CN104711341B - Dlk1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂中的应用 - Google Patents

Dlk1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及DLK1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂中的应用。本发明的新发现可应用于开发基于RT‑PCR、PCR、免疫检测、原位杂交、基因芯片等技术的诊断胃肠道间质瘤的药物或试剂盒。本发明首次提出利用基于血清/组织中DLK1基因及其产物的检测来达到早期诊断GIST或对接受手术治疗的GIST患者进行预后判断,建立在基因水平上的高通量芯片筛选+实时定量PCR验证和蛋白水平上的大样本临床样本验证,结果可靠,且DLK1无论是在基因水平还是蛋白水平上都能够显著区分肿瘤与非肿瘤、高危肿瘤与低危肿瘤,结果的重复性好,具有较好的临床应用价值。

Description

DLK1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域;更具体地,本发明涉及DLK1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂中的应用。
背景技术
胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是胃肠道最常见的间叶来源肿瘤,主要发生于胃(约占70%)。近年来GIST的发病率有逐年较快增加的趋势,以前流行病学数据显示其发病率约为7-15/百万人/年,近年来国内外流行病学统计GIST发病率超过20/百万人/年。2009年中国流行病学调查资料显示其发病率达到约30/百万人/年。据推算,国内每年的新发病例数可达4-5万例左右。GIST俨然已成为消化道内仅次于胃癌、肠癌的常见的恶性肿瘤。
GIST大多起源于胃肠道粘膜下,向腔内外突出生长,因而早期并无特殊症状,大多数患者是在肿瘤生长到一定阶段,出现消化道出血或发现腹部肿块才来就诊,甚至有不少患者直到肿瘤破溃穿孔甚至腹腔内广泛破散才能得到诊断,导致错失最佳治疗时机。由于GIST起病部位隐匿,给早期诊断带来困难,向腔外突出为主的胃GIST在内镜检查中较易漏诊,即使内镜下发现病灶,由于病灶深度的原因,大多不能像上皮源性肿瘤一样取得明确的病理诊断;小肠或胃肠道外GIST的诊断至今仍是困扰临床医师的一大难题,几乎没有可靠的影像学诊断手段,甚至往往需要行剖腹探查才能实现诊断。癌胚抗原(CEA)应用于大肠癌的早期诊断或甲胎蛋白应用于肝癌的筛选已经取得了成功,而相较于其他肿瘤,起病隐匿诊断困难的GIST更需要一种简单可行的生物学标志物来应用于临床诊断。GIST的生物学行为多样,跨度覆盖良性、低度恶性、中度恶性、高度恶性。绝大多数体积很小的GIST可以终生随访而无任何进展。高度恶性病例预后极差,生长极快,在靶向治疗药物伊马替尼问世之前,其中位生存期仅有10-20个月,5年生存率<10%。同时GIST的生物学行为较难预测,虽然目前有普遍被接受的NIH(National Institutes of Health美国国立卫生研究院)危险度分级(主要依据肿瘤大小、核分裂相以及肿瘤原发部位),但是临床上也有不少病例的病程发展较难用上述分级标准来解释。甚至有文献报道一些看似“良性的GIST”,即肿瘤直径<2cm,核分裂相<5/50HFP的肿瘤患者,术后短期内发生复发和转移;也不乏肿瘤巨大的患者在接受手术治疗后即使不接受药物治疗也能获得长期生存。
小分子酪氨酸激酶受体抑制剂甲磺酸伊马替尼的问世极大地改变了GIST的治疗策略,该药物以GIST发病的最根本分子异常(c-kit基因突变)为治疗靶点,发挥有效的抗肿瘤的作用。然而在靶向药物治疗应用的临床实践中也出现了一些问题:(1)约有5-10%的患者对伊马替尼原发耐药,而大多数对伊马替尼初始治疗有效的患者最终会不可避免地发展为激发耐药,耐药多发生于初始治疗开始后6个月至2年内;(2)目前高复发风险GIST患者手术后接受一定时间的伊马替尼辅助治疗已经取得共识,然而辅助治疗合适的人群选择始终存在争议,放宽治疗适应症必然会带来医疗资源的浪费,增加耐药的发生;过度严苛的适应症也会导致一部分患者错过理应接受的合理治疗;(3)伊马替尼不菲的价格使很多患者对其望而却步,如果能够有更客观合理判断GIST患者复发风险的指标,将能极大地有利于医疗资源的合理分配。
因此,临床上亟待一种能够有效判断GIST预后的生物学指标。
发明内容
本发明的目的在于提供DLK1基因在制备胃肠道间质瘤诊断试剂或试剂盒中的应用。
在本发明的第一方面,提供DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段(FA1)的用途,用于制备进行胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂。
在本发明的另一方面,提供一种特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂的用途,用于制备进行胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂或诊断试剂盒。
