KR101054461B1 - ＨＢｘ 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스를 이용한 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스를 이용한 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 구체적으로 B형 간염바이러스(Hepatitis B Virus)의 유전자 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 B형 간염 바이러스 X(Hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스(HBxmet 마우스)에서 당뇨병이 유도되므로 이를 이용하여 당뇨병 치료제 또는 예방제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HBxmet 마우스는 B형 간염에 의한 간암 발생과 당대사 이상과의 상관관계, 및 당뇨병 치료제 또는 예방제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
인간 B형 간염바이러스 X 단백질, 당뇨병 동물 모델.

Description

ＨＢｘ 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스를 이용한 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법{Screening method for agent for prevention or treatment of diabetes using homozygote mouse transfected with HBx gene}
본 발명은 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스를 이용한 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B형 간염바이러스(Hepatitis B Virus)의 유전자 중 주된 간암 유발 인자로 알려진 B형 간염 바이러스 X(Hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스(HBxmet 마우스)에서 당뇨병이 유도되므로 이를 이용하여 당뇨병 치료제 또는 예방제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes Mellitus)은 인체 내 췌장 베타-세포의 인슐린 분비능 부족과 인슐린 이용 기관 및 장기의 수용체(receptor) 고장으로 인한 혈중 포도당 농도(blood glucose concentration)의 조절 실패로 당의 평형상태(homeostasis)가 파 괴됨으로 유발되며, 고혈압, 신장병, 망막증 및 면역적 방어력 부족으로 인한 여러 합병증을 유발한다. 일반적으로 유년기 자가면역(autoimmune disease)에 의한 베타-세포의 파괴로 유발되는 제 1형과 40세 이후 췌장 기능의 노화(ageing), 비만(obesity), 인슐린 수용체(insulin receptor) 및 운반체(glucose transporter)의 결함으로 유발되는 제 2형으로 구분된다.
당뇨병은 현대 의학이 안고 있는 해결해야 할 가장 큰 문제 중의 하나이고 특히 제 2형 당뇨병은 인슐린 저항성 및 인슐린 분비 결손 등 유전적 문제뿐만 아니라 비만, 운동부족 및 노화 등 여러 요인으로 성인에서 발병되기 때문에 제 2형 또는 성인형 당뇨병으로 알려져 인류의 수명연장에 따라 해를 더할수록 그 발병율이 크게 증가하는 추세에 있다(Jameson, J. L., Diabetes Care, 21(Suppl.1): S5-S19, 1998; Pickup, J. C. & Crook, M. A., Diabetologia, 41: 1241-1248, 1998; Liu, K. et al., J. Med. Chem., 43: 3487-3494, 2000). 특히 2010년에는 약 2억 3천만명이 당뇨병으로 분류될 전망이어서 여러 원인에 따른 당뇨병 치료제의 개발이 절실히 요구된다(Betteridge, D. J., New Engl. J. Med., 342: 1533, 2000).
최근에는 C형 간염 바이러스(HCV)가 간 섬유화증이나 제 2형 당뇨병과 밀접한 관련이 있음이 밝혀지고 있다. 또한, C형 간염 바이러스는 체내에서 인슐린 저항성을 일으켜 당뇨 질환을 유발할 수 있다는 사실을 보고하고 있다(Shintani Y, et. al., Gastroenterology, March, 126(3), 840-848, 2004). 그러나 B형 간염 바이러스와 당뇨와의 관계는 밝혀진 예가 없다.
본 발명자들은 대한민국 등록특허 제 10-0861534호에서 B형 간염 바이러스 X(Hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 동족접합체 마우스가 비만 증상을 나타내어 비만 모델 동물로 이용할 수 있음을 보고한 바 있다. 그러나, HBx 유전자로 형질전환된 동족접합체 마우스의 유전적 배경을 변경할 경우 당뇨병 증상을 나타낸다는 보고는 전무하다.
