CN111235276B - 去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用 - Google Patents

去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体是去势抵抗型前列腺癌诊断或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用。本发明实验结果表明LncRNA ZNF518A有miR‑101‑3P及AR的结合位点；miR‑101‑3P也可与AR‑V7 3‑’UTR结合，且经荧光素酶报告基因验证了该结果，由此发现LncRNA ZNF518A通过竞争性结合miR‑101‑3P调控AR‑V7的表达，进而促进CRPC的发生发展。优点：本发明通过检测LncRNA ZNF518A表达及AR‑V7荧光免疫化学检测双重检测增加了临床应用的可行性和可信度，能够直接应用于临床，这是目前其他分子生物学检测方法不能比拟的特点。

Description

去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是去势抵抗型前列腺癌诊断或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用。
背景技术
前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是欧美男性最常见及致死性最高的恶性肿瘤之一(Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2015.CA Cancer J Clin 2015；65(1):5-29)。在我国北京、上海等大城市，前列腺癌也已成为男性泌尿生殖系统最常见肿瘤，且大多患者初发即为晚期(Chen W,Zheng R,Baade PD,Zhang S,Zeng H,Bray F,etal.Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin 2016,66(2):115-32，叶定伟,朱耀.中国前列腺癌的流行病学概述和启示.中华外科杂志2015；53(4):249-52)。对于晚期前列腺癌，临床多采取抗雄治疗，但绝大部分患者在抗雄治疗18个月后进展为去势抵抗型前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)。
在CRPC发生的众多机制中，AR剪接变异体被认为在CRPC的发生发展进程中扮演着十分重要的作用，新英格兰杂志发表的研究证实，AR-V7是激素依赖型前列腺癌进展为CRPC的重要因素(Antonarakis ES,Lu C,Wang H,Luber B,Nakazawa M,Roeser JC,et al.AR-V7 and resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.N Engl JMed 2014；371(11):1028-38)。
据研究，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)可作为一种竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，通过吸附(sponge effect)miRNA参与靶基因的表达调控，从而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用(Wang Y,Xu Z,Jiang J,Xu C,KangJ,Xiao L,et al.Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates Oct4,Nanog,andSox2 in human embryonic stem cell self-renewal.Dev Cell 2013；25(1):69-80)，然而关于LncRNA ZNF518A在前列腺癌发生发展中的作用尚无相关报道。我们通过临床标本和细胞实验研究发现，ZNF 518A的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，ZNF 518A不但可以通过与AR直接作用，更重要的是ZNF 518A与AR异构体(如AR-V7)的表达呈高度正相关，与全长AR相比，AR-V7缺少C端配体结合区，并可自主进入胞核内并持续激活AR信号通路，促进下游基因的转录从而刺激前列腺癌细胞的增殖，在很大程度上诱导前列腺癌的激素去势抵抗。
所以，联合检测ZNF 518A及雄激素受体异构体AR-V7，是建立在LncRNA ZNF518A通过本专利证明的遗传调控机制的基础上。即LncRNA ZNF518A通过竞争性结合miR-101-3P调控AR-V7的表达，进而促进CRPC的发生发展。
针对LncRNA ZNF518A通过竞争性结合miR-101-3P调控AR-V7的表达，进而促进CRPC的发生发展，通过RT-PCR检测临床组织标本的上述指标，可以高度有效的评估和预测诊断CRPC去势抵抗和复发转移，并在激素去势抵抗和复发转移的早期做出诊断。该项申请的技术及试剂盒是基于当前最新的研究结果而建立。这是一种目前其他方法都无法替代的检测方法，迄今为止尚未见相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估的标志物。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述标志物的用途。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估的试剂盒。
本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供LncRNA ZNF518A抑制剂的用途。
