CN103865999A - 诊断乳腺癌的组合物和试剂盒、及用其诊断乳腺癌的方法 - Google Patents

Abstract

提供乳腺癌诊断组合物和试剂盒、以及通过使用所述组合物或试剂盒诊断乳腺癌或获得用于乳腺癌诊断的信息的方法。所述组合物或试剂盒包括与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的至少一种微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的多核苷酸。

Description

诊断乳腺癌的组合物和试剂盒、及用其诊断乳腺癌的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求在韩国知识产权局2012年12月18日提交的韩国专利申请No.10-2012-0148873、2013年4月17日提交的韩国专利申请No.10-2013-0041965和2013年7月12日提交的韩国专利申请No.10-2013-0082465的权益，其公开内容通过参考引入本文中。

技术领域

本发明构思涉及用于乳腺癌诊断的组合物和试剂盒、以及使用其的乳腺癌诊断方法。

背景技术

微泡是存在于多种类型的细胞中或者从多种类型的细胞分泌的小的膜状囊泡。从细胞分泌的微泡包括：(i)外来体，其为来源于细胞的具有30-100nm的直径的囊泡；(ii)核外粒体(也称作脱落微泡(SMV))，其为从质膜直接释放并具有50-1000nm的直径的囊泡；和(iii)凋亡泡，其为具有50-5000nm的直径的从濒死细胞分泌的囊泡。

已通过使用电子显微镜证实，外来体不从质膜直接释放，而是来源于称作多泡体(MVB)的特定的细胞内区域，然后释放到细胞外环境中作为外来体。尽管尚未明确地确定在外来体的产生中涉及哪些分子机理，但是已知红细胞、其它多种类型的免疫细胞(包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突状细胞、血小板和巨噬细胞)、和甚至肿瘤细胞当处于正常的活的状态时能够产生和分泌外来体。还已知取决于外来体处于正常状态、病理状态或异常状态，外来体被分离和分泌作为不同的细胞类型。

微泡可包含微RNA(miRNA)，其可用于个体细胞或有机体的状况的检测。所述状况可为疾病，例如癌症、遗传性疾病、心脏病、或神经元疾病如精神分裂症。

现有的乳腺癌诊断方法是侵入性的并因此对于患者是痛苦的，且是非常昂贵的，这可导致人具有不太频繁的检查。在用于乳腺癌诊断的验血中具有高的准确度的血液蛋白标记物目前是不可得到的，且已知循环肿瘤细胞(CTC)仅可应用于转移性乳腺癌的诊断中，而不是癌症的早期诊断中。

因此，对于使用较小侵入性的方式的乳腺癌的早期诊断，存在对于乳腺癌-特异性血液标记物的选择性筛选的需要。

发明内容

提供用于乳腺癌诊断的组合物和试剂盒。所述组合物和试剂盒包括：(a)至少一种具有与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸，和(b)(i)特异性地结合到所述囊泡的物质、(ii)能够插进所述囊泡的脂双层中的物质、或(iii)能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质。

提供诊断乳腺癌和获得用于乳腺癌诊断的信息的方法。所述方法包括：提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品；测量所述样品中的微RNA的量，所述微RNA为选自如下的至少一种：hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93、和hsa-miR-30c；将测量的所述微RNA的量与对照(control)相比较；和基于来自所述样品的所述微RNA的量与对照的比较提供乳腺癌诊断。

另外的方面将在以下描述中部分地阐明，和部分地将从所述描述明晰，或者可由所提供的实施方式的实践获知。

附图说明

从结合附图考虑的实施方式的以下描述，这些和/或其它方面将变得明晰和更容易理解，其中：

图1A-1C为在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组中通过使用缀合有作为靶蛋白的抗-CD83抗体、抗-FASL抗体或抗-ERBB2抗体的免疫珠分离的微泡的量的图。使用抗-CD9抗体确定在经分离的微泡中的CD9蛋白的量。对于各良性肿瘤和乳腺癌组，微泡的以任意单位(AU)的强度显示在y轴上；

图2A和2B为在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组中的微RNA的量的对比图。对于在x-轴上显示的微RNA的样品，交叉点(Cp)值(即循环)显示在y-轴上；

图3A-3C分别为经由通过使用缀合有抗-CD83抗体、抗-FASL抗体、或抗-ERBB2抗体的免疫珠从良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组分离的微泡的免疫印迹获得的整联蛋白-β蛋白带的相对强度。