在一个优选例中,所述的特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂是应用于PCR(包括RT-PCR)、免疫检测、原位杂交、基因芯片检测的DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂。
在另一优选例中,所述的特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂选自:
特异性扩增DLK1基因的引物;
特异性识别DLK1基因的探针;或
特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体。
在另一优选例中,所述的特异性扩增DLK1基因的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示;或
所述的特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体是多克隆抗体和单克隆抗体;较佳地,所述的单克隆抗体是ab21682。
在本发明的另一方面,提供一种用于进行胃肠道间质瘤预后评估的试剂盒,所述的试剂盒中含有:特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂。
在一个优选例中,所述的试剂盒中包括:
特异性扩增DLK1基因的引物;
特异性识别DLK1基因的探针;或
特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体。
在另一优选例中,所述的特异性扩增DLK1基因的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示;或
所述的特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体是DLK1单抗ab21682。
在另一优选例中,所述试剂盒中还包括:
免疫组织化学检测试剂(如携带有可检测信号标记如HRP的检测抗体,显色试剂,二甲苯,乙醇,H2O2甲醇液,抗原修复液,封闭液,PBS,中性树脂等);
PCR扩增试剂(如RNA抽提试剂,逆转录试剂,荧光定量PCR试剂)。
在本发明的另一方面,提供特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的试剂的用途,用于制备胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂盒。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、实时定量PCR结果显示,在包括14例高危(右)、10例低危(左)在内的24例胃肠道间质瘤新鲜肿瘤标本中,低危组中DLK1基因的表达量显著低于高危组中的表达量(p=0.053,fold change=639.69)。
图2、免疫组化染色结果(肿瘤组织,阴性反应)。
图3、免疫组化染色结果(肿瘤组织,弱阳性反应)。
图4、免疫组化染色结果(肿瘤组织,强阳性反应)。
图5、通过Kaplan-Meier方法绘制的323例胃肠道间质瘤患者的总生存曲线。(P<0.001)蓝色线为DLK1表达阴性组,共117例;绿色线为DLK1表达弱阳性组,共114例,橙黄色线为DLK1表达强阳性组,共92例。
图6、通过Kaplan-Meier方法绘制的323例胃肠道间质瘤患者的无复发生存曲线。(P<0.001)蓝色线为DLK1表达阴性组,共117例;绿色线为DLK1表达弱阳性组,共114例,橙黄色线为DLK1表达强阳性组,共92例。
图7、高危GIST与其它各组血清FA1浓度比较。13例高危GIST患者术前血清、9例高危术后血清、15例低危患者血清、25例健康人群,以及17例恶性消化道上皮源性肿瘤。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次发现胃肠道间质瘤(GIST)中DLK1明显高表达。大样本验证发现,这种高表达与GIST的恶性临床病理指标存在明显的相关性。因此,本发明人将GIST与DLK1水平的相关性结合起来,建立了一种GIST的预后方法。
DLK1(delta drosophlia homolog-like1或delta-like1homologue)定位于人染色体14q32,为父系表达的印迹基因,由于其蛋白结构和氨基酸序列与果蝇Notch配基Delta的对应结构有着高度同源性,因而得名。人DLK1基因(NCBI(Reference Sequence:NM_003836.5)全长1599bp(SEQ ID NO:5),CDS含有1152核苷酸,编码383个氨基酸残基。SEQ IDNO:5中,第205-1356位为DLK1ORF;第274-1113位为FA1ORF。DLK1蛋白是一种跨膜蛋白,包含细胞内信号肽,中间跨膜区及细胞外区,其中细胞外区由6个表皮生长因子样串联重复组成。因此,DLK1属于EGF样超家族的成员之一。DLK1作为跨膜蛋白,已知其参与多种细胞的分化调节,包括脂肪的形成、血细胞的生成、肾上腺及神经内分泌细胞的分化以及创伤修复。因此,DLK1主要在胚胎发育早期表达,随着胚胎发育成熟,DLK1的组织表达逐渐减少,成人组织细胞中很少表达DLK1,且呈现特异性,仅局限在胰腺B细胞、肾上腺髓质、垂体前叶、胎盘、睾丸和卵巢细胞中,而在正常成人的胃肠道组织中没有DLK1表达。此外,DLK1胞外结构域近跨膜区有两处可被蛋白酶加工的位点,经蛋白酶酶解后释放到细胞外的可溶性蛋白片段FA1(fetal antigen1)具有生物学活性,并可在血清标本中检测。
