JP5070545B2 - 内臓脂肪型肥満と糖尿病を発症するマウス - Google Patents
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Description
[1] 内臓脂肪型肥満症を自然発症するマウスであり、内臓脂肪型肥満症を自然発症するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、ホモ接合体のみ肥満となるICRマウス由来のdarumaマウス。
[2] さらに以下の特性の少なくとも一つの特性を有する[1]のdarumaマウス:
(i) 糖尿病の併発;及び
(ii) 高脂血症の併発。
[3] 4週齢で内臓脂肪型肥満を発症する[1]又は[2]のマウス。
[4] 受託番号FERM BP-10888である受精卵から得られる[1]〜[3]のいずれかのdarumaマウス。
[5] ICRマウスから、内臓脂肪型肥満症を自然発症するマウスであり、内臓脂肪型肥満症を自然発症するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、ホモ接合体のみ肥満となるdarumaマウスを製造する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a) ICRマウスより肥満症マウスを選択し、ICRマウスと戻し交配する工程;
(b) (a)の工程により得られたF1マウスより肥満症マウスを選択し、肥満症F1マウス同士を交配する工程;
(c) (b)の工程により得られた子供マウスより肥満症マウスを選択し、肥満症マウス同士を交配する工程;及び
(d) 肥満症を自然発症する子孫マウスを選択する工程。
[6] (c)の工程を繰り返し行なう、[5]のdarumaマウスを製造する方法。
[7] マウスがさらに以下の特性の少なくとも一つの特性を有する、[6]のdarumaマウスを製造する方法:
(i) 糖尿病の併発;及び
(ii) 高脂血症の併発。
[8] [5]〜[7]のいずれかの方法により得られるdarumaマウス。
[9] [1]〜[4]及び[8]のいずれかのdarumaマウスである、ヒト肥満症及び/又は糖尿病モデルマウス。
[10] [1]〜[4]及び[8]のいずれかのdarumaマウスに被験物質を投与することを含む、肥満予防の健康食品、肥満治療剤又は糖尿病治療剤を評価又はスクリーニングする方法。
本発明のマウスは以下の方法で確立することができる。
ICRマウスから自然発症肥満マウスを選択する。この際、自然発症肥満マウスは、4週齢において通常マウスの平均体重に対して雄で136.3%、雌で130.7%となり、10週齢では雌雄共に約2倍近い大きい体重を有するという特徴を持つ個体を選択する。選択した自然発症肥満マウスをICRマウスと戻し交配し、F1マウスを得る。該F1マウスは本発明の自然発症肥満に関連した遺伝子をヘテロで有するので、肥満を自然発症することはない。次いで、そのF1マウス同士を交配し、F2マウスを得る。該F2マウスは25%が肥満を自然発症する。さらに、F2マウス同士を交配することにより、肥満を100%自然発症するマウスが得られる。この段階で、本発明の肥満症を自然発症するマウスが確立できる。さらに、F2マウス同士の交配を繰り返してもよい。
(1) 肥満度が極めて高く、成体の体重は通常マウスの約2倍又はそれ以上となる。なお、通常マウスとは、肥満、糖尿病を発症しておらず、血中脂質量も正常な正常マウスを意味する。
(2) 内臓脂肪型樽型肥満を特徴とする。
(3) 4週齢という早期に肥満症を発症する。さらに、肥満症の進行も早い。
また、雌雄共に肥満症を発症する。
(4) 通常マウスに比較して内臓脂肪が著しく増加する。肥満症マウスdarumaの腹部白色死亡組織において、脂肪細胞は脂肪により膨らみ細胞の大きさが上昇する。さらに、肝臓へ脂肪滴が溜まり、脂肪肝となる。
また、血中レプチン濃度も上昇する。上昇は3週齢から認められ、成体においては、血中レプチン濃度は、通常マウスに対して好ましくは1.5倍以上、さらに好ましくは2倍以上に上昇する。
血糖値、インスリン及びレプチン値の上昇は、早期、例えば4週齢で認められる。
ただし、本発明の肥満症マウスdarumaは、血中TG値は通常マウスと差がない。
(8) 通常マウスに比較して、一日の行動量の低下が認められる。