图4为在从良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组分离的微泡中的整联蛋白-β和微RNA的曲线下面积(AUC)、以及整联蛋白-β和微RNA的总AUC的图。虚线表示整联蛋白-β的AUC，黑条表示微RNA的AUC，且白条表示整联蛋白-β和微RNA的总AUC。

具体实施方式

现在将详细介绍实施方式，其实例说明于附图中，其中相同的附图标记始终是指相同的要素。在这点上，本实施方式可具有不同的形式且不应解释为限于本文中阐明的描述。因此，下面仅通过参照附图描述实施方式，以解释本描述的方面。如本文中所使用的术语“和/或”包括相关列举项目的一个或多个的任何和全部组合。表述例如“……的至少一种”当在要素列表之前或之后时，修饰整个要素列表且不修饰所述列表的单独要素。

根据本发明构思的一个方面，用于诊断乳腺癌的组合物或试剂盒包括至少一种具有与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸。所述组合物可包括两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、或十一种囊泡，其各自包含具有与选自hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的序列的不同多核苷酸。所述组合物可包括其它额外的组分，例如包含不同的核酸的其它囊泡或其它物质。

“囊泡”是指被脂双层包围的膜状结构。例如，囊泡可为外来体或微泡。“微泡”是指来源于细胞的具有膜状结构的小囊泡。术语“微泡”可在本文中与术语“循环微泡”或“微粒”可互换地使用。微泡可存在于细胞中或者可从细胞分泌。从细胞分泌的微泡可包括外来体、核外粒体(脱落微泡(SMV))、或凋亡泡。外来体为来源于吞噬细胞的约30-约100nm直径的膜状囊泡。核外粒体(SMV)为从质膜直接释放的约50-约1000nm直径的大的膜状囊泡。凋亡泡为从濒死细胞漏出的约50-约5000nm直径的囊泡。体内微泡可包含微RNA或信使RNA(mRNA)。微泡的表面蛋白可为疾病-特异性标记物。

微RNA是在真核细胞中发现的短的核糖核酸(RNA)。微RNA调节在身体中的基因的表达，长度为约17-25个核苷酸(在下文中，“nt”)，且由DNA编码。微RNA可增加或减少在从基因组转录和断裂之后特异性蛋白的表达。迄今已知的哺乳动物微RNA可调节胰岛素分泌、淋巴细胞分化、细胞分裂、细胞死亡、病毒复制等。

所述用于诊断乳腺癌的组合物中的微RNA可为例如hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93、hsa-miR-30c、或其组合。所述hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c可为来自人(缩写为“hsa”)的那些。对应于所述微RNA的序列如下：

hsa-miR-126对应于SEQ ID NO.1的核苷酸序列；

hsa-miR-23a对应于SEQ ID NO.2的核苷酸序列；

hsa-miR-24对应于SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

hsa-miR-19b对应于SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

hsa-miR-103对应于SEQ ID NO.5的核苷酸序列；

hsa-miR-142-3p对应于SEQ ID NO.6的核苷酸序列；

hsa-miR-144对应于SEQ ID NO.7的核苷酸序列；

hsa-miR-15a对应于SEQ ID NO.8的核苷酸序列；

hsa-miR-185对应于SEQ ID NO.9的核苷酸序列；

hsa-miR-93对应于SEQ ID NO.10的核苷酸序列；和

hsa-miR-30c对应于SEQ ID NO.11的核苷酸序列。

所述微RNA的片段是指具有连续核苷酸序列的微RNA的多核苷酸。所述片段的长度可为，例如，约2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt-19nt、9nt-18nt、10nt-17nt、11nt-16nt、12nt-15nt、或13nt-14nt。

例如，所述多核苷酸可具有与所述微RNA或其片段的核苷酸序列相同的核苷酸序列。所述多核苷酸可具有与所述微RNA或其片段互补的核苷酸序列。所述多核苷酸可为引物或探针。所述多核苷酸的长度可为，例如，2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt-19nt、9nt-18nt、10nt-17nt、11nt-16nt、12nt-15nt、或13nt-14nt。