在一些具有神经内分泌特性的肿瘤,包括人类神经胶质瘤、人类肺小细胞癌及白血病等,发现DLK1的异常表达。但是,在其它许多肿瘤中,尤其是上皮源性消化道肿瘤,如胃癌、结直肠癌中,均未发现DLK1的异常表达。并且至今DLK1基因与GIST发生的关联不清楚。
在本发明的研究过程中,发明人首先选取12例胃GIST的新鲜手术切除标本,按照目前使用的危险度分级标准(综合考虑肿瘤大小及核分裂相),按照肿瘤复发风险递增为标本顺序编号(低危4例、中危4例、高危4例)。利用Roche公司的NimbleGen芯片对该12例标本进行基因表达谱微阵列研究,筛选出在不同危险度分组间随肿瘤危险度升高呈显著上调或下调的基因(p<0.05,fold change>2)。之后对筛选出的基因在另外24例GIST新鲜肿瘤标本(14例高危、10例低危)中进行实时定量PCR验证。筛选出DLK1基因无论是在表达谱芯片结果中(p=0.00032,fold change=532.49)还是定量PCR验证结果中(p=0.053,fold change=639.69)均呈现出在高危组GIST中显著高表达。
上述基础上,发明人利用组织微阵列技术构建了包含139例GIST组织标本(分别包含肿瘤和瘤旁正常组织)的组织芯片,并利用免疫组织化学技术检测DLK1在这些标本中的表达情况,发现DLK1在瘤旁正常组织中阳性表达率远低于在肿瘤中阳性表达率(1.44%vs74.82%),且DLK1表达强度与肿瘤直径(p=0.024)肿瘤分级(p<0001)呈正相关。
之后,发明人扩大样本,构建了包含另外187例GIST肿瘤组织标本的组织芯片,进一步分析DLK1表达与GIST临床病理资料及预后的关系,不仅发现DLK1的表达与肿瘤直径(p<0.001)、核分裂相(p=0.014)、和肿瘤分级(p<0001)呈正相关,还与GIST患者术后生存状态(p<0.001)及复发或转移(p=0.001)密切相关。通过Kaplan-Meier方法绘制生存/复发曲线,根据DLK1表达强弱进行分组患者的生存/复发曲线也可得以明显区分。
根据上述实验结果尤其是大样本量的临床资料分析,发明人已经证实了DLK1基因与GIST的生物学特性及GIST患者预后存在必然联系。DLK1蛋白的酶解产物FA1蛋白,可以在血清中得到检测,为GIST疾病的早期诊断和预后判断提供一种新的手段。
DLK1蛋白的酶解产物FA1蛋白,可以在血清中得到检测,为GIST疾病的早期诊断和预后判断提供一种新的手段。试验结果表明DLK1基因可用于制备诊断或治疗GIST药物。
基于本发明人的上述新发现,可以将GIST作为GIST诊断及预后的标志物:(i)进行GIST的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析;(ii)评估相关人群的GIST治疗药物、药物疗效、预后,以及选择合适的治疗方法;(iii)早期评估相关人群GIST患病风险,早期监测早期防治。比如,可分离出由DLK1基因表达异常而导致GIST的人群,从而可进行更有针对性的治疗。
因此,本发明提供了DLK1基因或蛋白的用途,用于制备诊断特别是预后评估GIST的试剂或试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测DLK1基因的存在与否以及表达情况,这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等,这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测DLK1基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的,当进行基因水平的检测时,可以采用特异性扩增DLK1的引物;或特异性识别DLK1的探针来确定DLK1基因的存在与否;当进行蛋白水平的检测时,可以采用特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体或配体来确定DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的表达情况。
在传统的方法中,检测可通过Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所熟知的(参见Sambrook等,1989)。常规的检测还有生物芯片、荧光显影技术、细胞流式计数等。
作为本发明的优选方式,所述的检测试剂是引物,其可特异性扩增出DLK1基因或基因片段。更优选的,所述的引物具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列。该引物扩增获得的扩增产物具有合适的长度,且特异性高,对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性。