1.過剰な内臓脂肪蓄積の原因を解析するモデル
2.糖尿病を解析するモデル動物
3.遺伝的肥満の解析モデル動物
4.遺伝的糖尿病の解析モデル動物
5.脂質代謝のモデル動物
6.摂食機構の解析モデル動物
7.既存の肥満関連物質との比較モデル動物
8.肥満と運動の関係の解析モデル動物
9.肥満予防の健康食品開発の評価用動物
10.肥満治療剤の評価用動物
11.糖尿病治療剤の評価用動物
2005年宮崎大学農学部獣医学科家畜生理学講座において維持されているICRマウスから肥満を呈するマウスが2匹見出された。この肥満が遺伝子変異のために起こった可能性を疑い、以下の実験を行った。肥満を生じたマウスを、戻し交配した。その結果、その子供に肥満を生じるものが現れた。そこで、遺伝子上に問題があると推測し、ワイルドのICRマウスを日本チャールズリバーから購入し、肥満マウスと交配させた。その結果、F1においてはすべて肥満を生じなかったが、F1同士を交配すると、約25%の確率で肥満が生じた。次にこの肥満マウス同士を交配するとすべてが肥満マウスとなった。さらに、ワイルドマウスと肥満マウスの交配、ヘテロとヘテロマウスの交配、及び肥満のホモ同士の交配を繰り返し、家系図を作成した。その結果、ワイルド同士及びホモとワイルドの交配では0%、ヘテロとホモの交配では48%(理論値は50%)、ヘテロとヘテロの交配では25%(理論値は25%)、ホモとホモの交配では100%(理論値100%)の値が得られた。このことから、肥満の原因が劣性遺伝であると推測した。そこで、この肥満マウス(ホモ)を別の系統BALB/cマウス(ワイルド)と交配させ肥満遺伝子が保存されるか否かを検討した。生まれたF1(理論的にはヘテロ)はすべて肥満を生じないが、F1同士の交配は肥満を生じた。そこで、このF1のヘテロを選び、再度ワイルドのBALB/cマウスと交配しF2を得た。このF2から再度へテロを選択し(F2とICR肥満ホモの交配で肥満を生じた時はそのF2はヘテロと解釈される)、再々度BALB/cマウス(ワイルド)と交配した。これを繰り返すことでコンジェニックマウスを2世代作成した。この間、肥満遺伝子は保持されていた。また、この肥満マウスは成熟に達しなくても離乳時(3週齢)で高レプチンを示すことが判明したので、これをホモのスクリーニングの指標とできることが判明した。以上のことから、この肥満マウスは常染色体劣性遺伝であることが明確になった。
(1)外観の比較
図1に肥満マウスdarumaと通常マウスの外観の比較を示す。肥満マウスと通常マウスは同じ親から生まれたマウスである。図に示すように肥満マウスdarumaは内臓脂肪型樽型肥満を特徴とする。
肥満マウスdarumaと通常マウスについて3週齢から24週齢まで体重を測定した。肥満マウスdaruma、通常マウス共に雄10匹、雌10匹を用いた。図2に成長曲線を示す。図2-1が雌の成長曲線、図2-2が雄の成長曲線を示す。雌では4週齢から、雄では6週齢から体重差が生じ、15週齢以降は倍近い体重差が生じた。この差はすべて内臓脂肪に起因していた。
13週齢の肥満マウスdaruma及び通常マウスのCTスキャン像を実験動物用X線CT撮影装置:LaTheta(アロカ株式会社)を用いて撮影した。図3に両マウスのCTスキャン像を示す。図3-1が通常マウスであり、図3-2が肥満マウスdarumaのCTスキャン像である。図中水色部分が脂肪を示す。通常マウスと比べ肥満マウスdarumaでは顕著な内臓脂肪量の増加が認められた。肥満マウスdarumaを開腹したところ、CTスキャンで得られた結果と同様に、特に腹部に大量の脂肪の蓄積が認められた。
4〜19週齢の肥満マウスdaruma及び通常マウスについて、摂食量、行動量、血圧、体温、心拍数及び行動リズムを測定した。摂食量は、明期(L:休息期)と暗期(D:活動期)のそれぞれの摂食量と1日の総摂食量を測定するために、5、6、7、9週齢のマウス(ワイルドと肥満)を12時間L:12時間Dで飼育し、粉末の餌に一週間順応させた。摂食量の測定は7時点灯直後と、19時消灯直前に行なった。行動量は、赤外線センサーによって動物の動きを計測する、室町機械株式会社製行動解析装置を使用して測定した。
