KR20120004736A - 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 림프절 전이를 진단하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 발현 패턴을 확인하는 방법에 관한 것이다. 이는 림프절 전이의 진단, 치료 및 연구에 있어서 보다 간편하고 정확한 정보를 제공하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단방법{A Method for Diagnosing the Risk of Lymph Node Metastasis in Papillary Thyroid Carcinoma}
본 발명은 암의 림프절 전이 진단방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 염색패턴을 확인하는 방법에 관한 것이다.
암 환자의 사망 원인은 초기 종양에 의한 것보다는 주로 암세포의 전이 (metastasis)에 의한다. 이러한 암세포의 전이는 먼저 초기 종양으로부터 전이성 암세포가 떨어져나와 정상 조직의 간질성 기질 (interstitial stroma)과 기저막 (basal membrane, BM)과 같은 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)을 침윤 (invasion)하여 혈관이나 림프관으로 들어간 다음 다른 목표 조직의 모세관 혈관벽에 부착되고 세포의 기질과 기저막을 통하여 모세관으로부터 침출하여 새로운 조직에서 증식하는 과정으로 2차 종양 (전이성 암)을 형성하게 된다.
갑상선 유두암종은 갑상선에서 발생하는 가장 흔한 악성 종양으로, 병리적 분석에 따르면 다발성 갑상선 유두암종의 빈도는 보고마다 다르지만, 그 범위는 18~87%로 보고된다.
유두암종의 사망률은 그리 높지 않아 매우 우수한 예후를 보이지만, 때때로 림프절 전이나 원격 전이와 같은 공격적인 양상을 보이기도 한다.
특히 갑상선 유두암종은 5년 생존율이 94%, 10년 생존율 이 89%, 20년 생존율이 87% 정도로 예후가 양호하다. 갑상선 분화 암종은 비교적 전이가 흔하지 않으며 서서히 자라서 악성도가 낮은 암종으로 인식될 수도 있다. 하지만 유두암종에서는 경부전이가 비교적 흔히 발생하여 초진 시 경부 림프절 전이가 30%에서 80% 정도까지 발견되는 것으로 보고되고 있다. 경부전이가 예후에 미치는 영향에 대해서는 아직도 논란이 있다. 다수의 연구에서 유두암종에서 경부전이가 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 보고되였으나, Hughes와 Shaha 등은 경부 림프절 전이가 재발의 위험성을 증가시키는 것으로 보고하였다.
갑상선 유두암종에서 림프절 전이의 적절한 치료에 대해서도 논란이 있다. 임상적 양성 경부에 대해서는 치료적 경부청소술을 시행해야 한다고 보고되고 있으나 임상적 음성 경부에 대한 예방적 경부청소술에 대해서는 논란이 있다. 갑상선 암종의 경부청소술로는 내경정맥, 척수부신경, 흉쇄유돌근을 보존하는 변형 근치적 경부청소술이 주로 시행되나 경부청소술의 범위에 대한 결정은 예측 가능한 전이형태를 바탕으로 이루어져야한다. 두경부의 편평세포 암종에 대한 경부전이에 대해서는 많은 연구가 이루어졌지만 갑상선 유두암종의 경부전이의 형태에 대한 연구는 그리 많지 않다.
이에, 본 발명자들은 갑상선 유두암종의 전이여부를 예측할 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 노력하여, 사이클린(cyclin) D1의 독특한 염색패턴을 확인함으로써 갑상선 유두암종의 림프절 전이를 예측할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 발현 패턴을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시료 및 사이클린(cyclin) D1 염색시약을 포함하는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 발현 패턴을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 림프절 전이는 유두암종, 여포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종 및 수질암종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 갑상선암종에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 림프절 전이는 갑상선 유두암종(papillary thyroid carcinoma)에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 확인은 사이클린(cyclin) D1의 면역조직화학염색 방법을 이용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정보는 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth) 유무에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측면관상 성장(lateral tubular growth)은 림프관 내부에서 발견된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시료, 사이클린(cyclin) D1 항체 및 표지물질을 포함하는, 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단용 키트를 제공한다.