所述用于诊断乳腺癌的组合物或试剂盒可进一步包括特异性地结合到囊泡的物质、能够插进囊泡的脂双层中的物质、或能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质、或其组合。例如，所述特异性地结合到囊泡的物质可为能够结合到所述囊泡的表面蛋白、脂质、或糖的物质。囊泡的表面蛋白可为，例如，CD83、CD9、EpCAM、小窝蛋白、FasL、HLA-DRA、CD36、CD63、CD81、MUC1、ERBB4、GPER、ERBB2、MLANA、AMHR2、或其组合。所述特异性地结合到囊泡的物质可为，例如，对蛋白具有结合亲和力的物质、酶的底物、辅酶、调节因子、受体-特异性结合物质、凝集素、糖、糖蛋白、抗原、抗体或其抗原-结合片段、激素、神经递质、磷脂-结合蛋白、包含血小板白细胞C激酶底物(pleckstrin)同源(PH)结构域的蛋白、胆固醇-结合蛋白、或其组合。所述抗原-结合片段可包括抗原-结合位点。例如，所述抗原-结合片段可为单域抗体、Fab、Fab′、或scFv。所述能够插进囊泡的脂双层中的物质可为，例如，包括亲脂性部分、两亲性部分、两性离子部分、或其组合的物质。所述亲脂性部分的实例为脂肪酸、甾醇和甘油酯。所述两亲性部分的实例为磷脂和鞘脂。所述两性离子部分的实例为磺基甜菜碱、羧基甜菜碱和磷酸胆碱。所述特异性地结合到囊泡的物质或所述能够插进囊泡的脂双层中的物质可与固体载体结合。所述固体载体的实例为聚苯乙烯板、聚苯乙烯珠和磁珠。所述特异性地结合到囊泡的物质可为与正常对照例如不具有乳腺肿瘤或具有良性乳腺肿瘤的受试者相比，更加特异性地结合到得自乳腺癌患者的囊泡例如微泡的物质。所述特异性地结合到囊泡的物质可为乳腺癌特异性微泡标记物例如CD83、ERBB2、FASL、或其组合。

所述整联蛋白为穿过细胞膜并且与细胞信号转导、以及细胞循环、细胞形状和细胞运动的调节有关的受体蛋白。所述整联蛋白为由α亚基和β亚基组成的异质二聚体。所述整联蛋白可包括整联蛋白α亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。例如，所述整联蛋白可包括选自如下的多肽：CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白α8(ITGA8)、整联蛋白α9(ITGA9)、整联蛋白α10(ITGA10)、整联蛋白α11(ITGA11)、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41、CD11c、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白β5(ITGB5)、整联蛋白β6(ITGB6)、整联蛋白β7(ITGB7)、和整联蛋白β8(ITGB8)。所述整联蛋白的片段是指具有所述整联蛋白的连续氨基酸序列的多肽。

所述能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质可为特异性地结合到整联蛋白的抗体。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为全长抗体或抗原-结合片段。包括抗原-结合区的抗原-结合片段可为，例如，单域抗体、Fab、Fab′、或scFv。所述特异性地结合到整联蛋白的抗体可为抗-整联蛋白α亚基抗体或抗-整联蛋白β亚基抗体。

根据本发明构思的另一方面，诊断乳腺癌的方法包括：提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品；测量所述样品中的微RNA的量，所述微RNA为选自如下的至少一种：hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c；将测量的所述微RNA的量与对照(例如，测量的在从阳性或阴性对照样品分离的囊泡中的微RNA的量、或代表在阳性或阴性对照样品中的微RNA的量的数据)相比较；和基于来自所述样品的所述微RNA的量与所述对照的比较提供乳腺癌诊断。

所述方法可包括提供从受试者获得的包括囊泡的生物样品，和测量所述样品中的微RNA的量，其中所述微RNA包括如下的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、或全部十一种微RNA：hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c。

所述诊断乳腺癌的方法包括提供从受试者取得的生物样品。

所述受试者可为哺乳动物，包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猫、狗、猪、牛、马、或灵长目(例如人)。

所述生物样品可为，例如，尿、粘液、唾液、眼泪、血浆、血清、痰、脊髓液、来自胸膜腔的浆液、乳头抽吸物、淋巴、微气管液、肠液、泌尿生殖道液、母乳、精液、腹膜液、囊性瘤液、羊水、或其任意组合。所述生物样品可包含囊泡或可为囊泡自身。

所述提供生物样品可包括从个体进行血液收集、取样、活组织检查、分离或单离样品。所述提供生物样品可包括从样品分离或单离囊泡。从生物样品分离囊泡可例如使用固体载体或离心力、密度梯度方法、超速离心法、过滤、渗析、使用抗体的免疫亲和层析法、自由流动电泳、或其组合进行。从生物样品分离囊泡可包括将囊泡与例如特异性地结合到所述囊泡的物质或能够插进囊泡的脂双层的物质一起温育。所述温育可在体外进行。在一些实施方式中，从生物样品分离囊泡可包括洗涤。