4、5、9及び10〜13週齢の肥満マウスdaruma及び通常マウスから採血し、血液生化学検査を行った。各値の測定はDRI-CHEM3500V(FUJIFILM)を用いて行なった。検査項目は総蛋白量、AST、ALT、クレアチニン、尿素窒素、血清血糖、TG、遊離脂肪酸、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロールであった。図5-1に10〜13週齢のマウス(成体マウス)の平均の結果を示す。また、図5-2、図5-3、図5-4、図5-5及び図5-6に、それぞれAST、ALT、TG、総コレステロール及びHDL-コレステロールの4、5及び9週齢マウスの値を示す。肥満マウスdarumaにおいて通常マウスに比べ、ALT、遊離脂肪酸、総コレステロール、HDL-コレステロールが有意に高い値を示した。一方、総蛋白、AST、クレアチニン、尿素窒素、血清血糖、TG及びLDL-コレステロールは、肥満マウスdarumaと通常マウスで有意な差は認められなかった。
10週齢までの肥満マウスdaruma及び通常マウスから採血し、血糖値、血中インスリン及びレプチンを測定した。同時に各マウスの体重も測定した。血糖値は、DRI-CHEM3500V(FUJIFILM)により測定した。インスリンはレビスインスリンキット マウス-T(株シバヤギ)を使用し、血漿10μlを検体とした。キットの操作マニュアルに従い反応させ、全ての行程が終了した後に、吸光度測定(主波長450nm、副波長620nm)を行なった。さらに、標準曲線を作成し、測定結果の判定を行なった。レプチンはモリナガレプチン測定キット(株式会社森永生科学研究所)を使用し、血漿5μlを検体とした。キットの操作マニュアルに従い反応させ、全ての行程が終了した後に、吸光度測定(主波長450nm、副波長630nm)を行なった。さらに、標準曲線を作成し、測定結果の判定を行なった。
肥満マウスdaruma及び通常マウスの腹部脂肪(白色脂肪及び褐色脂肪)及び肝臓を摘出し、組織切片を作成しHE染色し顕鏡した。図9にHE染色像を示す。肥満マウスdarumaの白色脂肪は脂肪細胞が脂肪で膨らみ細胞自体が大きくなっていた。また、肝臓に脂肪滴が溜まっていた。
肥満マウスdaruma及び通常マウスの膵臓、腎臓及び筋肉を摘出し、組織切片を作成しHE染色し顕鏡した。図10にHE染色像を示す。肥満マウスdaruma及び通常マウスのいずれにおいても異常は認められなかった。
成長曲線を作成したところ、darumaは雌雄共に離乳後4〜5週齢頃から肥満を呈し始め、15週齢でcontrolの1.5倍、20週齢で約2倍の体重となった。darumaの肥満を呈し始める時期を他のモデルマウスと比較すると、fat(fat)マウスは6〜8週齢頃、tubby(tub)マウスは9〜12週齢頃と遅いのに対し、obese(ob)マウスやdiabetes(db)マウスは4〜5週齢頃の早期から太り始めるので、darumaの肥満発症時期は後者のobese(ob)マウスやdiabetes(db)マウスのそれに類似している。一方、体重増加率のみを比較すると、daruma の体重増加像は、体重が緩やかに増加し50〜60gでプラトーに達するobese(ob)マウスやdiabetes(db)マウス及びtubby(tub)マウスよりも、むしろこの3種の突然変異マウスに比べ急性に増加し、最終的に60〜70gに達するfat(fat)マウスに類似している。
Claims (5)
- 内臓脂肪型肥満症を自然発症するマウスであり、受託番号FERM BP-10888である受精卵から得られる、内臓脂肪型肥満症を自然発症するという形質に関して常染色体劣性遺伝を示し、ホモ接合体のみ肥満となるICRマウス由来のdarumaマウス。
- さらに以下の特性の少なくとも一つの特性を有する請求項1記載のdarumaマウス:
(i) 糖尿病の併発;及び
(ii) 高脂血症の併発。 - 4週齢で内臓脂肪型肥満症を発症する請求項1又は2に記載のマウス。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のdarumaマウスである、ヒト肥満症及び/又は糖尿病モデルマウス。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のdarumaマウスに被験物質を投与することを含む、肥満予防の健康食品、肥満治療剤又は糖尿病治療剤を評価又はスクリーニングする方法。
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