CN108950003A - 一种用于诊断乳腺癌的miRNA标志物及其miRNA的应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于诊断乳腺癌的miRNA标志物及其miRNA的应用，所述标志物为miR‑26b‑5p、miR‑106b‑5p、miR‑142‑3p、miR‑142‑5p、miR‑185‑5p和miR‑362‑5p中的一种或几种组合；miR‑26b‑5p、miR‑106b‑5p、miR‑142‑3p、miR‑142‑5p、miR‑185‑5p和miR‑362‑5p的序列信息分别如SEQ ID NO.1～6所示，值得注意的是miR‑185‑5p和miR‑362‑5p的联合显示出比6个miRNA中任何单个miRNA更高的AUC、灵敏度和特异性。

Description

一种用于诊断乳腺癌的miRNA标志物及其miRNA的应用
技术领域
本公开属于生物医学领域，具体涉及一种用于诊断乳腺癌的miRNA标志物及其miRNA的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
乳腺癌是世界上最常见的肿瘤，也是女性癌症死亡的主要原因。目前关于利用各种生物标志物如组织蛋白、核酸和血浆蛋白，进行乳腺癌早期检测的研究，但其真正的临床应用都很有限。因此，开发高灵敏度和特异性的检测乳腺癌的新型非侵入性生物标志物非常重要和紧迫。
微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA，通过降解或抑制其mRNA靶标的翻译在转录后水平调节基因表达，从而参与各种生理和病理过程。越来越多的证据表明癌组织中与非肿瘤组织中的miRNA表达谱明显不同，说明它们具有诊断潜力。在人类全血、血浆和血清中均发现了稳定的循环miRNA，并且已有大量研究评估miRNA在肿瘤和其他疾病中的诊断和预后潜力。然而，关于诊断乳腺癌的全血miRNA表达谱的报道很少。
发明内容
针对以上背景技术，发明人经过大量的技术研究和长期的临床实践，提供了一种诊断乳腺癌的相关产品，以及提供相关miRNA作为诊断乳腺癌标志物的应用。
在本公开的第一个方面，提供一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，所述标志物为miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合。
进一步的，所述用于诊断乳腺癌的标志物为miR-185-5p和miR-362-5p的组合。
在本公开的第二个方面，提供所述血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
在本公开的第三个方面，提供检测miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
在本公开的第四个方面，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p在乳腺癌组表达较正常人显著上调。
在本公开的第五个方面，提供miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开中的一个技术方案具有如下有益效果：
(1)本公开对6名乳腺癌患者和6名健康对照进行miRNA芯片分析。基于miRNA芯片数据，筛选出六种上调的miRNA包括miR-26b-5p，miR-106b-5p，miR-142-3p，miR-142-5p，miR-185-5p和miR-362-5p用于68名乳腺癌患者和13名健康对照的较大样品组中进一步验证。实时定量PCR数据显示，与健康对照相比，6种miRNA在乳腺癌患者全血中显著高表达。
(2)6种miRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，miR-26b-5p，miR-106b-5p，miR-142-3p，miR-142-5p，miR-185-5p和miR-362-5p的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.8891，0.8158,0.8529,0.8507,0.9050和0.9333。miR-26b-5p的敏感性和特异性分别为83.82％和84.62％，miR-106b-5p为79.41％和76.92％，miR-142-3p为97.06％和61.54％，miR-142为85.29％和76.92％，miR-185-5p为91.18％和76.92％，miR-362-5p为83.82％和100％。值得注意的是miR-185-5p和miR-362-5p显示出比其他4种miRNA更高的AUC、灵敏度和特异性。
(3)本公开用6种miRNA通过Logistic回归分析构建“miRNA谱”。结果最后回归模型中纳入的是miR-185-5p和miR-362-5p(miRNA谱＝1.451×miR-185-5p表达+3.308×miR-362-5p表达-5.499)。ROC曲线分析显示，“miRNA谱”显示出较好的预测价值，可区分乳腺癌和健康对照，AUC为0.975，敏感性和特异性分别为92.65％和92.31％。这表明“miRNA谱”作为乳腺癌的诊断标志物具有良好的性能。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1：使用miRNA芯片在乳腺癌和健康对照的全血中进行差异miRNA筛选。
图2：使用实时定量PCR对6种miRNA在乳腺癌患者全血中表达验证。
图3：ROC曲线分析miRNA的诊断价值。
图4：“miRNA谱”的ROC曲线分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，关于诊断乳腺癌的全血miRNA表达谱的报道很少。此外，单个miRNA的诊断价值可能受限于其相对较低的灵敏度和/或特异性，这可能通过几种miRNA的组合得到改善。
本公开的目的是评估血液来源的miRNA作为发现乳腺癌的生物标志物的可行性和临床效用。
在本公开一个或一些典型的实施方式中，提供一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，所述标志物为miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合。
与健康对照组相比，发现6种miRNA(miR-26b-5p，miR-106b-5p，miR-142-3p，miR-142-5p，miR-185-5p和miR-362-5p)在乳腺癌全血中上调。
miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p的序列信息分别如SEQ ID NO.1～6所示。
进一步的，确认两种miRNA(miR-185-5p和miR-362-5p)的组合检测乳腺癌具有更高的灵敏度和特异性。