이에, 본 발명자는 B형 간염바이러스(Hepatitis B Virus)의 유전자 중 주된 간암 유발인자로 알려진 HBx 유전자로 형질전환된 마우스의 유전적 배경을 근교계동물(Inbred strain: C57BL/6)로 변경한 경우 비만증상 없이도 당대사 이상 증상이 있음을 확인하고, 이를 이용하여 당뇨병 치료제 또는 예방제를 스크리닝할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는 당뇨병 모델 동물과 이를 이용한 당뇨병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 마우스와 근교계동물인 정상마우스(Inbred strain: C57BL/6)를 교배하여 이형접합체 마우스를 제조한 후 상기 이형접합체 마우스 간의 교배에 의해 제조되는, HBx 단백질이 과발현되고 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는, HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 전신 또는 일부에 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여하는 단계;
2) 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여한 마우스에서 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 다양한 지표 값을 측정하는 단계; 및
3) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 지표 값을 유의하게 정상적으로 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 근교계동물(Inbred stain)의 유전적 배경을 지닌 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스는 복부 지방 감소, 체중 감소, 간조직의 증가, 간의 지방세포 증가, 혈중 당뇨관련 성분 증가, 혈중 포도당 수준의 증가, 혈중 인슐린 수준 감소, 혈중 글루카곤 수준 감소, 및 혈중 글리카곤 수준 감소 등의 다양한 당대사 이상 증상을 나타냄으로써 상기 마우스를 이용하여 B형 간염에 의한 간암 발생과 당대사 이상과의 상관관계 연구, 및 당뇨병 치료제 또는 예방제 개발에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1) 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 마우스와 근교계동물인 정상마우스(Inbred strain: C57BL/6)를 교배하여 이형접합체 마우스를 제조한 후 상기 이형접합체 마우스 간의 교배에 의해 제조되는, HBx 단백질이 과발현되고 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는, HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 전신 또는 일부에 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여하는 단계;
2) 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여한 마우스에서 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 해부학적 또는 병리학적 지표 값을 측정하는 단계; 및
3) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 해부학적 또는 병리학적 지표 값을 유의하게 정상적으로 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 HBxmet 마우스는 상기와 같은 방법에 의해 제조되는 것을 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명자들에 의해 2007년 7월 27일자로 수탁된 수정란(기탁번호: KCTC 11156BP)으로부터 발생된 마우스를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 HBxmet 마우스는 HBx 유전자를 포함하는 벡터(도 1 참조)를 이용하여, 1세포기 수정란에 미세주입하여 제조한 BDF1(C57BL/6 X DBA/2) 형질전환 이형접합체(heterozygote) 마우스(Yu DY, et, al., J Hepatol, 31, 123-32, 1999)로부터 유래된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 상기 BDF1 형질전환 이형접합체 마우스를 근교계동물(Inbred strain: C57BL/6)의 유전적 배경을 지니게 하기 위해 정상 마우스(C57BL/6)와 교배시켜 근교계동물(inbred) 마우스로 제조하였다.
상기 BDF1 이형접합체 마우스를 정상 마우스와 최소 25대 이상의 교배로 제조된 근교계(inbred strain) 마우스 중에서 HBx 유전자로 형질전환된 이형접합 체(heterozygote) 마우스를 선별한 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 HBx 유전자로 형질전환된 이형접합체 마우스의 선별 방법으로는 마우스의 꼬리 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR 지노타이핑(genotyping)으로 확인하는 방법이 있으나 이에 한정되지 않으며, 수득한 동종접합체 마우스의 조직에서 염색체 DNA를 추출하여 서던 혼성화 분석, 해부시, 조직 및 기관 이상의 관찰 또는 조직에서 RNA를 추출하여 노던 블랏 분석에 의한 유전자 발현 패턴의 분석으로 확인할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 혈액을 채취하여 혈액검사 및 혈청 생화학적 검사를 하는 일도 가능하다.
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 선별된 HBx 유전자로 형질전환된 이형접합체 마우스끼리 교배하여 동종접합체(homozygote) 마우스를 제조하였다. 상기 동종접합체 마우스는 PCR 지노타이핑(genotyping)에 의해 확인하였다(도 2 참조).
상기와 같은 방법으로 제조된 동종접합체 마우스는 HBx 유전자의 상류측에 존재하는 인핸서 1과 프로모터의 전사 조절 기능에 의해 HBx 유전자를 발현시키도록 발현 벡터를 설계되었으므로, HBx 단백질의 mRNA가 간, 비장 및 정소 등의 조직에 발현되었고, 특히 HBx 단백질이 간에 발현됨에 따라 간 지방증이 유도되고, 당대사 이상이 형성됨에 따라 당뇨병 초기 현상을 발견하였다.