나아가 본 발명은,
(a) 후보 물질의 존재하에, 갑상선 유두암종 세포에서 사이클린(cyclin) D1 염색을 통해 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth)을 확인하는 단계; 및
(b) 후보물질이 없는 경우와 비교하여, 상기 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth)이 억제되는 경우의 후보물질을 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질로 선택하는 단계를 포함하는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 사이클린 D1의 염색패턴을 확인하는 간단한 방법에 의해, 림프절 전이에 따른 독특한 병리소견인 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상성장(lateral tubular growth)을 확인할 수 있으므로 암종의 림프절 전이 여부에 대한 진단에 활용할 수 있다. 특히 갑상선 유두암종의 전이 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 0.4 cm 크기의 인간 갑상선 미세 유두암종에 대한 사이클린 D1의 발현 확인 및 사이클린 D1 면역염색을 통해 측면관상성장 등의 발현 패턴을 확인한 결과이다.
도 2는 0.6 cm 크기의 인간 갑상선 미세유두암종에 대한 사이클린 D1의 발현 확인 및 사이클린 D1 면역염색을 통해 단독 샘을 확인한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.
"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 림프절 전이 여부를 확인하는 것이다. 그 중에서도 특히 갑상선 유두암종의 림프절 전이 확인에 유용하다.
"진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 암의 림프절 전이를 구분하여 진단할 수 있는 용도로 사용될 수 있는 현상으로, 정상 상태와 비교하여 림프절 전이 양상을 확인할 수 있는 유기 생체 분자뿐만 아니라 유기 생체 분자가 나타내는 특이한 병리 현상 등도 포함한다. 본 발명에서는 림프절 전이 진단용 마커로서, 림프절 전이에 따른 독특한 병리소견인 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상성장(lateral tubular growth)을 확인할 수 있으므로 사이클린(cyclin) D1의 염색패턴을 사용한다.
"표지"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.
세포의 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.
"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서는 갑상선 유두암종은 대표적으로 다룬다.
"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 사이클린(cyclin) D1의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, '림프절 전이 억제제'는 종양의 림프절 전이를 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.
"예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
"치료"는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어 치료학적 유효량은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 진단하고자 하는 것은 암의 림프절 전이 여부이다. 그 중에서도 특히, 갑상선암의 림프절 전이에 관한 것이다. "갑상선암"은 갑상선(thyroid)에 발생하는 악성 종양을 의미하며, 유두암종, 소포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종, 수질암종 등을 모두 포함한다. 가장 바람직하게는, 갑상선 유두암종의 림프절로의 전이 여부 진단하는 것이다.
갑상선 유두암종은 모든 갑상선 암의 약 80～90%를 차지하는, 가장 흔한 형태이고 이 중 약 30% 정도는 미세유두암종의 형태를 취하고 있다. 최근 국내에서는 이러한 갑상선 미세유두암종 진단이 급격히 증가하고 있는데, 갑상선 미세유두암종의 치료방법 및 수술 범위에 대해서는 아직까지 논란의 여지가 남아있다.
갑상선 미세유두암종에서 림프절 전이는 40～65%까지 나타나고 이들 중 약 5%에서는 림프절 전이가 갑상선 암보다 먼저 진단된다. 일반적으로 림프절 전이는 먼저 중심 림프절, 동측 측경부 림프절로 전이되고 반대측 측경부 림프절 및 종격 상부(superior mediastinal) 림프절 순으로 나타난다. 이러한 림프절 전이는 생존율에 영향을 미치지는 않지만 국소재발 및 원격전이의 위험을 증가시킨다. 따라서 중심 림프절의 전이 여부를 파악하여 림프절 절제범위를 결정하는 것이 국소재발을 줄이는 데 있어 중요하다. 그러나 경부 초음파를 통한 중심 림프절 전이의 진단은 감도가 떨어져 약 10% 정도로 보고되고 있다
그러므로 본 발명의 갑상선 유두암종의 림프절로의 전이 판단 방법은 이러한 판단을 결정하는데 있어 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 일 관점에서 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 발현 패턴을 확인하는 방법 및 이의 마커로서의 용도에 관한 것이다.