在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供检测miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述试剂盒至少包括：针对miR-26b-5p的正向引物5'-GGGTTCAAGTAATTCAGG-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-106b-5p的正向引物5'-GGGTAAAGTGCTGACAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-3p的正向引物5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-5p的正向引物5'-GGGCATAAAGTAGAAAGC-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-185-5p的正向引物5'-GGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-362-5p的正向引物5'-GGGAATCCTTGGAACCTAGGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'其中的一种或多种。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述基因芯片至少包括与miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或多种的核酸序列杂交的探针。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品能够通过检测血液中miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p至少一种的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌，miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p高表达与乳腺癌的发生发展相关。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述检测血液中miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p至少一种的表达水平的产品包括：
通过实时定量PCR、RT-PCR、原位杂交、基因芯片或基因测序检测的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p至少一种表达水平以诊断乳腺癌的产品。
在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供一种用于诊断乳腺癌的产品，该产品能够通过检测血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p表达水平来诊断乳腺癌，高通量检测结果显示miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p在乳腺癌组表达较正常人显著上调。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述产品为芯片或检测试剂盒。
进一步的，所述检测试剂盒，检测体系包括反转录反应体系和实时定量PCR反应体系，所述检测试剂盒包括用于配制反转录反应体系的试剂和用于配制实时定量PCR反应体系的试剂。更进一步的，用于配制反转录反应体系的试剂至少包括针对miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p中的一种或多种的RT引物(针对miR-26b-5p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCTAT-3'
、针对miR-106b-5p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATCTGC-3'、针对miR-142-3p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCCATA-3'
、针对miR-142-5p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGTAGT-3'、针对miR-185-5p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGGA-3'
、针对miR-362-5p的RT引物5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACTCAC-3')、针对内参基因miR-16-5p的RT引物(5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCCAA-3')、反转录缓冲液、dNTP混合液、RNA酶抑制剂和反转录酶液等。
更进一步的，用于配制实时定量PCR反应体系的试剂至少包括针对miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p中的一种或多种组合的正向引物液和反向引物液，还包括针对内参基因的正向引物和反向引物(针对miR-26b-5p的正向引物5'-GGGTTCAAGTAATTCAGG-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'
、针对miR-106b-5p的正向引物5'-GGGTAAAGTGCTGACAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-3p的正向引物5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-5p的正向引物5'-GGGCATAAAGTAGAAAGC-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-185-5p的正向引物5'-GGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-362-5p的正向引物5'-GGGAATCCTTGGAACCTAGGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对内参基因hsa-miR-16-5p的正向引物5'-GGGTAGCAGCACGTAAATA-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3')，SYBR Green混合液、无核酸酶纯水等。