따라서 본 발명의 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스는 당대사 이상 증상을 나타내므로, 당뇨병, 특히 B형 간염에 의한 당뇨 및 당대사 이상의 메커니즘을 연구할 수 있는 당뇨병 모델동물로서 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 이에 , 본 발명자들은 상기 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스를 "HBxmet 마우스"라고 명명하였다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 'HBxmet 마우스의 일부'는 HBxmet 마우스의 조직, 장기 또는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되어진 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조직 또는 장기의 경우는 HBxmet 마우스에서 적출한 것도 포함한다. 세포의 경우에는 혈액 세포, 간 세포 또는 지방 세포 등을 예시할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 후보 물질로는 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고, 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다.
상기 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 상기 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용될 수 있다.
상기 후보 물질을 투여하는 방법으로는 경구투여, 정맥주사, 스와빙(swabbing), 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등이 이용될 수 있으나 이에 한 정되지 않으며, 실험 동물의 증상 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
상기 후보 물질을 본 발명의 HBxmet 마우스의 일부 중, 분리한 세포에 투여하고자 할 경우에는 세포의 배양액에 후보 물질을 투여할 수 있다. 해당 후보 물질이 단백질인 경우에는 예를 들면, 해당 단백질을 코드하는 DNA를 포함한 벡터를 HBxmet 마우스로부터 분리된 세포로 도입하는 것도 가능하다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 해부학적 또는 병리학적 지표 값은 복부 지방 감소, 체중 감소, 간조직의 증가 및 간의 지방세포 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 후보 물질을 HBxmet 마우스로부터 분리한 세포에 투여한 경우에 상기 지표 값은 세포 표현형에 상보되는 값이며, 특별히 제한은 없지만, 혈액 세포라면 혈액 세포의 정상화, 간 세포라면 기능 정상화 또는 지방 세포라면 활성화 이상을 수정하는 것 등을 예로 들 수 있다. 또한, 해당 세포 표현형의 상보에는 완전한 상보뿐만이 아니라 불완전한 상보도 포함된다.
본 발명자들은 HBxmet 마우스와 정상 마우스의 해부학적 관찰을 수행한 결과, 정상 마우스(C57BL/6)에 비하여 복부 지방이 감소되었고, 간조직이 비대해진 것을 확인하였다(표 1 및 도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 HBxmet 마우스와 정상 마우스의 체중을 측정한 결과, HBxmet 마우스가 정상마우스에 비해 6개월령 이상일때 체중이 감소하였음을 확인하였다(도 4 참조).
아울러, 본 발명자들은 HBxmet 마우스와 정상 마우스의 병리학적 관찰을 수행하기 위해, 상기 각 마우스를 개복하여 관찰한 결과, 정상마우스에 비하여 HBxmet 마우스의 간에서 지방 세포가 많아진 것을 확인하였다(표 1 및 도 5 참조).
따라서 상기와 같은 지표 값을 후보 물질을 투여한 HBxmet 마우스 및 후보 물질을 투여하지 않은 대조군에서 각각 측정하여 비교한 결과, 지표에 대하여 효과를 보이는 물질 또는 HBxmet 마우스의 표현형을 상보하는 활성을 갖는 물질을 선별함으로써 당뇨병 치료제 또는 예방제를 스크리닝할 수 있다. 상기 HBxmet 마우스의 표현형의 상보에는 완전한 상보뿐만 아니라 불완전한 상보도 포함된다.
