CN106701964B - 血清外泌体miRNA生物标志物及用于胃癌早期诊断的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清外泌体miRNA生物标志物及用于胃癌早期诊断的试剂盒,该血清外泌体miRNA生物标志物由miR‑19b和miR‑106a组成。本发明使用血清外泌体miRNA,特别是从与胃癌发生密切相关的两个miRNA(hsa‑miR‑19b‑3p联合hsa‑miR‑106a‑5p)作为胃癌早期诊断标志物,用于诊断早期胃癌优于现有的胃镜等临床手段,具有较好的特异性和灵敏度。所述试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成,具有胃癌早期诊断的较好的临床应用价值,为提高胃癌早期诊断水平提供新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,特别涉及血清外泌体miRNA生物标志物及用于胃癌早期诊断的试剂盒。
背景技术
随着发病率和死亡率的增加,癌症已成为危害世界公众健康的主要原因。根据最新的统计数据显示,在中国,胃癌仍然是癌症死亡的第二大原因。虽然显著改善的手术技术并结合放疗和化疗,能延长早期胃癌患者的生存期,但晚期患者的预后仍然不容乐观。因此,在临床上迫切需要更加可靠和便捷的胃癌早期诊断方法。目前,胃镜检查仍是标准诊断胃癌的金标准,由于这种方法具有创伤性和局限性,并不适用于每个患者的检查。除此之外,虽然临床上也有一些非侵入性或微创性诊断标志物的应用,如癌胚抗原(CEA)和CA19-9,但其灵敏度和特异性不足以满足胃癌的早期检测。
miRNA是一种内源性的,长度约为22nt的非编码RNA,其主要通过转录后抑制或诱导信使RNA的降解来调节癌基因或抑癌基因的表达和功能。大量研究表明,miRNA在不同肿瘤中特异性表达,并且可以区分正常和肿瘤组织。此外,也有研究证实,循环miRNA可以作为各种疾病的诊断标志物,包括癌症。但循环miRNA作为诊断标志物因其很容易受受损细胞释放的miRNA的影响,具有一定的局限性。
因此,临床上急需新的无创性的有效的胃癌诊断标志物。
发明内容
针对上述胃癌早期诊断中存在的不足,本发明的目的在于提供一种血清外泌体miRNA生物标志物及用于胃癌早期诊断的试剂盒,本发明使用血清外泌体miRNA,特别是从与胃癌发生密切相关的两个miRNA(hsa-miR-19b-3p联合hsa-miR-106a-5p)作为胃癌早期诊断标志物,用于诊断早期胃癌优于现有的胃镜等临床手段,具有较好的特异性和灵敏度。所述试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成,具有胃癌早期诊断的较好的临床应用价值,为提高胃癌早期诊断水平提供新的思路和方法。
本发明的技术方案是:
血清外泌体miRNA生物标志物,该miRNA标志物由miR-19b和miR-106a组成。
所述miR-19b的序列如SEQ ID NO.1所示,所述miR-106a的序列如SEQ ID NO.2所示。
上述血清外泌体miRNA生物标志物作为胃癌早期联合诊断生物标志的应用。
用于人胃癌早期诊断的miRNA检测的试剂盒,包含采用上述血清外泌体miRNA生物标志物作为探针。
所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。
所述试剂盒进行检测的具体方法为:
1.血液处理、血清外泌体分离及外泌体RNA的提取
血液被收集在血清促凝管中,然后400g离心15分钟,收集血清,储存于-80℃备用。采用血清外泌体提取试剂(SBI,EXOQ20A-1)提取血清外泌体,500ul血清加入外泌体提取试剂126ul。然后用200ul PBS重悬所分离的外泌体。采用mirVanaTM PARISTM Kit(Ambion,#AM1556)试剂提取血清外泌体RNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。利用QubitTM 3.0荧光计测量血清外泌体RNA浓度。
2.血清外泌体RNA(miR-19b和miR-106a)的检测
使用hsa-miR-19b-3p,hsa-miR-106a-5p和cel-miR-39(外参)特异性探针检测血清外泌体中各miRNA的表达。将提取的总RNAs稀释为10ng/μL,采用逆转录试剂(ABI,#4427975)按下列体系进行逆转录反应:无核酶水1.887ul,10X RT buffer 0.5ul,dNTPsMix 0.05ul,RNase Inhibitor 0.063ul,Mul-RT-Enzyme0.33ul,miRNA RT probe 0.5ul,RNA 1.67ul。反应条件:将装有上述混合液的离心管置于PCR仪上,设置反应参数为16℃,30min;42℃,30min;85℃,5min;4℃保存。将cDNA稀释2倍。然后采用Premix Ex TqTM(Takara,#RR390B)和每个miRNA特异性探针试剂进行定量扩增反应,反应体系为:5ulPremix Ex TqTM,0.25ul miRNA Probe,2.75ul无核酶水,2ul cDNA。反应条件如下:将装有上述混合液的离心管置于CFX9定量PCR仪96孔上,设置参数为95℃,2min;40个循环于95℃,15s;60℃,30s,在60℃采集荧光。