유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 림프절 전이 진단 마커는, 갑상선암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.
본 발명자들은 단독 샘(isolated gland) 및 측면관상성장(lateral tubular growth)이 종양세포의 림프절 전이와 관련성이 높다는 사실을 발견하고, 이를 확인하기 위해 사이클린 D1의 발현패턴을 분석함으로써 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단에 대한 정보제공에 활용할 수 있음을 처음으로 규명하였다.
본 발명자들은 갑상선 유두암종에서 사이클린 D1 면역조직화학염색을 통해 확인되는 특이한 성장 양식인 단독 샘(isolated gland) 및 측면관상성장(lateral tubular growth)을 처음으로 명명하고 그 종양생물학적 의의도 처음으로 규명하였다.
사이클린(Cyclin) D1은 세포주기 조절에 관여하는 cyclin 단백계열 중 종양발생과 가장 관련이 깊은 것으로 알려져 있으며 cyclin D1 유전자는 11q13에 위치하여 유전자 증폭이나 과발현으로 망막모세포종 유전자(retinoblastoma gene, Rb) 단백을 인산화시켜 Rb단백의 세포주기 억제기능이 불활성화되면 세포주기상 G1상태가 S상태로 이행되는 과정을 촉진하여 세포의 증식을 유도한다. 종양세포 내에서 cyclin D1의 발현은 이러한 세포주기 조절단백이 종양발생에 기여함을 암시한다.
따라서 대부분의 암종이 사이클린 D1 양성을 나타내고, 종래 갑상선 유두암종에서 사이클린 D1의 과발현이 림프절 전이의 예측마커로 간주되어 왔다. 그러나 사이클린 D1의 과발현과 림프절 전이 사이의 연관성에 대해서는 지금까지 명확한 결론은 없는 상태이다.
이에, 본 발명자들은 갑상선 유두암종에서 림프절 전이가 일어나는 경우, 사이클린 D1의 독특한 발현 패턴이 관찰됨을 발견하였다. 즉, 림프절 전이에 따른 독특한 임상병리학적 특징인단독 샘(isolated gland)의 존재 및 “측면관상성장(lateral tubular growth)”이 일어나는 것을 사이클린 D1의 면역 조직화학적 염색에 의해 검출함으로써 진단할 수 있음을 확인하였다.
갑상선은 갑상선내 협부(isthmus)을 통해 엽(lobe) 사이에 서로 통신하여 경부 림프절로 보내는 림프관의 풍부한 네트워크를 가지고 있고, 갑상선 내 전이 경부림프절 전이는 이러한 풍부한 림프관 네트워크를 통해 일어난다. 이러한 림프절 전이의 위험성과 관련된 갑상선 암종 성장의 독특한 패턴을 본 발명자가 발견하였다.
따라서 본 발명은 단독 샘(isolated gland) 및 측면 관상성장이 림프절 전이를 위한 독립적인 위험인자로서의 용도에 관한 것이다.
종양 외 영역에서 발견되는 갑상선 유두암종 세포의 개별적인 샘(gland)으로 정의되는 단독 샘(isolated gland)은 갑상선 유두암종의 독특한 조직학적 특징을 가지며, 이는 종양 다발성과 명백히 다른 특징이다. 이러한 단독 샘(isolated gland)은 유두암종 세포가 한 층으로 배열된 관을 형성하는 구조이며, 종양의 침윤성 성장이나 림프관 침윤과도 다른 소견이다. 사이클린 D1의 면역조직화학염색에 의해 단독 샘(isolated gland) 존재 유무를 정확하게 검출할 수 있다.
한편, “측면관상성장(lateral tubular growth)”은 종양의 침윤성 전면 주위의 섬유성 격막(fibrous septa)을 따라 관상 성장이 측면으로 퍼지는 것을 말하며, 이는 사이클린 D1의 면역조직화학염색에 의해 검출할 수 있는 것이다. 측면관상성장은 림프관 침윤과는 다른 소견이지만 일부의 측면관상성장에서 림프관 침윤을 보일 수는 있다.