상기와 같은 방법으로 스크리닝된 당뇨병 치료제 또는 예방제는 당뇨병, 특히 B형 간염 환자에서의 당뇨병 예방 및 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환 된 마우스와 근교계동물인 정상마우스(Inbred strain: C57BL/6)를 교배하여 이형접합체 마우스를 제조한 후 상기 이형접합체 마우스 간의 교배에 의해 제조되는, HBx 단백질이 과발현되고 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는, HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 전신 또는 일부에 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여하는 단계;
2) 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여한 마우스에서 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 혈액학적 또는 조직학적 지표 값을 측정하는 단계; 및
3) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 혈액학적 또는 조직학적 지표 값을 유의하게 정상적으로 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 HBxmet 마우스는 상기와 같은 방법에 의해 제조되는 것을 사용하는 것이 바람직하고, 본 발명자들에 의해 2007년 7월 27일자로 수탁된 수정란(기탁번호: KCTC 11156BP)으로부터 발생된 마우스를 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 'HBxmet 마우스의 일부'는 HBxmet 마우스의 조직, 장기 또는 세포로 이루어진 군으로부터 선택되어진 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조직 또는 장기의 경우는 HBxmet 마우스에서 적출한 것도 포함한다. 세포의 경우에는 혈액 세포, 간 세포 또는 지방 세포 등을 예시할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 후보 물질로는 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장 등이 있고, 이러한 화합물들은 신규 화합물이어도 되고, 널리 알려진 화합물이어도 된다. 상기 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)의 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 혈액학적 또는 조직학적 지표 값은 혈중 당뇨관련 성분 증가, 혈중 포도당 수준의 증가, 혈중 인슐린 수준 감소, 혈중 글루카곤 수준 감소 및 간내 글리카곤 수준 감소로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 상기 혈중 당뇨관련 성분은 혈중 트리글리세리드, 혈중 콜레스테롤, 혈중 유리지방산, ALT, AST, 혈중 HDL, 및 혈중 LDL로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 혈중 당뇨 관련 성분의 변화를 관찰하기 위해, HBxmet 마우스와 정상마우스가 6개월령일때 혈액을 채취하여 분석하였다. 그 결과, HBxmet 마우스는 트리글리세리드(triglyceride), 콜레스테롤 및 유리지방산(free fatty acid) 수준이 정상마우스에 비해 유의있는 증가를 나타내었으며, 간 손상의 지표인 AST(alanine transaminase) 및 ALT(asparate aminotrasferase)이 정상마우스에 비 해 유의있는 증가를 나타내었다. 또한, HBxmet 마우스는 저밀도 지단백(low-density lipoprotein; LDL) 및 고밀도 지단백질(high-density lipoprotein; HDL) 수준이 정상마우스에 비해 유의적인 차이를 나타내었다(표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 당뇨와 당대사 이상을 정확하게 진단하기 위해, HBxmet 마우스와 정상마우스가 6개월령일때 당부하검사(glucose tolerance test)를 수행하였다. 그 결과, HBxmet 마우스가 정상마우스에 비해 과혈당증이 일어났음을 알 수 있었다(도 8 참조).
또한, 본 발명자들은 당대사 이상 증상을 확인하기 위해, HBxmet 마우스와 정상마우스가 6개월령일때 혈중 포도당 농도, 혈중 인슐린, 혈중 글루카곤 및 간 조직내 글리카곤 농도를 분석하였다. 상기 글루카곤(glucagon)은 혈액 중의 당의 농도를 올리는 역할을 하는 호르몬으로서 이자에서 분비되는 인슐린과 반대작용을 하며, 인슐린과 함께 혈당량을 일정하게 유지하는 역할을 한다. 상기 글리카곤(glycogen)은 간 조직의 당의 농도를 올리는 역할을 하는 호르몬으로서 간에 저장되어 있던 글루코겐이 분해되어 혈액으로 포도당(glucose)을 방출하는 역할을 한다. 상기 측정 결과, 혈중 포도당 농도는 HBxmet 마우스에서 정상마우스에 비해 증가되었고, 혈중 인슐린 농도는 HBxmet 마우스에서 정상마우스에 비해 공복시에는 유의성있는 감소를 나타내었나, 사료급여시 감소되는 경향을 나타내었다. 혈중 글루 카곤 농도 및 간 조직 내 글리카곤 농도는 HBxmet 마우스에서 정상마우스에 비해 감소되는 경향을 나타내었다(도 7, 도 9 내지 도 11 참조).
아울러, 본 발명자들은 간 조직에서 글리카곤 농도를 확인하기 위해, 특수염색인 페리오딕 에시드 쉬프(Periodic Acid-Schiff) 염색하여 간의 조직학적 변화를 확인하였다. 그 결과, 간 조직 내 글리카곤 농도는 HBxmet 마우스에서 정상마우스에 비해 감소되어 있음을 확인하였다(도 12 참조).