所述微RNA的量可使用与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的至少一种微RNA(miRNA)或所述微RNA的片段相同或互补的多核苷酸的探针或引物测量。所述多核苷酸的长度可为，例如，2nt-25nt、3nt-24nt、4nt-23nt、5nt-22nt、6nt-21nt、7nt-20nt、8nt-19nt、9nt-18nt、10nt-17nt、11nt-16nt、12nt-15nt、或13nt-14nt。所述微RNA的量可使用例如定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)测量。

所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可包括将测量的在生物样品中的微RNA的量与对照(例如，测量的在参比(对照)样品的囊泡中的微RNA的量)相比较。

所述对照样品可为从正常或良性肿瘤患者(阴性对照)获得的样品。或者，所述对照样品可为从乳腺癌患者(阳性对照)获得的样品。所述对照还可由表示在正常或良性患者、或乳腺癌阳性患者库(pool)中的miRNA的量的数据提供。

所述诊断乳腺癌的方法可包括基于来自所述样品的所述微RNA的量与对照的比较提供乳腺癌诊断。所述提供乳腺癌诊断可包括确定测量的来自所述生物样品的所述微RNA的量是大于还是小于来自对照的所述微RNA的量。例如，相对于阴性对照增加的来自所述生物样品的微RNA的量指示所述受试者中的乳腺癌。阴性对照可为来自不具有乳腺肿瘤或具有良性乳腺肿瘤的受试者的生物样品的微RNA的量。相对于阴性对照增加的来自所述生物样品的微RNA的量可为超过约0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、或2.8Cp单位的增加。相对于阳性对照样品中的微RNA的量减少的来自所述生物样品(例如囊泡自身)的微RNA的量指示所述受试者中的非乳腺癌的诊断。阳性对照可为来自具有乳腺癌的受试者的生物样品的微RNA的量。相对于阳性对照减少的来自所述生物样品的微RNA的量可为超过约0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、或2.8Cp单位的减少。

所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可进一步包括：测量所述生物样品(例如囊泡)中的整联蛋白的量；将所述整联蛋白的量与对照(例如，测量的在从阳性或阴性对照分离的囊泡中的整联蛋白的量；或反映在阳性或阴性对照患者样本或这样的样本库中存在的整联蛋白的水平的数据)相比较。所述方法进一步包括：当来自所述生物样品的所述囊泡中的所述整联蛋白的量大于阴性对照或小于阳性对照时，确定所述受试者为乳腺癌患者或具有高的具有乳腺癌的可能性。

所述整联蛋白的量可使用电泳、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白芯片、质谱仪、或其组合测量。

所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可为体外方法。所述诊断乳腺癌的方法可进一步包括对根据所述诊断乳腺癌的方法诊断为具有乳腺癌或较高的具有乳腺癌的可能性的受试者给予一种或更多种用于治疗乳腺癌的药物以治疗乳腺癌。所述药物可为对乳腺癌特异性的抗-癌症药物、或与其它癌症药物的组合。

所述诊断乳腺癌或获得乳腺癌诊断所需的信息的方法可包括将生物样品(例如，囊泡)例如溶解在包含例如离液盐、有机溶剂或表面活性剂的溶剂中。所述将生物样品溶解可例如通过加热、搅拌、旋转、涡旋、或其组合进行。

现在将参照以下实施例更详细地描述一个或多个实施方式。然而，这些实施例仅用于说明的目的且不意图限制所述一个或多个实施方式的范围。

实施例1：乳腺癌特异性蛋白和微RNA标记物

(1)乳腺癌有关的微泡的表面蛋白标记物的筛选

从20名良性肿瘤患者(作为非乳腺癌患者)和22名乳腺癌患者(乳腺癌，第二期Luminal B型)取样8ml-10ml血液到BD VacutainerPlus塑料全血管中。通过将各血液样品在4℃下以1300xg离心10分钟而从所述样品分离血浆，然后将其在-80℃储存直至使用。在使用之前，将血浆解冻并在约4℃下以约3,000xg离心5分钟以除去血浆脂质和细胞碎片，由此在以下试验中使用上清液。