본 발명의 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 패턴을 확인하는 방법은, 유사한 측면에서, 갑상선암, 바람직하게는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 여부를 진단하는 방법을 의미한다.
본 발명의 상기 방법은 갑상선암 환자로부터 시료를 수득하는 단계를 포함한다. 갑상선암 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액등으로부터 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 갑상선 유두암종(papillary thyroid carcinomas)을 갖는 환자로부터 시료를 추출하였다.
그리고 상기 시료에 대하여 단독 샘(isolated gland) 및 측면 관상성장 여부에 대한 정보를 얻기 위해 사이클린(cyclin) D1의 패턴을 확인하는 방법을 포함한다. 특히, 사이클린(cyclin) D1의 패턴을 면역조직화학염색으로 확인하는 것이 바람직하다. 이때, 사이클린 D1의 면역조직화학염색을 위해서는 사이클린(cyclin) D1 항체와 항원-항체 반응을 검출하기 위한 면역염색 디텍션 키트와 같은 시약을 사용할 수 있다.
다시 말해, 본 발명의 일 구체예서 림프절 전이 진단방법은 암세포 조직 또는 샘플에서 사이클린 D1의 염색패턴(발현패턴)을 조사하는 것에 관한 것이고, 여기서 상기 사이클린 D1의 염색패턴은 갑상선암의 림프절 전이 여부를 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.
상기 방법은 포유동물의 암 조직 또는 암 세포 샘플에서 사이클린 D1 단백질발현 패턴을 조사 또는 시험하는 프로토콜을 포함한다. 예를 들어 면역조직화학적 분석, 면역침전, 웨스턴 블럿 분석, 분자 결합 분석, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 등을 포함한다. 바람직하게는 면역조직화학염색 방법을 사용한다.
우선, 샘플 제조를 위해, 포유동물 (일반적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 암 세포, 예를 들어 갑상선암 세포, 갑상선 유두암종 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동되거나 포르말린에 고정될 수 있다.
조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉 보존)될 수 있다. 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정액을 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정액에 따라 결정됨을 이해할 것이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 샘플에서 사이클린 D1 단백질의 발현패턴은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사하였다. 조직 절편의 면역조직화학염색은 샘플에서 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 항원에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 세포나 조직내에서 세포 항원을 가시화시킨다.
면역조직화학염색은 세포나 조직내의 항원을 가시화하는 방법으로 미분화세포의 기원을 확인하거나 효소, 호르몬, 종양표지자 및 예후 인자의 존재유무, 그리고 암종과 육종의 구별 및 양성종양과 악성종양의 감별 등에 효율적으로 이용되고 있으며, 최근에는 항암제의 감수성을 예측하는 중요한 방법으로 사용되고 있다.
면역조직화학염색의 기본적인 방법은 파라핀절편을 이용하여 조직내의 특정 항원에 대한 일차항체를 반응시킨 다음, 효소(HRP)표지 이차항체를 결합시키고 그 효소활성을 가시화하여 발현여부와 발현 부위를 현미경하에서 직접 관찰하는 것이다. 최근에는 항원-항체반응의 발색 민감도를 높이기 위해 다수의 효소가 붙어 있는 고분자 중합체(polymer)를 항체에 결합시키는 방법을 사용하고 있다.
유사한 관점에서 본 발명은 인간의 갑상선암 림프절 전이 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 키트 역시 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상성장(lateral tubular growth) 패턴을 분석하여 갑상선암의 림프절 전이 유무를 판단하는데 쓰이는데, 앞서 설명한 바와 같이, 이는 사이클린 D1의 염색패턴 확인 방법으로 실시할 수 있다.
본 발명의 키트는 염색시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 인간 갑상선암 림프절 전이 진단용 키트가 면역염색 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 갑상선암 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 항체를 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.
표지로 사용될 수 있는 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물,바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ]2+,[RU(bpy) 3 ]2+, [MO(CN) 8 ]4-등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I ,186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 키트 검출 결과에 기초하여 갑상선암의 림프절 전이 여부를 진단한다.