따라서 상기와 같은 지표 값을 후보 물질을 투여한 HBxmet 마우스 및 후보 물질을 투여하지 않은 대조군에서 각각 측정하여 비교한 결과, 지표에 대하여 효과를 보이는 물질 또는 HBxmet 마우스의 표현형을 상보하는 활성을 갖는 물질을 선별함으로써 당뇨병 치료제 또는 예방제를 스크리닝할 수 있다. 상기 HBxmet 마우스의 표현형의 상보에는 완전한 상보뿐만 아니라 불완전한 상보도 포함된다.
상기와 같은 방법으로 스크리닝된 당뇨병 치료제 또는 예방제는 당뇨병, 특히 B형 간염 환자에서의 당뇨병 예방 및 치료에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> HBx met 마우스의 제조
본 발명자들은 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자를 포함하는 벡터(도 1)에 의해 형질전환된 이형접합체(heterozygote) 마우스(Yu DY, et, al., J Hepatol, 31, 123-32, 1999)를 이용하여 하기와 같은 방법으로 본 발명의 HBxmet 마우스를 제조하였다.
먼저, HBx 유전자를 포함하는 벡터를 1세포기 수정란에 미세주입하여 제조한 BDF1(C57BL/6 × DBA/2) 형질전환 마우스와 정상마우스인 근교계동물(Inbred strain: C57BL/6 (KOATECH, KOREA))과 최소 25대 이상을 교배하여 근교계동물 마우스로 제조하였다. 상기 제조된 HBx 형질전환 마우스는 이형접합체(heterozygote)이므로 HBx 형질전환 마우스끼리 교배하여 동종접합체(homozygote)를 제조하여 하기의 실시예에 이용하였다.
동종접합체(homozygote)의 형질전환 여부를 확인하기 위하여 교배된 동종접합체(homozygote) 마우스의 꼬리를 잘라 게놈(genomic) DNA를 추출하였다. 추출한 게놈(genomic) DNA를 주형으로 하고, 프라이머(primer) 쌍[센스 프라이머: 5'-TTCTCATCTGCCGGTCCGTG-3'(서열번호 1) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGGTCAATGTCCATGCCCCA-3'(서열번호 2)]를 제작하여 HBx 동종접합체를 PCR 지노타이핑(genotyping)으로 확인하였다(도 2).
상기와 같이 하여 제조된 동종접합체 마우스를 "HBxmet 마우스"라고 명명하고 하기의 실시예에서는 수컷 마우스만을 사용하였다.
또한, 본 발명자들은 HBxmet 마우스의 수정란을 2007년 7월 27일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC 11156BP).
<실험예 1> HBx met 마우스의 해부학적 관찰
상기 <실시예 1>에서 제조된 HBxmet 마우스 및 본 발명의 실시예에서 이용된 마우스는 SPF 베리어 시스템(SPF barrier system)에서 온도 22 ± 1℃, 상대습도 55 ± 10%, 환기횟수 10 ~ 20회/시간, 형광등 조명 12시간/하루(오전 8시 점등 ~ 오후 8시 소등)으로 사육하였다.
당뇨 동물 모델인 HBxmet 마우스가 6개월령 일때 정상마우스(C57BL/6)와 해부학적 관찰을 하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 HBxmet 마우스에서 복부의 지방이 감소되었고, 간 조직 또한 비교 관찰하였을 때 대조군인 정상마우스에 비해 HBxmet 마우스의 간이 비대하였다(도 5).
<실험예 2> HBx met 마우스의 몸무게 측정
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C57BL/6)를 생후 4주령부터 6개월령까지 체중 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 6개월령 이상부터는 HBxmet 마우스가 정상마우스에 비해 무게가 감소하였다(도 4).
<실험예 3> HBx met 마우스의 병리학적 관찰
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C57BL/6)의 간 조직을 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 방법으로 염색하여 지방 조직의 분포를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 보는 바와 같이 정상마우스에 비하여 HBxmet 마우스의 간에서 지방 세포가 커진 것으로 나타났다(표 1).