将所获得的血浆集中并使用具有为血浆样品的3倍体积的PBS缓冲液进行稀释。将经稀释的血浆顺序地在4℃下以2,000xg离心30分钟和在4℃下以12,000xg离心30分钟。从离心所得物移出离心沉淀，并通过使用0.22μm过滤器将上清液过滤。将经过滤的溶液通过使用300kDa截留膜柱(Vivaproducts)浓缩和在4℃下以110,000xg超高速离心2小时以获得作为其沉淀物的微泡。

为了鉴别与正常人相比在乳腺癌患者中微泡中的CD83、ERBB2和FASL蛋白的量是增加还是减少，测量CD9的量，其为作为内部对照组的微泡标记物。使所获得的沉淀物(即微泡)悬浮在PBS中，将包括十二烷基硫酸锂的pH为8.4的NuPAGE LDS样品缓冲液(Life Technologies)和溶解(lysis)缓冲液添加到管中，和通过将所得物在加热块中在95℃下热处理10分钟，所述微泡经历溶解。对溶解产物进行电泳，并对其进行免疫印迹。由免疫印迹的检测通过使用作为第一抗体的兔抗-CD83抗体(BD Pharminen)、兔抗-ERBB2抗体(R&D Systems)、兔抗-FASL抗体(BD Pharmingen)和兔抗-CD9抗体(Novus Biologicals)和作为第二抗体的HRP-缀合的抗-兔抗体进行，且通过使用Las min4000分析发光图像。在免疫印迹的分析结果中，基于对来自两个患者组的微泡的免疫印迹的结果，证明CD83、ERBB2和FASL蛋白在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组之间的量的显著差异。

因此，乳腺癌特异性微泡可使用抗-CD83抗体(BD Pharmingen)、抗-ERBB2抗体(R&D Systems)、或抗-FASL抗体(BD Pharmingen)从血液分离。

(2)表面蛋白标记物的确认

为了确定从良性肿瘤患者和乳腺癌患者各自获得的CD83、ERBB2或FASL蛋白表达的微泡的量，使用缀合有抗-CD83抗体、抗-ERBB2抗体或抗-FASL抗体的免疫珠从实施例1(1)的血浆分离微泡，并且通过使用特异性结合到CD9蛋白(微泡标记物)的抗-CD9抗体的免疫印迹确定经分离的微泡的量。

将100ml DynabeadsM-270胺溶液(Life Technologies)置于Eppendorf管中并用包含NaCl的MES缓冲液(pH6.0)洗涤。在MES缓冲液中制备聚丙烯酸(PAA)(Aldrich)溶液，并向所述溶液添加作为偶联剂的EDC和NHS。然后使珠子在室温下反应，用MES缓冲液(pH6.0)洗涤，然后再悬浮在包含EDC和NHS的MES缓冲液中。然后，将珠子用MES缓冲液洗涤并在MES缓冲液中与蛋白G溶液反应。在反应之后，向所述溶液添加1.2mg磺基甜菜碱(Aldrich)并温育。在温育之后，将珠子用PBST和PBS洗涤。在PBS溶液(pH7.4)中制备抗-CD83原液并将其用NaOAc(pH5.0)稀释。将结合了蛋白G的珠子用抗-CD83溶液(80mg抗-CD83抗体)温育。然后将珠子用硼酸钠缓冲液(pH9.3)洗涤，并使用溶解在硼酸钠缓冲液(pH9.3)中的庚二亚氨酸二甲酯二盐酸盐使所述抗体交联到蛋白G。所述反应通过用乙醇胺洗涤和温育免疫珠而终止。在温育之后，用PBST和PBS洗涤免疫珠。将制备的免疫珠用PBS洗涤并且在PBS中在4℃下储存直至使用。

在从30名良性肿瘤患者(作为非乳腺癌患者)和30名乳腺癌患者(乳腺癌，第二期，Luminal B型)取样血液之后，如在部分(1)中描述的那样从各血液样品分离血浆，将其使用而不集中。

将300μl各血浆样品与30μl(抗体0.8μg/珠子1μl)的包被有抗-CD83抗体的珠子在试管(Axygen)中混合，并在用Grant Bio Rotator旋转的同时在室温下温育约4小时。在从反应混合物除去上清液之后，用PBS洗涤珠子。然后将珠子再悬浮于PBS中并在30rpm和室温下再温育3小时。在除去上清液之后，将珠子再悬浮于LDS上样缓冲液(Invitrogen)中并在100℃下沸腾10分钟。如在部分(1)中所描述的那样通过免疫印迹测定来评估CD9蛋白的量。通过非参数威尔科克森(Wilcoxon)秩和检验确定两个组之间的使用抗体分离的微泡中表达的CD9蛋白的量的差异。认为p-值小于0.05的威尔科克森秩和检验的检验结果是统计学上显著的。