한편, 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, 갑상선암 림프절 전이를 억제시키는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 스크리닝 방법은, 바람직하게,
(a) 후보 물질의 존재하에, 갑상선 유두암종 세포에서 사이클린(cyclin) D1 염색을 통해 측면관상성장(lateral tubular growth)을 확인하는 단계; 및
(b) 후보물질이 없는 경우와 비교하여, 상기 측면관상성장(lateral tubular growth)이 억제되는 경우의 후보물질을 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 방법은 당업계에서 공지되어 있는 일반적인 방법으로도 수행될 수 있다.
한편, 본 발명자는 BRAFV600E 변이가 한국 갑상선 유두암종 환자들에서 검출됨을 발견하였다. 그러나, 상기 변이는 나이, 성, 종양크기, 종양성장패턴, 여포변이(follicular variant), 다발성 또는 림프절 전이와는 현저한 관련성을 보이지는 않았다.
또한, 한국에서 BRAFV600E 변이는 하시모토 갑상선염(hashimoto thyroiditis)과 동반하는 경우보다 이의 동반없이 갑상선 유두암종에서 더욱 빈번히 검출되어 왔다. 본 발명의 참고예 실험에서도 하시모토 갑상선염이 없는 환자에게서 상기 변이가 발견되었다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 갑상선암, 특히 갑상선 유두암종 환자에게서 림프절 전이가 일어난 경우, 단독 샘(isolated gland) 존재 또는 측면관상성장(lateral tubular growth)이 일어난다는 것을 보여 주었고, 이는 사이클린 D1의 염색패턴을 이용하여 확인할 수 있다.
이러한 시스템은 임상적용에서 유용한 예측도구가 될 수 있다. 예를 들어, 경부 림프절 전이의 리스크를 예측할 수 있고, 림프절 상태가 환자 치료 결정에 영향을 끼치게 될 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
하기 실시예에서 수행하는 본 실험들은 가톨릭대학교 서울성모병원의 IRB(institutional review board)로부터 승인을 받았다(KC09EISI0355).
< 실시예 1>
면역조직화학 분석
<1-1> 샘플 준비
2008년 10월부터 2009년 6월 사이에 서울성모병원에서 갑상선 유두암종에 대한 갑상선 적출술(thyroidectomy) 및 경부 림프절 절제를 받은 총 210명의 환자들(174 여자 및 36 남자)을 대상으로 분석하였다. 모든 환자들은 세침흡입세포검사(fine needle aspiration cytology) 또는 수술중 동결조직절편검사을 기초로 갑상선 유두암종으로 진단받았다. 어떠한 환자에게서도 방사선 노출 과거력은 없었다. 수술시 환자들의 나이는 22 내지 75세(평균 48세)였다. 다발성 종양의 경우, 가장 큰 종양은 일차 병변으로 간주되었다. 모든 검체는 환자로부터 동의하에 수집하였다.
<1-2> 면역조직화학염색
상기 <1-1>에서 각 환자들로부터 수득한 종양조직을 포르말린으로 고정시킨 후 파라핀에 포매한 다음 4 μm 두께로 박절한 다음 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 60℃ 오븐에 한 시간 동안 넣고, 자일렌으로 파라핀을 제거한 후, 물에 농도별 에탄올으로 재수화하였다. 15분 동안 최종 온도가 121℃의 마이크로웨이브 진공 히스토프로세서 (RHS-1, Milestone, Bergamo, Italy)에서 샘플을 가열시키고 구연산염 완충물(citrate buffer [pH 6.0])을 이용하여 항원을 복구하였다. 이후 10분 동안 메탄올에서 3% 과산화수소에 상기 슬라이드를 배양함으로써, 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하였다. 면역조직화학 분석을 위해 자동화된 면역조직화학 염색기(Lab Vision Autostainer LV-1; LabVision/Neomarkers, Fremont, CA, USA)에 상기 슬라이드를 두고, 사이클린 D1 토끼 단일클론 항체(Clone SP4, 1:100, Thermo Scientific, Fremont, CA, USA)와 함께 30분 동안 배양하였다. 상기 일차 항체는 DAKO Antibody Diluent (DAKO, Carpinteria, CA, USA)로 희석하였다. 이후, Envision Plus System (DAKO)를 이용하여 이들을 검출하였으며, 면역반응을 5분 동안 디아미노벤지딘(diaminobenzidine, DAKO)으로 발색한 후, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비 염색하였다. 이때 모든 염색과정에서 MCL(mantle cell lymphoma) 절편들을 양성 대조군으로 사용하였고, 음성 대조군으로는, 슬라이드를 일차 항체 없이 염색하였다.