本发明的第五个目的是针对现有技术的不足，提供miR-101-3P抑制剂的用途。
本发明的第六个目的是针对现有技术的不足，提供LncRNA ZNF518A与miR-101-3P的结合位点的抑制剂的用途。
本发明的第七个目的是针对现有技术的不足，提供miR-101-3P与AR-V7的结合位点的抑制剂的用途。
本发明的第八个目的是针对现有技术的不足，提供一种靶向LncRNA ZNF518A用于AR-V7介导的前列腺癌去势抵抗的核苷酸。
本发明的第九个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于去势抵抗型前列腺癌的诊断和/或预后评估系统。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
LncRNA ZNF518A在作为去势抵抗型前列腺癌的肿瘤抗药性、肿瘤侵袭能力及预后的诊断标志物中的应用，所述LncRNA ZNF518A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
miR-101-3P在作为去势抵抗型前列腺癌的肿瘤抗药性、肿瘤侵袭能力及预后的诊断标志物中的应用，所述miR-101-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估的标志物的检测试剂在制备去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估的试剂和/或试剂盒中的应用，所述的标志物是LncRNAZNF518A，所述LncRNA ZNF518A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估的试剂盒，所述的试剂盒包括LncRNA ZNF518A原位杂交探针和AR-V7荧光免疫化学检测试剂。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
LncRNA ZNF518A抑制剂在制备治疗去势抵抗型前列腺癌疾病的药物中的应用。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
miR-101-3P抑制剂在制备治疗去势抵抗型前列腺癌疾病的药物中的应用，所述miR-101-3P的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：
针对LncRNA ZNF518A与miR-101-3P的结合位点的抑制剂在制备治疗去势抵抗型前列腺癌疾病的药物中的应用，LncRNA ZNF518A与miR-101-3P的结合位点为chr10:97922220-97922242(10号染色体：97922220-97922242)。
为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是：
针对miR-101-3P与AR-V7的结合位点的抑制剂在制备治疗去势抵抗型前列腺癌疾病的药物中的应用，miR-101-3P与AR-V7 3’-UTR有结合位点，位于AR-V7启动子721-727位置。
为实现上述第八个目的，本发明采取的技术方案是：
一种靶向LncRNA ZNF518A用于AR-V7介导的前列腺癌去势抵抗的核苷酸，所述的LncRNA ZNF518A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
为实现上述第九个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于去势抵抗型前列腺癌的诊断和/或预后评估系统，所述的系统包括受试者信息获取模块、受试者诊断模块和/或预后评估模块，其中：所述受试者信息获取模块，用于获取受试者LncRNA ZNF518A标志物的检测信息；所述受试者诊断模块和/或预后评估模块，用于根据所述标志物的检测信息诊断受试者的肿瘤抗药性、肿侵袭能力及预后情况；所述LncRNA ZNF518A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明优点在于：
1、本发明在前列腺癌患者去势治疗以后特异性检测LncRNA ZNF518A，提示前列腺癌患者去势治疗后肿瘤抗药性、肿瘤侵袭能力及预后指标，有利于更好的随访。
2、本发明具有特异性强，切实的临床使用价值。通过检测LnCRN ZNF 518A表达及AR-V7荧光免疫化学检测双重检测增加了临床应用的可行性和可信度，能够直接应用于临床，这是目前其他分子生物学检测方法不能比拟的特点，具有直观、准确、高效性的优点。
3、本发明通过LncRNA表达谱分析、生物信息学软件、细胞实验及45例前列腺标本研究发现ZNF 518A的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，ZNF 518A与AR异构体(AR-V7)的表达呈高度正相关，并证实了LncRNA ZNF518A可调控AR-V7，在前列腺癌的耐药及侵袭中发挥重要作用。LncRNA ZNF518A有miR-101-3P及AR的结合位点；miR-101-3P也可与AR-V7 3-’UTR结合，且经荧光素酶报告基因验证了该结果，由此发现LncRNAZNF518A通过竞争性结合miR-101-3P调控AR-V7的表达，进而促进CRPC的发生发展。目前，尚无文献报道LncRNA ZNF518A在前列腺癌中的功能，本发明通过RT-PCR检测临床组织标本的上述指标，可以高度有效的评估和预测诊断CRPC去势抵抗和复发转移，并在激素去势抵抗和复发转移的早期做出诊断，可有效提高去势抵抗型前列腺癌病人预后效果评价从而指导临床治疗。
附图说明
附图1是LncRNA ZNF518A在前列腺增生及前列腺癌标本中的差异表达，结果表明：LncRNA ZNF518A在前列腺癌中显著增高，并且恶性程度越高，其表达量越高。