参照图1A-1C，当使用抗-CD83抗体(BD Pharmingen)、抗-ERBB2抗体(R&D Systems)或抗-FASL抗体(BD Pharmingen)分离微泡且然后使用抗-CD9抗体(R&D Systems)确定经分离的微泡中的CD9蛋白的量时，在良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组之间发现所获得的微泡的量的统计学上显著的差异。该结果表明在微泡的表面上表达或显示CD83、ERBB2和FASL蛋白，且与良性肿瘤患者组相比，在乳腺癌有关的微泡中CD83蛋白集中得更多(浓度更高)。

(3)对于乳腺癌有关的微泡的微RNA标记物的筛选

如在部分(2)中所描述的那样使用结合有抗-CD83抗体的免疫珠从血浆分离微泡，并通过使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的方案提取来自经分离的微泡的miRNA。

通过使用Universal cDNA合成试剂盒(Exiqon)将经分离的RNA反转录为cDNA。将所有室温产物与SYBR Green Master Mix以4ml的最终体积混合。将混合物上样到微RNA即用型PCR人嵌板I V2.R的384孔板中。还使用miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR(Exiqon)进行定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)。使用LightCycler480Real-Time PCR System(Roche)根据制造商的指示进行实时PCR：95℃进行10分钟，随后是95℃进行10秒和60℃进行1分钟的总共45次循环。基于用于比较的qRT-PCR对照校正个体患者中由交叉点(Cp)代表的测量的miRNA的量。qRT-PCR的结果示于图2A和2B中。qRT-PCR结果的分析结果示于下表1中。

[表1]

在图2A和2B以及表1中，较小的Cp水平表示较高的miRNA表达。使用威尔科克森秩和检验分析两个患者组之间的微RNA量的差异。认为具有小于0.05的p-值的结果是统计上显著的。

参照图2A和2B以及表1，发现hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c是乳腺癌有关的微泡的标记物，如下所示：

hsa-miR-126；5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′(SEQ ID NO.1)

hsa-miR-23a；5′-AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3′(SEQ ID NO.2)

hsa-miR-24；5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′(SEQ ID NO.3)

hsa-miR-19b；5′-UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA-3′(SEQ ID NO.4)

hsa-miR-103；5′-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA-3′(SEQ ID NO.5)

hsa-miR-142-3p；5′-UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA-3′(SEQ IDNO.6)

hsa-miR-144；5′-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3′(SEQ ID NO.7)

hsa-miR-15a；5′-UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG-3′(SEQ ID NO.8)

hsa-miR-185；5′-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3′(SEQ ID NO.9)

hsa-miR-93；5′-CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG-3′(SEQ ID NO.10)

hsa-miR-30c；5′-UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC-3′(SEQ ID NO.11)

(4)在乳腺癌有关的微泡中的微RNA和表面蛋白的诊断准确度评价

使用来自20名良性肿瘤患者和22名乳腺癌患者的样品计算如部分(2)和(3)中描述的基于微泡中的微RNA和表面蛋白CD83的量的乳腺癌诊断中的评价准确度、曲线下面积(AUC)和p-值。结果示于下表2中。评价准确度意指患者具有乳腺癌或良性肿瘤的假设与患者具有乳腺癌或良性肿瘤的实际事实匹配得多么好。认为0.8或更大的AUC提供较好的效果。

[表2]

参照上表2，基于从血浆分离的具有表面蛋白CD83的微泡中hsa-miR-126的量，良性肿瘤和乳腺癌可为以86%的准确度彼此可区分的。使用hsa-miR-126的评价的准确度比使用临床信息(年龄)的评价高约24%，且比基于表面蛋白CD9的量的评价高约10%。

实施例2：乳腺癌特异性蛋白整联蛋白-β和微RNA标记物

(1)微泡中的整联蛋白-β蛋白的量化和接受者操作特性(ROC)的分析

如实施例1的部分(2)中描述的那样将从血浆分离的微泡再悬浮于LDS上样缓冲液(Invitrogen)中，在约100℃下加热约10分钟以使结合到免疫珠的微泡溶解。对所述微泡的溶解产物进行电泳以分析来自与结合有抗-CD83抗体的免疫珠结合的微泡的蛋白。