또한, 사이클린 D1 염색은 핵에 염색 되는 것만 양성결과로 간주하였으며, 사이클린D1을 발현하는 종양 세포는 항상 강한 염색 강도를 보이기 때문에, 염색 강도는 고려하지 않고 염색되는 종양세포가 전체 종양 세포의 몇 퍼센트를 차지하는 지에 따라 다음과 같이 점수화 하였다.
1점 : 1~10%;
2점 : 11~25%;
3점 : 26~50%;
4점 : 51~75%;
5점 : 76~100%.
<1-3> 통계학적 분석
림프절 전이 상태와 예측인자들 사이의 상관관계를 분석하기 위하여, x2 또는 Fisher's exact test를 이용하였다. 림프절 전이의 위험성과 통계적으로 관련이 있는 인자들은 단계적 로지스틱 회귀분석(stepwise logistic regression analysis)을 이용하여 다변량 분석으로 검정하였다. p값이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 인정하였고, 통계학적 분석은 SPSS (version 13.0 SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하였다
상기와 같은 방법에 따른 분석 결과, 갑상선 유두암종의 210명의 환자들 중 70%인 147명의 환자들이 10mm 이하의 갑상선 미세유두암종을 가지고 있었으며, 210명의 환자 중 54%는 중심림프절(central lymph node)에 전이가 있었고 6%는 측부림프절(lateral lymph node)에 전이가 있었다.
사이클린 D1은 종양에 따라 다양한 발현 양상을 보였으나(1점:1.4%, 2점: 11.4%, 3점:11.0%, 4점:9.5%, 5점:66.7%), 염색 정도와 무관하게 항상 모든 침습적 경계면에 있는 종양세포에는 발현되었다. 정상 조직은 사이클린 D1에 대해 음성이었다. 종양세포는 사이클린 D1에 강한 핵 발현과 함께 세포질에서도 양성을 보이는 반면, 비종양성 세포에서 사이클린 D1이 발현되는 경우에는 국소적으로만 발현되며, 핵에서만 발현되고 세포질 발현은 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명자들은 사이클린 D1 염색을 이용하여 종양세포와 비종양세포를 구분하고 종양의 범위를 정확하게 알아내었다. 사이클린 D1은 종양의 침습적 경계면에는 항상 발현되기 때문에 사이클린 D1 염색을 통해 침습적 경계면 주위의 섬유성 격막(fibrous septa)을 따라 종양세포가 관상 성장하는 것을 쉽게 찾아 낼 수 있었다. 그리고 원발종양과 떨어진 종양 바깥 영역에서 종양세포의 단독 샘(isolated gland) 구조가 발견되었다. 상기 단독 샘(isolated gland)은 갑상선 유두암종 세포의 개별적인 샘(gland)으로서, 원발종양으로부터 최소 500μm 이상 떨어진 영역에서 발견되는 것으로 정의하였다. 측면 관상성장의 성장 패턴 및 단독 샘은 사이클린 면역염색된 슬라이드에서 쉽게 확인할 수 있었다. 통상적인 헤마톡실린-에오신 염색된 슬라이드에서는 발견되지 않거나 구분하기 어려웠다. 또한, 이상과 같은 결과는 도 1 및 도 2를 통해 확인할 수 있었는데, 도 1의 a는 0.4cm 크기의 갑상선 미세유두암종을 나타내고, 사이클린 발현을 b에서 보여주었다. 특히 종양세포의 핵 및 세포질에서의 사이클린 D1에 대한 면역반응성을 c에서 확인할 수 있었다. a, b, d 및 e에서 화살표는 종양성장이 섬유성 격막을 따라 측면으로 뻗어나가는 것을 나타내며, (e, g) 및 (f, g)에서도 사이클린 D1의 염색에 의해 이러한 성장 패턴이 쉽게 관찰되어졌다.