由于外泌体是由各种细胞分泌的直径为30-120nm的微囊泡,广泛存在于人的体液中,包括唾液、血液、尿液和母乳等。其能介导核酸和蛋白质在体内不同位置传递和运输。大量研究发现,外泌体能够保护循环系统中的miRNA避免被内源性RNA酶的降解,从而提高miRNA在循环系统中的稳定性。此外,外泌体也被认为是肿瘤细胞传递miRNA到循环系统中的方式,能间接反映肿瘤细胞中miRNA的变化。因此,胃癌患者血清外泌体中的miRNA有希望成为胃癌早期诊断标志物。
本发明本发明对胃癌患者血清外泌体中四个与胃癌发生相关的miRNA(hsa-miR-19b-3p,hsa-miR-17-5p,hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-106a-5p)进行了检测研究。研究结果表明,miR-19b和miR-106a在胃癌患者血清外泌体中显著高表达,与单独的miRNA相比,由miR-19b联合miR-106a组成的miRNA-panel更能提高胃癌诊断的灵敏度和特异性。采用miR-19b联合miR-106a作为胃癌早期诊断标志物,可以避免胃镜检查造成的创伤,也比其他非侵入性或微创性诊断标志物,如AFP和CA19-9更灵敏和特异,为提高胃癌早期诊断水平提供了新的思路和方法。
血清外泌体miR-19b联合miR-106a用于诊断早期胃癌优于胃镜等现有临床手段,具有较好的特异性和灵敏度。同时,本发明还开发了用于检测miR-19b和miR-106a的诊断试剂盒及检测方法,试剂盒由特异性扩增引物以及通用PCR扩增试剂组成。本发明在胃癌早期诊断方面具有较好的临床应用价值。
附图说明
图1为血清外泌体的特征分析;其中,图1A为透射电镜分析的血清外泌体形态;图1B为免疫印迹分析CD63蛋白在所提取的血清外泌体中的表达;
图2为血清外泌体中miRNA在胃癌患者(初筛实验)中的表达情况;其中,图2A为hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-106a-5p在胃癌患者中的表达情况;图2B为hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-106a-5p的ROC曲线;图2C为hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-106a-5p组成的miRNA-panel的ROC曲线;图2D为miR-19b-3p和miR-106a-5p在血清外泌体中的分布情况;
图3为血清外泌体中miRNA在胃癌患者(验证和单盲实验)中的表达情况;其中,图3A为miR-19b-3p和miR-106a-5p在胃癌血清外泌体中的表达;图3B为由miR-19b-3p和miR-106a-5p组成的miRNA-panel的AUC面积;图3C为目前临床上常见的癌症诊断标志物AFP和CA19-9的AUC面积;
图4为miR-19b-3p和miR-106a-5p表达的spearman相关性分析发现。
具体实施方式
以下是对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中严格按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan microRNA Assay(包括cel-miR-39,miR-19b-3p,miR-17-5p,miR-106a-5p和miR-30a-5p)购于Invitrogen公司;
逆转录试剂Premix Ex TqTM(probe qPCR)购于TAKARA公司;
mirVanaTM PARISTM Kit购于Ambion;
CD63一抗购于Abcam公司;
ExoQuick Exosome precipitation Solution试剂购于SBI公司;
外参cel-miR-39购于RIBOBIO公司。
其余试剂采用市售的分析纯。
实施例1血清样本的收集
血清样本共收集310例,其中150名组织病理学确诊的胃癌患者血清和160名健康对照者血清。所有血清样本均来自于中国人民解放军第三军医大学第一附属医院,且与参与患者签订了书面知情同意书并得到了医院伦理委员会的批准。溶血、脂血和其他异常血清被排除在外。
最终研究入组的血清外泌体样本为204例,包括100例胃癌患者和104例正常对照。
miR-19b和miR-106a的表达与胃癌患者的临床特征的关系如表1所示。候选miRNA的表达与年龄(miR-19b,p=0.598;miR-106a,p=0.111),性别(miR-19b,p=0.114;miR-106a,p=0.074),淋巴转移(miR-19b,p=0.632;miR-106a,p=0.833)及的病理分型(miR-19b,p=0.808;miR-106a,p=0.768)无关。然而,不同的肿瘤位置会影响miR-106a的表达,其中表达最高的是贲门(p=0.030),胃体表达最低。此外,候选的miRNA的表达也与肿瘤分期分级相关,候选miRNA在I-II中的表达显著高于III-IV期(miR-19b,p=0.039;miR-106a,p=0.016)。
表1 miR-19b和miR-106a的表达与胃癌患者临床特征的关系
实施例2外泌体miRNA的提取