进一步的，所述芯片至少包括一种与miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p的核酸序列杂交的探针。
在本公开的一个或一些典型的实施方式中，提供miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
在本公开的一个或一些具体的实施方式中，所述药物为miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的抑制剂，所述miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的抑制剂是指能够降低miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合表达水平的产品，该产品包括：通过siRNA以及CRISPR介导的基因敲低策略获得的抑制miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体，以及降低miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合表达水平的化合物、组合物或试剂等。其中，通过敲低方法抑制miRNA表达水平的siRNA表达载体和Cas9-sgRNA共表达载体已经商业化，也可通过常规的技术手段制备得到。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例
临床样本
在筛选阶段，2012年2月21日至2012年7月9日在山东大学齐鲁医院收集的6名乳腺癌患者和6名年龄匹配的健康对照的全血，进行miRNA芯片检测。在验证阶段，2016年6月27日至2017年8月30日，山东大学齐鲁医院招募了68名乳腺癌患者和13名健康对照者。所有患者和对照组均为汉族女性。
收集空腹静脉全血(2ml)，并将未处理的全血样品立即储存在-80℃或液氮中直至进一步分析。所有乳腺癌血样均在手术或任何治疗之前收集。对照组样品收集于过去或现在均无恶性疾病病史或炎症的健康女性。所有参与者均获得书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。
RNA提取和标记
使用TRIzol LS(Invitrogen，USA)提取总RNA。从样品中分离RNA后，使用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power标记试剂盒(Exiqon，Vedbaek，Denmark)对miRNA进行标记。使用T4RNA连接酶，按照以下步骤用Hy3TM荧光标记物对每个样品的1μg RNA进行3’-末端标记：将溶于6μl水中的RNA与1.0μl CIP缓冲液和CIP(Exiqon)合并。将混合物在37℃下孵育30分钟，并通过在95℃下孵育5分钟，终止反应。然后向混合物中加入3μl标记缓冲液，1.5μl荧光标记物(Hy3TM)，2μl DMSO和2.0μl标记酶，在16℃孵育1小时，并通过在65℃孵育15分钟终止反应。
miRNA微阵列和数据分析
使用第7代miRCURYTM LNA Array(v.18.0)(Exiqon)在乳头溢液中筛选候选miRNA。将Hy3TM标记的样品在miRCURYTM LNA阵列(v.18.0)(Exiqon)上杂交。Hy3TM标记后的25μl样品与25μl杂交缓冲液混合，首先在95℃变性2分钟，在冰上孵育2分钟，然后在56℃下在微阵列(Hybridization System-Nimblegen Systems，Inc.，Madison，WI，USA)中杂交16-20小时。杂交后，使用洗涤缓冲液试剂盒(Exiqon)洗涤几次，最后通过在400rpm离心5分钟干燥。然后使用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪(Axon Instruments，Foster City，CA)扫描。然后将扫描的图像导入GenePix Pro 6.0软件(Axon)中用于数据提取，使用中位数归一化方法对所得数据进行归一化处理。标准化后，通过火山图识别显著差异表达的miRNA。使用MEV软件(v4.6，TIGR)进行分层聚类。如果倍数变化(Fold change，FC)>2且P值<0.05，则认为miRNA在两组(癌症与对照)之间显着差异表达。所有原始和标准化miRNA表达数据可从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，登记号GSE83270)获得。
RNA反转录
主要试剂：RNA酶抑制剂(Epicentre)、SuperScriptTM III ReverseTranscriptase(Invitrogen)、5×RT缓冲液(Invitrogen)、2.5mM dNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTest Ltd)、RT引物。主要仪器：Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)。操作步骤：
制备RT混合反应液：
在PCR扩增仪进行RT反应：
16℃ 30min；
42℃ 40min；
85℃ 5min
结束后，将其-20℃保存待用。
表1 RT特异引物
实时定量PCR
主要试剂：qPCR SYBR Green master mix、qPCR引物。主要仪器：ViiA 7Real-timePCR System(Applied Biosystems)。主要步骤：
(1)将所有cDNA样品分别配置反应体系。体系配置如下：
轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心。
表2实时定量PCR引物
(2)加样
a.8ul混合液加入384-PCR板每个孔中。
b.再加入对应的2μl cDNA。
c.粘贴Sealing Film封口膜，短暂离心使混合。
d.将准备好的PCR板放置在冰上。
(3)将上述384-PCR板置于PCR仪上，设置PCR程序，进行PCR反应。
按以下程序进行：
95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。
(4)结果与计算：目的miRNA和内参(hsa-miR-16-5p)分别进行PCR反应，数据采用2-△△Ct法进行分析。
统计分析
使用GraphPad Prism 5(San Diego，CA)和SPSS 20(Chicago，IL)进行统计学分析。Student t检验用于分析两组之间的差异。接受者操作特征曲线(ROC)分析用于确定miRNA的诊断价值。使用逐步前向Logistic回归似然比(LR)构建miR-185-5p与miR-362-5p组合的“miRNA谱”。双尾P<0.05被认为具有统计学意义。