HBx met 마우스 간의 조직 구조

3개월령 6개월령 12개월령 18개월령
wild
(n=15)		 HBXmet
(n=27)		 wild
(n=20)		 HBXmet
(n=20)		 wild
(n=13)		 HBXmet
(n=15)		 wild
(n=9)		 HBXmet
(n=16)
미세수포성(microvesicular) 지방 변화 0(0%) 11(41%) 2(10%) 16(80%) 4(31%) 15(100%) 6(67%) 15(100%)
거대수포
성(macrov
esicular)
지방 변화		 0(0%) 0(0%) 0(0%) 11(55%) 0(0%) 15(100%) 3(33%) 10(63%)
염증(inflammation) 0(0%) 9(33%) 1(5%) 6(30%) 1(7.7%) 3(20%) 4(44%) 4(25%)
괴사(necrosis) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) 1(7.7%) 1(6.7%) 0(0%) 1(6.3%)
이형성(dyplastic) 변화 0(0%) 24(89%) 0(0%) 19(95%) 0(0%) 15(100%) 0(0%) 16(100%)
<실험예 4> HBx met 마우스의 혈액 중에서 당뇨 관련 성분의 변화
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)가 6개월령일때 Modular Analytics P800 analyzer(Roche Diagnostics, Germany)의 자동화 장비로 동일 회사의 전용 시약을 이용하여 자동화 장비 회사의 매뉴얼 측정 방법으로 혈액을 분석하였다. 분석 결과는 평균 ± SEM(standard error of the mean)으로 나타내었으며, 통계 처리는 Student's t test를 이용하였다.
그 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이 HBxmet 마우스에서는 트리글리세리드(triglyceride), 콜레스테롤 및 유리지방산(FFA)수준은 정상마우스에 비해 유의하게 증가하였다. 또한, 저밀도 지단백(low-density lipoprotein; LDL)과 고밀도 지단백(high-density lipoprotein; HDL) 수준은 정상마우스에 유의한 차이가 있었다(표 2). 표 2에서 *는 p<0.05, ** p<0.01 와 *** p<0.001를 의미한다.
정상마우스 및 HBx met 마우스의 혈청 분석
요인 정상 마우스 HBxmet 마우스
혈중 트리글리세리드 (mg/dl) 73 ± 1.7 116 ± 2.1***
혈중 콜레스테롤 (mg/dl) 119 ± 9.9 199 ± 13.3***
혈중 유리지방산 (mmol/l) 1283 ± 126 1592 ± 106***
ALT (U/l) 42 ± 3.5 60 ± 4.4**
AST (U/l) 68 ± 2.0 82 ± 6.0*
혈중 HDL (mg/dl) 74 ± 4 89 ± 7**
혈중 LDL (mg/dl) 7 ± 2 12 ± 3*
<실험예 5> HBx met 마우스에서 혈중 포도당 수준 측정
HBxmet 마우스와 정상마우스(C7BL/6)가 각각 6개월령일때 혈중 포도당(glucose) 수준을 혈당측정 시험지(GluChec Fine, 케이엠에이치(주), KOREA)로 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 12시간 단식시킨 후의 혈중 포도당 수준은 정상마우스 및 HBxmet 마우스는 각각 92 ± 4 ㎎/㎖ 및 138 ± 9 ㎎/㎖를 나타내었다. 또한, 사료 급여시 정상마우스 및 HBxmet 마우스의 혈중 포도당 수준은 각각 146 ± 8 ㎎/㎖ 및 216 ± 4 ㎎/㎖을 나타내었다. 즉, 정상마우스에 비하여 HBxmet 마우스에서 혈중 포도당 수준이 모두 유의성 있는 증가를 나타내었다(도 7).
<실험예 6> HBx met 마우스에서 당부하에 따른 혈당 강하 조사
당부하 검사를 통해 정상, 당뇨병 및 당대사 이상(정상과 당뇨병의 중간단계, 공복혈당장애, 내당능장애)를 명확하게 구분할 수 있는데, 그 기준은 하기와 같다:
혈중 혈당(mg/dl)이 공복일 때 115 미만; 30분, 60분 및 90분일 때: 200 미만; 120분일 때 140 미만이면 정상이고, 공복일때 140 미만; 30분, 60분 및 90분 일 때 200 이상; 120분일 때 140 이상 ~ 199 이하이면 내당능장애이며, 공복일 때 140 이상; 30분일 때, 60분 및 90분일 때 200 이상; 120분일 때 200 이상이면 당뇨병이다.
본 발명자들은 HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)에서 당부하 검사를 수행하였다.