血液收集于血清促凝管,然后400g离心15分钟,收集血清,储存于-80℃备用。根据血清外泌体的提取试剂说明书(SBI,EXOQ20A-1)提取血清外泌体。然后用200ul PBS重悬所分离的外泌体,并通过透射电子显微镜检测外泌体的形态。根据mirVana PARIS Kit(Ambion,#AM1556)试剂说明书提取血清外泌体miRNA。因为在血清中没有公认的内源性miRNA作为内参,外加的50nM cel-miR-39(锐博)作为参照。通过QubitTM3.0荧光计检测所提RNA浓度。同时,用细胞裂解缓冲液裂解血清外泌体,12000rpm离心15min,收集上清,BCA法测定蛋白浓度,然后分别取1ug,0.5ug蛋白,经10%SDS-PAGE分离后,湿法转印至PVDF膜上,用3%BSA封闭PVDF膜,用抗CD63兔多克隆抗体(1:1000稀释)孵育过夜,再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG孵育40min,用持久性化学发光底物试剂(supersignal west duraextended duration substrate)处理并曝光显示,结果如图1B所示,其表达量呈一定的外泌体浓度依赖性。
通过透射电镜分析由ExoQuickTM提取的血清外泌体形态如图1A所示。
实施例3RT-qPCR检测外泌体miRNA的初筛实验
使用hsa-miR-19b-3p,hsa-miR-106a-5p,hsa-miR-30a-3p,hsa-miR-17-5p和cel-miR-39特异性探针检测血清外泌体中各miRNA的表达。
根据逆转录试剂说明书(ABI,#4427975),每个样本加入16.7ng(1.67μL)的总RNA到5μL反应逆转录反应体系中。然后根据Premix Ex TqTM(Takara,#RR390B)和每个miRNA特异性探针试剂说明书进行RT-qPCR反应。使用Mann-Whitney t检验方法统计实验所得数据,P值小于0.05且变化倍数大于1.5倍被认为具有统计学意义。
我们在20个胃癌患者和20个正常对照的血清外泌体中比较了这四个miRNA的表达水平,发现hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-106a-5p在胃癌患者中显著高表达(P<0.001,图2A)。进一步利用这两个miRNA在血清外泌体中的浓度生成ROC曲线,结果发现由miR-19b-3p和miR-106a-5p AUC面积分别是0.813(95%可信区间(CI)为0.678-0.948)和0.813(95%CI为0.679-0.948)(图2B)。此外,这两个miRNA组成的miRNA-panel具有更好诊断价值,其AUC面积为0.826(95%CI为0.694-0.958;图2C)。此外,实验表明miR-19b-3p和miR-106a-5p主要存在于血清外泌体中(图2D)。这些结果表明,miR-19b-3p联合miR-106a-5p是有用的稳定的胃癌诊断标志物。
实施例4RT-qPCR检测外泌体miRNA的验证和单盲实验
为了进一步验证初筛结果,我们扩大了样本检测,包括70例胃癌患者和70例正常对照。结果得到了同初筛一致的结论,miR-19b-3p和miR-106a-5p在胃癌血清外泌体中显著高表达,如图3A所示,并且由miR-19b-3p和miR-106a-5p组成的miRNA-panel AUC面积为0.723,如图3B所示。并且显著高于临床上常见的癌症诊断标志物AFP,其AUC面积为0.545(95%置信区间:0.545—0.464)和CA19-9为0.520(95%置信区间:0.520—0.408),如图3C所示。
实施例5相关性分析
Spearman相关性分析发现miR-19b-3p和miR-106a-5p的表达呈显著正相关,R值为0.575(95%CI,0.411-0.703)和P<0.0001(如图4)。然而,没有一个miRNA的表达与临床常见癌症诊断标志物AFP、CA19-19表达水平相关,这说明miR-19b和miR-106a是独立的诊断标志物(如表2所示)。
表2 miRNA的表达与临床常见癌症诊断标志物AFP、CA19-19表达水平的关系
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120>血清外泌体miRNA生物标志物及用于胃癌早期诊断的试剂盒
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> miR-19b的基因序列
<400> 1
ugugcaaauc caugcaaaac uga 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> miR-106a的基因序列
<400> 1
aaaagugcuu acagugcagg uag 23
Claims (2)
1.一种与胃癌相关的血清外泌体miRNA生物标志物在制备胃癌早期诊断的产品中的应用,所述miRNA生物标志物由miR-19b和miR-106a组成。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述miR-19b的序列如SEQ ID NO.1所示,所述miR-106a的序列如SEQ ID NO.2所示。
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