulfasalazine)인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    메나다이온 7 내지 10μM 및 설파살라진 0.8 내지 1.2mM을 처리하는 방법.
  5. 하기 단계를 포함하는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 물질을 탐색하는 방법:
    1) HBx 단백질을 발현하는 간세포의 배양 배지에 활성 산소 유도제와 NF-κB 억제제, 및 세포사멸 억제 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    2) 세포사멸의 억제 여부를 확인하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서,
    단계 1)에서 활성 산소 유도제가 메나다이온(menadione) 및 NF-κB 억제제가 설파살라진(sulfasalazine)인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    메나다이온 7 내지 10μM 및 설파살라진 0.8 내지 1.2mM을 처리하는 방법.
  8. 하기 단계를 포함하는, HBx 단백질을 발현하는 간세포의 세포사멸을 억제하는 유전자를 탐색하는 방법:
    1) HBx 단백질을 발현하는 간세포에 후보 유전자를 도입하는 단계;
    2) 1)에서 얻은 세포의 배양 배지에 활성 산소 유도제 및 NF-κB 억제제를 처리하는 단계; 및
    3) 세포사멸의 억제 여부를 확인하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서,
    단계 1)에서 레트로바이러스 cDNA 라이브러리를 이용하여 유전자를 도입하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    단계 1)에서 발현 벡터를 이용하여 유전자를 도입하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    단계 2)에서 활성 산소 유도제가 메나다이온(menadione) 및 NF-κB 억제제가 설파살라진(sulfasalazine)인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    메나다이온 7 내지 10μM 및 설파살라진 0.8 내지 1.2mM을 처리하는 방법.
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