附图2是RT-PCR及Western blot结果，在C4-2及22RV-1两种耐药细胞株中敲除LncRNA ZNF518A，AR-V7表达降低(A-C)，肿瘤侵袭性(D)及对MDV的抵抗性降低(E、F)。
附图3是Rescue Assay表示在C4-2及22RV-1两种耐药肿瘤细胞中，敲除LncRNAZNF518A的同时过表达AR-V7，细胞对MDV的抵抗性有所恢复。
附图4是通过生物信息学网站查找到LncRNA ZNF518A与miR-101-3P有结合位点。
附图5是表示miR-101-3P与AR-V7 3’-UTR有结合位点。
附图6是双荧光素酶报告基因验证miR-101-3P可与AR-V7 3’-UTR结合。
附图7是LncRNA ZNF518A调控CRPC发生发展机制示意图。
附图8是AR-V7的免疫荧光结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
表1、核苷酸序列表
Figure BDA0002413422690000051
Figure BDA0002413422690000061
实施例1 AR-V7的免疫荧光检测
1实验方法
免疫组化检测(Immunohistochemistry)：标本分别取肿瘤组织和癌旁正常前列腺组织，脱水后石蜡包埋，每例蜡块连续切片6张，组织厚度4um，切片置入70℃恒温箱中烘烤15min，脱蜡，PBS冲洗3遍，每遍2min。标本放于抗原修复盒中，浸于0.01mol枸橼酸缓冲液中，放入微波炉中加热15min，冷却至室温。PBS冲洗3遍，每遍2min。切片滴加50ul过氧化酶阻断剂，室温避光孵育15min，PBS冲洗3遍，每遍2min。除去PBS液，切片滴加山羊血清封闭，室温避光孵育20min，除去多余血清，不洗，切片滴加50ul一抗。除去PBS液，切片滴加50ul二抗，置入37℃恒温箱中40min，PBS振荡洗涤4遍，每遍5min。使用DAB显色试剂盒显色。负染，苏木素病理染色液染色30-40秒，脱水透明处理。中性树胶封片，室温晾干。显微镜观察，拍片。
2实验结果
结果见图8所示。
实施例2验证LncRNA ZNF518A与前列腺癌的关系
1实验方法
选取了前列腺增生15例样本，前列腺癌30例样本，其中PSA>714例，PSA<716例，提取其中的RNA，再逆转为cDNA，定量，加入cDNA模板10ul和Taq酶0.5U，97℃5分钟，立即冰水浴，混匀，95℃5分钟，94℃30秒变性，40秒退火，72℃30秒延伸，72℃7分钟终末延伸28-36循环，4℃保温。
2实验结果
结果见图1所示，LncRNA ZNF518A在前列腺癌中显著增高，并且恶性程度越高，其表达量越高。
实施例3
1实验方法
1.1选取C4-2恩杂鲁胺抵抗及22RV-1多西他赛抵抗细胞，一组敲除LncRNAznf518A,另一组作为对照；往铺满两种细胞的6well培养板中中加入500ul TRIzol试剂，冰上放置5min，吹打均匀，转至EP管；加入氯仿100ul，室温放置5分钟，4℃12000g离心10分钟，转上层水相400ul于另一EP管中，加入异丙醇250ul，混匀室温放置10分钟，4℃12000g离心10分钟，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃7500g离心5分钟，弃上清，空气干燥5-10分钟，溶于DEPC水中至30ul，定量，加入cDNA模板10ul和Taq酶0.5U，97℃5分钟，立即冰水浴，混匀，95℃5分钟，94℃30秒变性，40秒退火，72℃30秒延伸，72℃7分钟终末延伸28-36循环，4℃保温。分别测其LncRNA znf518A及AR-V7表达。
1.2再分别就1.1中4种细胞两两做western blot实验，具体步骤为：取一定量细胞冰上裂解后离心取上清，BCA法测定蛋白质浓度，取相同蛋白量的裂解液，加上样缓冲液沸水浴中3分钟，上样，行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，5％milk10ml封闭，用washing buffer清洗1次，加入一抗(1:2000)4℃孵育过夜，washing buffer清洗3次，每次10min，用二抗(1:3000)孵育1h，washing buffer清洗3次，每次10min，显色，化学发光，测AR-V7表达量。
1.3 Transwell细胞迁移实验(Transwell Migration Assay)：检测敲除LncRNAznf518A对前列腺癌细胞侵袭能力的影响：取100ul加入24孔Transwell上室后放置37℃培养箱2h，用无血清培养基制备细胞悬液，细胞密度1*106/ml，150ml加入上室中，下室中加入含10％血清的培养基，3重复。放置37℃培养箱48h。弃去上室液体，棉签擦净Matrigel胶上面细胞，乙醇固定、PE染色，于200倍光镜下计数细胞。
1.4 MTT实验:在前列腺癌细胞株中敲除LncRNA znf518A后，与空载体对照组一起分别用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul；实验组或空载体组每组均分为两个小组，一组待细胞贴壁后即加入10uM恩杂鲁胺，另一组则加入等量的DMSO；同一般培养条件，分别于培养0、2、4、6天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20ul，继续孵育4h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长比色，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
2实验结果