구체적으로, 6개월된 HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)를 각각 12시간 밤새 단식시킨 후 2ｇ/㎏의 포도당 용액을 복강 주사한 다음, 마취없이 베어진 상기 꼬리로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈중 포도당 농도는 포도당 주입한 후 30, 60, 90 및 120분에 각각 측정하였다.
그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 HBxmet 마우스는 혈중 혈당 수준이 정상마우스보다 유의성 있는 증가를 보여 당대사 이상 및 당뇨병임을 확인하였다(도 8).
<실험예 7> HBx met 마우스에서 혈중 인슐린 수준 조사
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)가 6개월령일때 마우스 혈중 인슐린 키트(Shibayagi, Japan)를 이용하여 혈중 인슐린 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 12시간 단식시킨 후의 혈중 인슐린 수준은 정상마우스 및 HBxmet 마우스는 각각 0.745 ± 0.066 ng/㎖ 및 0.288 ± 0.016 ng/㎖를 나타내었다. 또한, 사료 급여시 정상마우스 및 HBxmet 마우스의 혈중 인슐린 수준은 각각 1.687 ± 0.409 ng/㎖ 및 1.307 ± 0.158 ng/㎖ 이다. 즉, 정상마우스에 비하여 HBxmet 마우스에서 혈중 인슐린 수준이 모두 감소되는 경향을 나타내었다(도 9).
<실험예 8> HBx met 마우스에서 혈중 글루카곤 조사
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)가 6개월령일때 마우스 글루카곤 키트(ALPCO Diagnostics, USA)를 이용하여 혈중 글루카곤 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 정상마우스에 비하여 HBxmet 마우스에서 혈중 글루카곤 수준이 유의성 있는 증가를 나타내었(도 10).
<실험예 9> HBx met 마우스에서 간의 글리카곤 조사
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)가 6개월령일때 마우스 글루카곤 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 간의 글리카곤 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 HBxmet 마우스는 정상마우스에 비해 간에서 글리카곤 수준이 유의있는 감소를 보였다(도 11).
<실험예 10> HBx met 마우스에서 간 조직의 조직학적 분석
HBxmet 마우스 및 정상마우스(C7BL/6)가 6개월령일때 간 조직을 특수염색인 페리오딕 에시드 쉬프(Periodic Acid-Schiff, PAS) 염색법을 이용하여 간 조직에 있는 글리카곤(glycogen) 농도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 각 마우스로부터 간을 채취하여 공기중에 말린 후 고정액(37% 포르말린 10 ml + 에탄올 90 ml)에 10 ~ 15분 고정한 다음, 흐르는 물에 15분간 세척하였다. 과요오드산(Periodic Acid)에 10분간 세척한 후, Schiff 시약으로 37℃에 30분간 염색하였다. 아황산(sulphurous acid)에 10분간 놓아둔 후 흐르는 물에 5분간 세척한 다음, 메이어 헤마톡실린(mayer hematoxylin)에 30분간 대조 염색하였다. 그런 다음, 물에 10분 동안 세척한 후, 공기 중에 말린 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이 간의 글리카곤 농도 결과와 마찬가지로 HBxmet 마우스는 정상마우스(C7BL/6) 보다 낮은 농도로 PAS로 염색되어 있음을 확인하였다. 즉, HBxmet 마우스는 정상마우스에 비해 간에서 글리카곤 수준이 감소한 것을 알 수 있었다(도 12).
본 발명은 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체 마우스는 당뇨병이 유도되므로 이를 당뇨병 모델 동물로 이용할 수 있으며, B형 간염에 의한 간암 발생과 당대사 이상과의 상관관계, 및 당뇨병 치료제 또는 예방제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 인간 유래의 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus; HBx)를 발현할 수 있는 발현 벡터 구축 과정을 도식화한 모식도이다:
puc 118: pUC 118(Takara, Japan) 벡터;
HBV 인핸서: Hepatitis B Virus 인핸서;
A: 제한효소 SmaⅠ 자리;
B: 제한효소 BamⅠ 자리;
E: 제한효소 EcoRⅠ 자리;
G: 제한효소 BglⅡ 자리;
H: 제한효소 HindⅢ 자리;
N: 제한효소 NciⅠ 자리;
O: 제한효소 NcoⅠ 자리;
Sp: 제한효소 SphⅠ 자리; 및
T: 제한효소 StuⅠ 자리.