针对DLK1基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术,例如,制备一种探针,其可与DLK1基因上特定位点发生特异性结合,而不与DLK1基因以外的其它基因特异性结合,且所述探针带有可检测信号。设计探针的方法是本领域常规的,可见Sambrook等人,分子克隆实验室手册中所述。检测生物样品中是否存在DLK1蛋白或核酸或其可溶性蛋白片段的示范性方法包括获得测试受试者的生物样品,使该生物样品接触能与DLK1mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针可以是,例如DLK1基因的部分,如长至少15、30、50、100个核苷酸并能在严谨条件下与DLK1mRNA或基因组DNA充分杂交的核酸探针。用于本发明诊断试验的其它探针如本文所述。核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选连接到一种发色团,但可被放射标记。在另一个实施例中,探针连接到一种结合伴侣上,如抗体或生物素,或另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。
利用特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体来检测分析物中DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段存在情况的方法也是本领域人员熟知的技术,包括ELISA、Western印迹分析,或者与检测基团偶联,通过化学发光、同位素示踪等方法。本发明的抗体可以是对DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段具有特异性的单克隆抗体。单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。所述单克隆抗体可以利用DLK1蛋白或蛋白片段或功能区,通过免疫技术获得。此外,还可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。
本发明的抗体也可以是对DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段具有特异性的多克隆抗体。所述的多克隆抗体可通过常规的方法来制备,例如,可通过将所述的DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段导入动物中来获得,例如,将DLK1蛋白与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合后免疫动物。免疫方法可使用动物皮下注射。所述动物可选自兔、羊、牛等。
本发明还提供了用于在分析物中检测DLK1基因的存在与否以及表达情况的试剂盒,该试剂盒包括:特异性扩增DLK1基因的引物;特异性识别DLK1基因的探针;或特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段的抗体。在获得了特异性检测DLK1基因或蛋白表达水平的试剂后,可以方便地制备出用于特异性检测DLK的检测试剂盒。
一种检测试剂盒是基因水平的检测试剂盒,其中可包括:特异性扩增DLK1基因的引物;或特异性识别DLK1基因的探针。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术,其基本原理是体外酶促合成特异被倍应用于基因水平的检测。所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交等所需的各种试剂。
另一种检测试剂盒是蛋白水平的检测试剂盒,所述试剂盒中除了含有抗DLK1的抗体以外,还可以包含:携带有可检测信号分子的检测抗体(用于与DLK1特异性抗体结合),以及疫组化试剂。所述的免疫组化试剂包括但不限于:显色试剂,二甲苯,乙醇,H2O2甲醇液,抗原修复液,封闭液,PBS,中性树脂等。所述的“可检测信号分子”是指用于确定待检测样品中DLK1蛋白或片段的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的特异性抗体和检测抗体后,可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种可检测信号分子。例如,可检测信号分子可以选自:辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶。当采用如上所示的一些酶作为可检测信号分子时,还需要采用一些与相应的酶结合的底物,从而可通过显色等方式来报导可检测信号分子的存在情况或者存在量。所述的底物例如:用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP);等等。本领域人员可根据所采用的可检测信号分子的种类和特性,选择适宜的底物。所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂,包括但不限于:抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外,所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