结果：
乳腺癌与健康对照相比血液中6种miRNA的差异表达
为了筛选乳腺癌和健康对照的血液中差异表达的miRNA，对6名乳腺癌患者和6名健康对照进行miRNA微阵列分析。基于miRNA芯片数据，筛选出6种上调的miRNA(图1)包括miR-26b-5p(序列:5'-uucaaguaauucaggauaggu-3'，如SEQ ID NO.1所示)，miR-106b-5p(5'-uaaagugcugacagugcagau-3'，如SEQ ID NO.2所示)，miR-142-3p(5'-uguaguguuuccuacuuuaugga-3'，如SEQ ID NO.3所示)，miR-142-5p(5'-cauaaaguagaaagcacuacu-3'，如SEQ ID NO.4所示)，miR-185-5p(5'-uggagagaaaggcaguuccuga-3'，如SEQ ID NO.5所示)和miR-362-5p(5'-aauccuuggaaccuaggugugagu-3'，如SEQ ID NO.6所示)(倍数变化(FC)>2且P值<0.05)用于68名乳腺癌患者和13名健康对照的较大样品组中进一步验证。实时定量PCR数据显示，与健康对照相比，6种miRNA在乳腺癌患者血中显著高表达(图2，P<0.05)。
差异表达的miRNA的诊断价值
使用ROC曲线分析并计算受试者工作特征曲线下面积(AUC)来检测差异表达的miRNA的诊断性能。结果显示，6种miRNA可鉴别乳腺癌和健康对照，miR-26b-5p，miR-106b-5p，miR-142-3p，miR-142-5p，miR-185-5p和miR-362-5p的AUC分别为0.8891，0.8158,0.8529,0.8507,0.9050和0.9333(图3)。miR-26b-5p的敏感性和特异性分别为83.82％和84.62％，miR-106b-5p为79.41％和76.92％，miR-142-3p为97.06％和61.54％，miR-142为85.29％和76.92％，miR-185-5p为91.18％和76.92％，miR-362-5p为83.82％和100％(表3)。值得注意的是miR-185-5p和miR-362-5p显示出比其他四种miRNA更高的AUC，灵敏度和特异性。
构建“miRNA谱”作为潜在的诊断生物标志物
为了确定miRNA的组合是否可以提高诊断价值，用6种miRNA通过Logistic回归分析构建“miRNA谱”。结果最后回归模型中纳入的是miR-185-5p和miR-362-5p(miRNA谱＝1.451×miR-185-5p表达+3.308×miR-362-5p表达－5.499)。此公式中，1.451和3.308为Logistic回归分析中的回归系数，分别表示miR-185-5p及miR-362-5p在模型中的权重；miR-185-5p表达即为miR-185-5p表达量的具体数值；miR-362-5p表达即为miR-362-5p表达量的具体数值；-5.499为Logistic回归中的常数。ROC曲线分析显示，“miRNA谱”显示出较好的预测价值，可区分乳腺癌和健康对照，AUC为0.975(图4)，敏感性和特异性分别为92.65％和92.31％(表3)，优于本研究中任何一个单个的miRNA的诊断价值。这表明“miRNA谱”作为乳腺癌的诊断标记物具有良好的性能。
此外，为验证“miRNA谱”的较好的诊断价值，我们还用同样方法构建了由另外4个miRNA构成的“miRNA谱(4-miRNA)”(0.382×miR106b-5p+2.055×miR-26b-5p+0.087×miR-142-3p+0.200×miR-142-5p－4.405)，“miRNA谱(4-miRNA)”用于区分乳腺癌和健康对照的ROC曲线下面积为0.949，小于“miRNA谱”的面积0.957。构建了由3个miRNA构成的miRNA构成的“miRNA谱(3-miRNA)”(1.298×miR106b-5p+0.058×miR-142-3p+0.553×miR-142-5p－2.814)，“miRNA谱(3-miRNA)”用于区分乳腺癌和健康对照的ROC曲线下面积为0.880，小于“miRNA谱”的面积0.957。因此，我们认为“miRNA谱”有较好的诊断价值。
表3 ROC曲线分析
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 一种用于诊断乳腺癌的miRNA标志物及其miRNA的应用
<130> 2018
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> miR-26b-5p
<400> 1
uucaaguaau ucaggauagg u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> miR-106b-5p
<400> 2
uaaagugcug acagugcaga u 21
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> miR-142-3p
<400> 3
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> miR-142-5p
<400> 4
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> miR-185-5p
<400> 5
uggagagaaa ggcaguuccu ga 22
<210> 6
<211> 24
<212> RNA
<213> miR-362-5p
<400> 6
aauccuugga accuaggugu gagu 24
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac ctat 54
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacat ctgc 54
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacag tagt 54
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacag tagt 54
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgactc agga 54
<210> 12
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacac tcac 54
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgaccg ccaa 54