도 2는 HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(Homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 유전형 분석 사진이다:
P: HBx 벡터 DNA를 사용하여 PCR한 양성 대조군;
N: 정상 마우스의 게놈 DNA를 사용한 음성 대조군;
M: 사이즈 마커;
W: 정상마우스; 및
T: HBxmet 마우스.
도 3은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스의 사진이다.
도 4는 HBxmet 마우스와 정상마우스의 평균 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스의 개복 후 사진이다.
도 6은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 체중당 간과 복부지방의 무게를 나타낸 그래프이다.
도 7은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 혈중 포도당 농도를 나타낸 그래프이다(*** p<0.001).
도 8은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 당부하 검사를 실시한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 혈중 인슐린 농도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 혈중 글루카곤 농도를 나타낸 그래프이다( ** p<0.01).
도 11은 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 간의 글리카곤 농도를 정량값으로 나타낸 그래프이다(** p<0.01).
도 12는 6개월령된 HBxmet 마우스와 정상마우스에서 간을 페리오딕 에시드 쉬프 염색하여 간의 조직학적 변화를 나타낸 사진이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Screening method for agent for prevention or treatment of diabetes using homozygote mouse transfected with HBx gene <130> 8p-10-34 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 1 ttctcatctg ccggtccgtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 2 gggtcaatgt ccatgcccca 20

Claims (11)

1) 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 마우스와 근교계동물인 정상마우스(Inbred strain: C57BL/6)를 교배하여 이형접합체 마우스를 제조한 후 상기 이형접합체 마우스 간의 교배에 의해 제조되는, HBx 단백질이 과발현되고 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는, HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 전신 또는 일부에 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여하는 단계;
2) 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여한 마우스에서 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 해부학적 또는 병리학적 지표 값을 측정하는 단계; 및
3) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 해부학적 또는 병리학적 지표 값을 유의하게 정상적으로 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 HBxmet 마우스는 기탁번호 KCTC 11156BP로 기탁된 수정란으로부터 발생되는 마우스인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 HBxmet 마우스의 일부는 조직, 장기 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되어진 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 해부학적 또는 병리학적 지표 값은 복부 지방 감소, 체중 감소, 간조직의 증가 및 간의 지방세포 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
1) 인간 B형 간염 바이러스 X(hepatitis B virus X; HBx) 유전자로 형질전환된 마우스와 근교계동물인 정상마우스(Inbred strain: C57BL/6)를 교배하여 이형접 합체 마우스를 제조한 후 상기 이형접합체 마우스 간의 교배에 의해 제조되는, HBx 단백질이 과발현되고 당뇨병 또는 당대사 이상 증상을 나타내는, HBx 유전자로 형질전환된 동종접합체(homozygote) 마우스(HBxmet 마우스)의 전신 또는 일부에 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여하는 단계;
2) 상기 당뇨병 치료제 또는 예방제 후보 물질을 투여한 마우스에서 당뇨병 또는 당대사 이상 증상과 상관 관계가 있는 혈액학적 또는 조직학적 지표 값을 측정하는 단계; 및
3) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질 투여 마우스에서의 상기 혈액학적 또는 조직학적 지표 값을 유의하게 정상적으로 변화시키는 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 HBxmet 마우스는 기탁번호 KCTC 11156BP로 기탁된 수정란으로부터 발생되는 마우스인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 HBxmet 마우스의 일부는 조직, 장기 및 세포로 이루어진 군으로부터 선택되어진 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크 리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 단계 2)의 혈액학적 또는 조직학적 지표 값은 혈중 당뇨관련 성분 증가, 혈중 포도당 수준의 증가, 혈중 인슐린 수준 감소, 혈중 글루카곤 수준 감소 및 간내 글리카곤 수준 감소로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 10항에 있어서, 상기 혈중 당뇨관련 성분은 혈중 트리글리세리드, 혈중 콜레스테롤, 혈중 유리지방산, 알라닌 트랜스아미나제(alanine transaminase; ALT), 아스파레이트 아미노트랜스퍼라제(asparate aminotrasferase; AST), 혈중 고밀도 지단백질(high-density lipoprotein; HDL), 및 혈중 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein; LDL)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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'모델동물을 이용한 독성스크리닝 기술개발', 연구보고서, 생명공학연구원, 2005

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