本发明在国内外GIST研究和临床引用领域首次提出利用基于血清/组织中DLK1基因及其产物的检测来达到早期诊断GIST或对接受手术治疗的GIST患者进行预后判断。本发明建立在基因水平上的高通量芯片筛选+实时定量PCR验证和蛋白水平上的大样本临床样本验证,结果可靠,且根据实验结果,DLK1无论是在基因水平还是蛋白水平上都能够显著区分肿瘤与非肿瘤、高危肿瘤与低危肿瘤,结果的重复性好,且其在不同组别间的表达量的差异巨大,具有成为良好的临床可操作的生物标志物的潜质,有极好的临床应用价值。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、胃肠道间质瘤
发明人首先选取12例胃GIST的新鲜手术切除标本,按照目前使用国际通用的GIST危险度NIH分级标准(综合考虑肿瘤大小及核分裂相),按照肿瘤复发风险递增为标本顺序编号(低危4例、中危4例、高危4例)。利用Roche公司的NimbleGen芯片对该12例标本进行基因表达谱微阵列研究,筛选出在不同危险度分组间随肿瘤危险度升高呈显著上调或下调的基因(p<0.05,倍数改变(fold change)>2)。
结果筛选获得一部分表达发生的基因。尤其值得关注的是:在表达谱芯片中,DLK1基因随着肿瘤危险度升高呈现显著上调,p=0.00032,高危vs.低危的倍数改变(foldchange)=532.49。
实施例2、实时定量PCR分析胃肠道间质瘤患者中高危和低危患者的DLK1基因表达
对前述筛选出的基因在另外24例GIST新鲜肿瘤标本(14例高危、10例低危)中进行实时定量PCR验证。
1.1主要试剂
RNA抽提试剂RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司,逆转录试剂盒HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kits购自Invitrogen公司,荧光定量PCR试剂盒Power SYBR Green PCR Master Mix购自Invitrogen公司。
DLK1及管家基因β-肌动蛋白的引物序列如下:
DLK1:上游引物:CTTTCGGCCACAGCACCTAT(SEQ ID NO:1);下游引物CCTCGCAGAATCCATTTTGGG(SEQ ID NO:2)。
β-肌动蛋白:上游引物:CTCCATCCTGGCCTCGCTGT(SEQ ID NO:3);下游引物GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO:4)。
1.2胃肠道间质瘤病人肿瘤组织样品的收集
胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通大学医学院附属仁济医院。手术后组织标本立即置液氮中冷冻,随后保存于-80℃超低温冰箱。
1.3实时荧光定量分析PCR分析
总RNA抽提:将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状。向研钵中加入适量的RNAisoPlus,将研磨成粉末状的样品完全覆盖,然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将匀浆液转移至离心管中,室温静置5分钟。12,000g4℃离心5分钟。小心吸取上清液,移入新的离心管中。加入RNAiso Plus的1/5体积量的氯仿,剧烈振荡15秒,待溶液充分乳化后,再室温静置5分钟,12,000g4℃离心15分钟。吸取上清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇,上下颠倒离心管充分混匀后,在15~30℃下静置10分钟。12,000g4℃离心10分钟。弃去上清,沿管壁加入75%的乙醇l ml,上下颠倒洗涤离心管管壁,12,000g4℃离心5分钟后弃去乙醇。室温干燥沉淀2~5分钟,加入适量的RNase-free水溶解沉淀后用Nanodrop2000测定RNA浓度后于-80℃保存。
逆转录合成cDNA:RNA解冻后在0.2mlPCR管中配置反应溶液,反应体系如下表1。
表1
成分 体积/反应(ul)
10X RT Buffer 2.0
25X dNTP Mix(100nM) 0.8
10X RT随机引物 2.0
Multiscribe Reverse Transcriptase 1.0
RNase-free water 4.2
总体积/反应 10
加样后将反应管置于PCR仪,热循环体系为25℃10分钟——37℃120分钟——85℃5分钟——4℃保存。
Realtime PCR检测:在96孔板中配制20ul反应体系。每反应设3个复孔,以β-肌动蛋白为内参基因进行相对定量检测DLK1基因表达量。
Realtime扩增体系如下表2。
表2
成分 浓度 体积(ul)
Power SYBR Green Master Mix 2X 10
Forward Primer 1uM 4
Reverse Primer 1uM 4