见图2：RT-PCR及Western blot示，在C4-2及22RV-1两种耐药细胞株中敲除LncRNAZNF518A，AR-V7表达降低，肿瘤侵袭性及对恩杂鲁胺的抵抗性降低。见图3：Rescue Assay表示在C4-2及22RV-1两种耐药肿瘤细胞中，敲除LncRNA ZNF518A的同时过表达AR-V7，细胞对恩杂鲁胺的抵抗性有所恢复。图4通过生物信息学网站查找到LncRNA ZNF518A与miR-101-3P有结合位点。
实施例4验证miR-101-3P调控AR-V7
1实验方法
首先通过生物信息学明确miR-101-3P与AR-V7 3’-UTR有结合位点；再通过设置引物F:GTG TGT AGC CTG TGG AAA GC(SEQ ID NO:5)；R:GGT GCC ACT GAT CCT GAG TA(SEQID NO:6)构建AR-V7 3’-UTR野生型及突变型luciferase报告基因质粒，构建方法为常规方法，过表达miR-101-3P，应用双荧光素酶报告基因系统检测验证miR-101-3P可调控AR-V7。
2实验结果
图5：miR-101-3P与AR-V7 3’-UTR有结合位点，图6：双荧光素酶报告基因验证miR-101-3P可与AR-V7 3’-UTR结合。
本发明通过LncRNA表达谱分析、生物信息学软件、细胞实验及45例前列腺标本研究发现ZNF 518A的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，ZNF 518A与AR异构体(AR-V7)的表达呈高度正相关，并证实了LncRNA ZNF518A可调控AR-V7，在前列腺癌的耐药及侵袭中发挥重要作用。LncRNA ZNF518A有miR-101-3P及AR的结合位点；miR-101-3P也可与AR-V7 3-’UTR结合，且经荧光素酶报告基因验证了该结果，由此发现LncRNAZNF518A通过竞争性结合miR-101-3P调控AR-V7的表达，进而促进CRPC的发生发展。目前，尚无文献报道LncRNA ZNF518A在前列腺癌中的功能，本发明通过RT-PCR检测临床组织标本的上述指标，可以高度有效的评估和预测诊断CRPC去势抵抗和复发转移，并在激素去势抵抗和复发转移的早期做出诊断，可有效提高去势抵抗型前列腺癌病人预后效果评价从而指导临床治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市同济医院
<120> 去势抵抗型前列腺癌诊断和/或预后评估标志物LncRNA ZNF518A及其应用
<130> /
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagggcttgg gaagtgcata cagttcctgc tcctggtgtc tactctgaag agcacagagt 60
agacgtttgt ctgccatttc accggcagta agatcagcag ctgctggtga gcaaagaggt 120
agtagtgggt cactggactg gtgggcgccg gggccgcgcg ctagatggag aggtcagcgg 180
cgaacccagc tccatggcct agtctcgtca gaccgagcgc ggaccctgcc ggcctccgtt 240
ctcttccgct tgtctcagat atcatctctt cttttgatca ctgttcctga ttgtgacatt 300
gtgcaagtgt taaattgtgt gccttttgtt cctgaagaaa gaggtcctgg gatctttgaa 360
atgctaagat tcttggatac cacagtatca taaaattcct ctaaatgcat tggtgctagc 420
aatcccctac tctgtctggc ctctggatct agcttgaagt tctggattca tttccttctt 480
ccttgtacct cagcctgagc cttctgtcac ccaaagggct ccagctggtt tttcactcag 540
gcctcacttt atcttccaag atgaaggaac tgagacacag aggttgagac ttgtctaaag 600
taacatgacc agtaagtgct tgaattaatg cagatgagga aactgaggtc cagagaagtt 660
gaagttttcc caaggtcaca cagcagagct ggaactagag cttgcatttc ctgacttcca 720
gattagtgt 729
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<400> 2
agucaauagu gucaugacau g 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uuacaucuag ccuuacugua g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
uuacaucuag ccuutaccuc u 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgtgtagcc tgtggaaagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtgccactg atcctgagta 20

Claims (1)

1.LncRNA ZNF518A抑制剂在制备治疗去势抵抗型前列腺癌疾病的药物中的应用，所述LncRNA ZNF518A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的抑制剂是敲除 LncRNA znf518A的试剂。
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