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gggttcaagt aattcagg 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gggtaaagtg ctgacagt 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gggtgtagtg tttcctactt 20
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gggcataaag tagaaagc 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gggtggagag aaaggcagt 19
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gggaatcctt ggaacctagg t 21
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cagtgcgtgt cgtggagt 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gggtagcagc acgtaaata 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cagtgcgtgt cgtggagt 18

Claims (10)

1.一种血液中用于诊断乳腺癌的标志物，其特征是：所述标志物为miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合；miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p的序列信息分别如SEQ ID NO.1～6所示。
2.一种用于诊断乳腺癌的标志物，其特征是：所述标志物为血液中的miR-185-5p和miR-362-5p组合，序列信息如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
3.血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合作为乳腺癌诊断标志物在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
4.检测miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的试剂盒或基因芯片在制备用于诊断乳腺癌产品中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是：所述试剂盒至少包括:针对miR-26b-5p的正向引物5'-GGGTTCAAGTAATTCAGG-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-106b-5p的正向引物5'-GGGTAAAGTGCTGACAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-3p的正向引物5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-5p的正向引物5'-GGGCATAAAGTAGAAAGC-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-185-5p的正向引物5'-GGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-362-5p的正向引物5'-GGGAATCCTTGGAACCTAGGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'其中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的应用，其特征是：所述基因芯片至少包括与miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或多种的核酸序列杂交的探针。
7.如权利要求4所述的应用，其特征是：所述产品能够通过检测血液中miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p至少一种的表达水平来诊断患者是否患有乳腺癌。
8.一种用于诊断乳腺癌的产品，其特征是：该产品能够通过检测血液中的miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p表达水平来诊断乳腺癌。
9.如权利要求8所述的产品，其特征是：所述产品为芯片或检测试剂盒；
进一步的，所述芯片至少包括一种与miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p或miR-362-5p的核酸序列杂交的探针；
进一步的，所述检测试剂盒至少包括:针对miR-26b-5p的正向引物5'-GGGTTCAAGTAATTCAGG-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-106b-5p的正向引物5'-GGGTAAAGTGCTGACAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-3p的正向引物5'-GGGTGTAGTGTTTCCTACTT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-142-5p的正向引物5'-GGGCATAAAGTAGAAAGC-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-185-5p的正向引物5'-GGGTGGAGAGAAAGGCAGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'、针对miR-362-5p的正向引物5'-GGGAATCCTTGGAACCTAGGT-3'和反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'其中的一种或多种。
10.miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征是：所述药物为miR-26b-5p、miR-106b-5p、miR-142-3p、miR-142-5p、miR-185-5p和miR-362-5p中的一种或几种组合的抑制剂。
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