cDNA模板 2
总体积 20
将加好样品的96孔板放在ABI9300荧光定量PCR仪中进行反应,热循环体系如下表3。
表3
胃肠道间质瘤病人24例。Realtime PCR结果用2-△△CT法进行分析。实验结果如图1所示,在24例胃肠道间质瘤(14例高危、10例低危)的新鲜肿瘤标本中,低危组中DLK1基因的表达量显著低于高危组中的表达量。高危组与低危组相比,p=0.053,倍数改变(foldchange)=639.69。
实施例3、DLK1在胃肠道间质瘤病人组织中的表达情况
2.1主要试剂
DLK1抗体(ab21682)及辣根过氧化物酶标记的二抗山羊多克隆抗兔IgG(ab6721)购自abcam公司。DAB显色剂及其底物试剂盒购自赛默飞公司。其余试剂均为国产分析纯。
2.2胃肠道间质瘤组织芯片阵列的构建
胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通大学医学院附属仁济医院。芯片阵列构建由苏州新芯生物技术有限公司完成,点阵直径1.6mm,层厚3mm。芯片一包括139例患者胃肠道间质瘤肿瘤组织及相应邻近正常组织,芯片二包括189例患者胃肠道间质瘤肿瘤组织。
2.3免疫组织化学染色
脱蜡水化:二甲苯10分钟——二甲苯1/210分钟——无水乙醇5分钟——95%乙醇5分钟——70%乙醇10分钟——PBS洗。
抗原修复:电炉加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热15分钟,PBS洗。
消除内源性酶:3%过氧化氢37℃孵育30分钟,PBS洗。
抗原封闭:10%山羊血清室温孵育1小时。
一抗孵育:滴加一抗(DLK1单抗)150ul,4℃孵育过夜,PBS洗。
二抗孵育:滴加二抗(羊抗兔多抗)150ul,室温孵育1小时,PBS洗。
发色:DAB显色5-10分钟,显微镜下控制发色程度,PBS洗。
苏木精复染1分钟,自来水冲洗15分钟。
脱水、封片、镜检。
2.4组织芯片结果判断
以胞膜着色为阳性反应部位,对每个阵列点阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色和棕褐色分别打0、1、2分,着色阳性面积按无着色、着色<1/2和>1/2分别打0、1、2分,然后根据两项打分之和判断其结果:0分为阴性,1-2分为弱阳性,3-4为强阳性(注:每张切片选择有代表性的区域,在400倍视野下进行计数,共计5个视野,取其平均值以避免随意性)。
2.5统计学分析
将组织芯片结果输入SPSS20.0中进行分析,以卡方检验分析DKL1表达与临床病理资料相关性,显著性水平定义为p<0.05。以Kaplan-Meier法进行生存分析,显著性水平定义为p<0.05。
通过比较包含有139例肿瘤组织及相应正常瘤旁组织的组织芯片(芯片一)的DLK1免疫组化染色结果,发现显示DLK1在瘤旁正常组织中阳性表达率远低于在肿瘤中阳性表达率(1.44%vs74.82%),通过分析包括189例患者胃肠道间质瘤肿瘤组织的组织芯片(芯片二)DLK1免疫组化染色结果,发现DLK1表达情况典型结果分为阴性表达(图2)、弱阳性表达(图3)以及强阳性表达(图4);且DLK1的表达与肿瘤直径(p<0.001)、核分裂相(p=0.014)、和肿瘤分级(p<0001)呈正相关,还与GIST患者术后生存状态(p<0.001)及复发或转移(p=0.001)密切相关。
对于323例胃肠道间质瘤患者,长期跟踪其病情约7年,通过Kaplan-Meier方法绘制生存/复发曲线,根据DLK1表达强弱进行分组患者的生存/复发曲线也可得以明显区分,见图5-6。
实施例4、血清型鉴定DLK1可溶性蛋白片段FA1
4.1材料
4.1.1血清标本
本实施例中,所使用的血清标本取自2009年至2012年于上海交通大学医学院附属仁济医院普外科住院并接受手术治疗的消化道肿瘤患者及我院体检中心接受体检并证实无病的健康人群共75例,包括25例健康人群,以及17例恶性消化道上皮源性肿瘤(包括胃癌9例,结直肠癌8例)和33例GIST患者。GIST患者中低危20例,高危13例。所有肿瘤患者术前均临床排除其它合并肿瘤病史,未接受放化疗及其它抗肿瘤治疗,所有血清均于患者入院次日清晨(术前3~5天左右)抽取。其中9例高危GIST患者还于术后一周采血与术前比较。各组基本临床信息详见表4。
表4、各组样本组成情况
4.1.2试剂
FA-1ELISA试剂盒 美国R&D公司
试剂盒内包括:
FA-196孔板(Part893250)×1
封板贴膜×4
4.2仪器设备
4.3方法
4.3.1血清标本制备
抽取健康献血员和患者空腹5ml外周静脉全血于医用无菌促凝管内,上下轻轻摇晃3次让血液与促凝剂充分混合后置于4℃常温冰箱中静置2小时,然后于常温离心机3000rpm×l5min,将上层血清分装于无菌管内,并置于-80℃超低温冰箱备用。
4.3.2血清FA1含量测定
为了避免研究者的主观偏见和测量性偏倚,减小系统误差,本发明人在整个实验过程中遵循了随机、双盲的原则,对各组样本随机编号,待所用样本检测完成后再统一解盲,分析数据。各组血清样本中FA1蛋白含量通过采用双抗体夹心ELISA法来检测。所有标准蛋白及样本均设立2个重复孔,所得检测结果已排除干扰因素的影响,均在批间差异及批内差异允许范围之内。实验操作严格按照试剂盒操作说明书,具体实验步骤如下:
1)使用前将所需试剂置于室温,按使用说明调配试剂,10ng/ml标准品对半梯度稀释;
2)在96孔板每孔中加入分析稀释剂RD1W100μl;
3)顺序加入标准品及血清样品,每孔50μl,然后贴膜封闭,室温孵育2小时;
4)弃去空中液体,每孔加入清洗缓冲液400μl冲洗并吸尽空中残留液体,重复清洗4次;
5)每孔加入200μl FA-1辣根过氧化物酶酶标抗体,贴膜封闭后室温孵育2小时;
6)重复操作4;
7)每孔加入显色反应底物溶液200μl,贴膜封闭后室温避光摇床孵育30分钟;
8)每孔中加入50ul反应终止液,酶标仪450nm波长读数OD值;
9)根据标准品浓度梯度,使用CurveExpert1.4软件绘制标准曲线,并根据标准曲线计算出每个血清样品的FA-1蛋白含量。
4.4统计学分析
使用SPSS17.0统计软件包进行数据统计分析,使用GraphPad Prism5.0软件绘制散点图。数据以X±s表示,组间差异采用独立样本或配对样本t检验,以P<0.05作为差异具有统计学意义的界值。
运用ELISA方法检测33例GIST患者手术前(其中9例还抽取术后血清)及42例非GIST人群(包括25例健康人群,以及17例恶性消化道上皮源性肿瘤)血清标本中FA1蛋白的含量,酶标仪450nm波长读数OD值结果如图2。根据FA1标准品浓度梯度绘制标准曲线计算,并计算FA1含量并比较各组间均值差异。结果显示:健康人群组的血清FA1平均浓度为0.156ng/ml(0.08-0.38ng/ml),胃肠癌组的FA1平均浓度为0.101ng/ml(0.06-0.19ng/ml),中低危GIST患者的FA1平均浓度为0.139ng/ml(0.10-0.25ng/ml)。胃肠癌及中低危GIST组与健康人群组比较,P值分别为0.097和0.331,均无显著性差异。
对13例高危GIST患者的血清FA1浓度检测显示,其术前平均浓度为0.437ng/ml(0.09-1.70ng/ml),其中9例术后血清FA1浓度为0.152ng/ml(0.11-0.21ng/ml)。手术前、后两组比较,P值<0.001,有显著性差异。高危GIST术前组血清FA1浓度分别与健康人群组、胃肠癌组及中低危GIST组比较,P值分别为0.047、0.025及<0.001,均具有显著性差异,见图7。
因此,可以通过检测患者血清中FA1浓度来进行患者的预后。
实施例5、临床诊断应用
对从医院获得多个胃肠道间质瘤确诊患者的肿瘤样本,制备组织芯片,如实施例2中揭示的方法分析组织芯片的DLK1表达情况。如DLK1表达强阳性,则采取积极的治疗和频繁回访的方案;如DLK1表达弱阳性,则治疗后采取较频繁检查的方案;如DLK1表达阴性,则定期随访检查。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的用途,用于制备进行胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂,所述诊断试剂检测组织样本中的DLK1或血清样本中的DLK1可溶性蛋白片段FA1。
2.一种特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的试剂的用途,用于制备进行胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂,所述诊断试剂检测组织样本中的DLK1或血清样本中的DLK1可溶性蛋白片段FA1。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的试剂是应用于PCR、免疫检测、原位杂交、基因芯片检测的DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的试剂。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述的特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的试剂选自:
特异性扩增DLK1基因的引物;
特异性识别DLK1基因的探针;或
特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的抗体。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的特异性扩增DLK1基因的引物的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
6.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述的特异性结合DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述的单克隆抗体是ab21682。
8.特异性识别DLK1基因或DLK1蛋白或其可溶性蛋白片段FA1的试剂的用途,用于制备胃肠道间质瘤预后评估的诊断试剂盒,所述试剂盒检测组织样本中的DLK1或血清样本中的DLK1可溶性蛋白片段FA1。
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