将由电泳得到的凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，然后将其浸在10ml的包括1μl抗-整联蛋白-β抗体(R&D systems)的Tris缓冲生理盐水和Tween20(TBST)(包括1%的脱脂奶粉)的混合物、或10ml的包括1μl抗-CD9抗体(R&D systems)的TBST(包括1%的脱脂奶粉)中，并在室温下温育约1小时，随后用20ml TBST洗涤三次，每次5分钟。将所得的经洗涤的膜和与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的第二抗体一起以与上述相同的方式温育，然后用20ml TBST洗涤三次，每次5分钟。

将经洗涤的膜在2ml SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity底物(Pierce)中在室温下温育约5分钟，然后使用LAS成像系统(Fujifilm)成像以检测整联蛋白-β和CD9的带，随后是使用Image J软件(NCI)的分析以测量背景以及整联蛋白-β和CD9的带强度。

经由通过使用缀合有抗-CD83抗体、抗-FASL抗体或抗-ERBB2抗体的免疫珠从良性肿瘤患者组和乳腺癌患者组分离的微泡的免疫印迹获得的整联蛋白-β蛋白带的相对强度分别示于图3A-3C中(30名良性肿瘤患者和30名乳腺癌患者)。参照图3A-3C，发现与良性肿瘤患者相比，乳腺癌患者包括微泡中的整联蛋白-β蛋白的显著增加的量。

基于整联蛋白-β带强度(y轴：灵敏度，x轴：1-特异性)分析接受者操作特性(ROC)曲线。结果示于图3B中。由ROC曲线获得的曲线下面积(AUC)示于表3中。

[表3]

	CD9	整联蛋白-β
			CD83	0.760	0.690
FASL	0.600	0.650
			ERBB2	0.750	0.600

(2)整联蛋白-β和微RNA的总AUC

使用实施例1的部分(3)的来自qRT-PCR的Cp值和实施例2的部分(1)中的经由通过结合有抗-CD83抗体的免疫珠分离的微泡的免疫印迹获得的测量的整联蛋白-β带强度作为参数进行逻辑回归分析以获得整联蛋白-β和微RNA的总AUC。

结果示于图4和下表4中。

[表4]

AUC

整联蛋白-β和微RNA的总AUC

hsa-miR-103	0.741	0.862
			hsa-miR-142-3p	0.741	0.845
hsa-miR-144	0.69	0.862
			hsa-miR-15a	0.81	0.828
hsa-miR-185	0.776	0.879
			hsa-miR-93	0.759	0.862
整联蛋白-β	0.690

参照图4，虚线表示整联蛋白-β的AUC，黑条表示微RNA的AUC，和白条表示整联蛋白-β和微RNA的总AUC。

参照图4和表4，整联蛋白-β和微RNA的总AUC比整联蛋白-β的AUC平均多约0.189，且比微RNA的AUC平均多约0.172，表明整联蛋白-β和微RNA的组合可改善乳腺癌的诊断准确度。

如上所述，根据本发明构思的以上实施方式的一个或多个，各自包括与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的至少一种微RNA或所述微RNA的片段相同或互补的多核苷酸的乳腺癌诊断组合物和试剂盒、以及使用所述组合物或试剂盒诊断乳腺癌或获得用于乳腺癌诊断的信息的方法的使用可容许使用较小侵入性的方式的乳腺癌的早期诊断，且因此对于患者可为更方便的。

应理解，本文中描述的示例性实施方式应仅在描述的意义上考虑且不用于限制的目的。在各实施方式中的特征或方面的描述应典型地被认为可用于其它实施方式中的其它类似特征或方面。

本文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)特此通过参考引入至如同每一份参考文献被单独地和具体地说明以通过参考引入且在本文中全部阐述一样的程度。