또한, 도 2의 a는 0.6cm 사이즈의 갑상선 미세 유두암종을 나타내고, 사이클린 발현을 b에서 보여주었다. c에서는 사이클린 D1의 면역염색이 종양세포를 부각시키고 있음을 나타낸다. d에서 화살표는 단독 샘을 나타내는데, 특히 종양 침습적 경계면으로부터 최소 500μm 떨어진 영역에서 발견되었다. 도 2의 e는 0.5cm 크기의 갑상선 미세유두암종이며, 이의 사이클린 D1 면역염색을 f에서 나타내되, 단독 샘을 화살표로 표시하였다.
< 실시예 2>
단변량분석 ( Univariate Aanlysis ) 및 다변량분석( Multivariate Analysis )
<2-1> 단변량분석
단변량 분석에 따라, 림프절 전이가 일어난 갑상선 유두암종은 이하와 같은 특성을 가짐을 확인하였다.
45세 이하의 나이(P<0.001)
큰 종양 사이즈(>10mm, P<0.001)
비-여포변이(non-follicular variant, P=0.005)
침윤성 성장 패턴(P=0.007)
갑상선 바깥 침윤(P=0.006)
다발성(P=0.005)
구체적인 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
추가로 147명의 갑상선 미세유두암종에서 림프절 전이와 임상병리학적 변수 사이의 상관관계를 분석하였고, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure pat00002
상기 결과를 통해 특히 45세 이하의 나이(P<0.001), 침윤성 성장 패턴(P=0.001), 측면 관상 성장(P<0.001), 갑상선 바깥 침윤(P=0.006) 및 다발성(P=0.005)의 특성들은 림프절 전이가 있는 갑상선 미세유두암종에서 더 많이 관찰되었다.
<2-2> 다변량 분석
갑상선 유두암종에서 림프절 전이의 독립적인 예측인자를 찾기 위하여, 단계별 로지스틱 회귀방법을 이용하여 다변량 분석을 수행하였으며, 210명의 환자들을 대상으로 한 결과를 표 3에 나타내었고 대표적인 특성들은 이하와 같다:
45세 이하의 나이(P=0.001, OR=5.146)
큰 종양 사이즈(>10mm, P=0.034, OR=3.119)
단독 샘(P<0.001,OR=21.042)
측면 관상성장(P<0.001,OR=24.652)
Figure pat00003
그리고 그 중 147명의 갑상선 미세유두암종 자들을 대상으로 한 결과를 표 4에 나타내었다. 대표적인 특성들은 이하와 같다:
45세 이하의 나이(P=0.001, OR=6.353)
단독 샘(P<0.001,OR=17.937)
측면 관상성장(P<0.001,OR=25.729) (표 5)
Figure pat00004
< 참고예 1> BRAF V600E 변이
<1-1> DNA 추출
QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 각 암종 블럭의 대표적인 부분을 함유하는 10-μm-두께 파라핀 절편으로부터 유전자 DNA를 추출하였다. 상기 추출은 당업계에 공지된 조직으로부터 DNA를 분리하는 방법을 사용하여 수행하였고, 이때 종양세포 영역은 조직 절편으로부터 수작업으로 잘라냈다.
<1-2> BRAF 유전자의 엑손 15의 시퀀싱
BRAF 유전자의 엑손 15의 224bp를 PCR법으로 증폭시켰다. 이 때 이용한 프라이머 쌍은 이하와 같다.
forward primer 5-TCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3'(서열번호 1)
reverse primer 5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'(서열번호 2)
또한, PCR 수행조건은 다음과 같이 세팅하였다: 즉, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 35 사이클. 음성 대조군으로 주형 DNA 대신 물을 사용하였다. PCR이 완료된 후의 산물들은 2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가하였고, 겔로부터 그들을 추출한 후 HiYieldTMGel/PCR DNA Extraction Kit (RBC bioscience, Taipei, Taiwan)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 ABI-PRISM BigDye Terminator version 3.1 (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)을 이용하여 DNA 시퀀싱 반응에 사용하였다. 상기 시퀀싱은 PCR에서 사용하였던 동일한 프라이머를 사용하여 양 방향으로 수행하였다. 시퀀싱 반응은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 60℃에서 4분동안 25 사이클을 수행하였고, ABI PRISM 3100 DNA Analyzer(Applied Biosystems)를 이용하여 시퀀싱 데이터를 생성시키고, 상기 시퀀스를 Sequencer 3.1.1.software (Applied Biosystems)를 이용하여 분석하고 비교하였다.
그 결과, BRAFV600E 돌연변이가 210명의 환자 중 162명에서 관찰되었다. 일변량 분석결과에서도, BRAFV600E 변이는 갑상선 바깥 침윤(P=0.007) 및 하시모토 갑상선이 동반되는 낮은 빈도수와 관련성을 가지고 있었다, 그러나 다른 임상병리학적 변수들을 변이와 관련성이 없는 것으로 나타났으며, 이를 하기 표 5에 나타내었다.
Figure pat00005
또한, 본 발명자들은 한국 갑상선 유두암종 환자에서 BRAFV600E 돌연변이를 발견하였다. 그러나 상기 변이는 나이, 성, 종양크기, 종양성장패턴, 여포변이(follicular variant), 다발성 또는 림프절 전이와는 현저한 관련성을 보이지는 않았다.
그리고 한국에서, BRAFV600E 돌연변이는 하시모토 갑상선염(hashimoto thyroiditis)을 동반하는 경우보다 갑상선염을 동반하지 않은 갑상선 유두암종에서 더욱 빈번히 검출되어 왔다. 본 발명에서도 하시모토 갑상선염이 있는 환자는 56%의 BRAFV600E 돌연변이율을 보인 반면, 갑상선염이 없는 환자는 79%의 BRAFV600E 돌연변이율을 보여 유의한 차이를 보였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> A Method for Diagnosing the Risk of Lymph Node Metastasis in Papillary Thyroid Carcinoma <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF exon 15 F-primer <400> 1 tcataatgct tgctctgata gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF exon 15 R-primer <400> 2 ggccaaaaat ttaatcagtg ga 22

Claims (9)

  1. 림프절 전이 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 사이클린(cyclin) D1의 발현 패턴을 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 림프절 전이는 유두암종, 여포암종, 저분화갑상선암종, 미분화암종 및 수질암종으로 이루어진 군 중에서 선택되는 갑상선암에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 림프절 전이는 갑상선 유두암종(papillary thyroid carcinoma)에서 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 확인은 사이클린(cyclin) D1의 면역조직화학염색 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 정보는 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth) 유무에 대한 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 측면관상 성장(lateral tubular growth)은 섬유성 격막내에서 발견됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 시료, 사이클린 D1 항체 및 표지물질을 포함하는, 갑상선 유두암종의 림프절 전이 진단용 키트.
  9. (a) 후보 물질의 존재하에, 갑상선 유두암종 세포에서 사이클린(cyclin) D1 염색을 통해 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth)을 확인하는 단계; 및
    (b) 후보물질이 없는 경우와 비교하여, 상기 단독 샘(isolated gland) 또는 측면관상 성장(lateral tubular growth)이 억제되는 경우의 후보물질을 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질로 선택하는 단계를 포함하는 갑상선 유두암종의 림프절 전이 억제용 물질의 스크리닝 방법.
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US10656059B2 (en) 2018-03-07 2020-05-19 Alcala Pharmaceutical, Inc. Method for qualitative and quantitative multiplexing of drug analytes from biological samples
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