在描述本发明的范围中(特别是在所附权利要求的范围中)使用术语“一种(个)(a,an)”和“该(所述)”以及类似的指示物将理解为涵盖单数和复数两者，除非本文中另外说明或与上下文明显矛盾。在一个或多个项目的列表之后或之前的术语“的至少一种(个)”(例如，“A和B的至少一种(个)”)的使用将解释为意指选自所列项目的一个项目(A或B)或者所列项目的两个或更多个的任何组合(A和B)，除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)，除非另外说明。本文中数值的范围的列举仅意图用作单独提及落在所述范围内的每个独立值的简写方法，除非本文中另外说明，且每个独立值引入说明书中如同其在本文中被单独列举。本文中描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非在本文中另外说明或与上下文明显矛盾。本文中提供的任何和所有实施例、或示例性语言(如，“例如”)的使用仅用来更好地说明本发明，而不对本发明的范围加以限制，除非另外说明。说明书中没有语言应被解释为表明任何非要求保护的要素为本发明的实践所必须的。

在本文中描述本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读上述描述时，那些优选实施方式的变型对于本领域普通技术人员可变得明晰。本发明人希望技术人员适当地采用这样的变型，且本发明人意图让本发明用不同于本文中具体描述的方式实践。因此，本发明包括由适用的法律所允许的在所附权利要求书中所列举的主题的所有修改和等同物。而且，在其所有可能变型中的上述要素的任意组合包括在本发明中，除非本文中另外说明或相反与上下文明显矛盾。

Claims (15)

1.用于诊断乳腺癌的组合物，包括

(a)至少一种具有与选自囊泡中的hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA或所述微RNA的片段相同或互补的序列的多核苷酸，和

(b)(i)特异性地结合到所述囊泡的物质、(ii)能够插进所述囊泡的脂双层中的物质、(iii)能够特异性地结合到整联蛋白或其片段的物质、或其组合。

2.权利要求1的组合物，其中所述囊泡为微泡或外来体。

3.权利要求1的组合物，其中所述特异性地结合到所述囊泡的物质为能够结合到囊泡的表面蛋白、脂质、或糖的物质。

4.权利要求3的组合物，其中所述表面蛋白为CD83、CD9、EpCAM、小窝蛋白、FasL、HLA-DRA、CD36、CD63、CD81、MUC1、ERBB4、GPER、ERBB2、MLANA、AMHR2、或其组合。

5.权利要求1的组合物，其中所述能够插进所述囊泡的脂双层中的物质包括亲脂性部分、两亲性部分、两性离子部分、或其组合。

6.权利要求1的组合物，其中所述整联蛋白包括整联蛋白α亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。

7.权利要求1的组合物，其中所述整联蛋白包括选自如下的多肽：CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白α8、整联蛋白α9、整联蛋白α10、整联蛋白α11、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41、CD11c、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白β5、整联蛋白β6、整联蛋白β7和整联蛋白β8。

8.权利要求1的组合物，其中

hsa-miR-126包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，

hsa-miR-23a包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列，

hsa-miR-24包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列，

hsa-miR-19b包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列，

hsa-miR-103包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列，

hsa-miR-142-3p包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列，

hsa-miR-144包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列，

hsa-miR-15a包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列，

hsa-miR-185包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列，

hsa-miR-93包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列，和

hsa-miR-30c包括SEQ ID NO:11的核苷酸序列。

9.包括权利要求1-8任一项的组合物的用于诊断乳腺癌的试剂盒。

10.至少一种多核苷酸在制造用于诊断乳腺癌的试剂或试剂盒中的用途，其中所述至少一种多核苷酸具有与选自hsa-miR-126、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-19b、hsa-miR-103、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-144、hsa-miR-15a、hsa-miR-185、hsa-miR-93和hsa-miR-30c的微RNA或所述微RNA的片段相同或互补的序列。

11.权利要求10的用途，其中所述多核苷酸与整联蛋白或其片段组合使用。

12.权利要求11的用途，其中所述整联蛋白包括整联蛋白α亚基、整联蛋白β亚基、或其组合。

13.权利要求11的用途，其中所述整联蛋白包括选自如下的多肽：CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、整联蛋白α8、整联蛋白α9、整联蛋白α10、整联蛋白α11、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41、CD11c、CD29、CD18、CD61、CD104、整联蛋白β5、整联蛋白β6、整联蛋白β7和整联蛋白β8。

14.权利要求10的用途，其中

hsa-miR-126包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，

hsa-miR-23a包括SEQ ID NO:2的核苷酸序列，

hsa-miR-24包括SEQ ID NO:3的核苷酸序列，

hsa-miR-19b包括SEQ ID NO:4的核苷酸序列，

hsa-miR-103包括SEQ ID NO:5的核苷酸序列，

hsa-miR-142-3p包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列，

hsa-miR-144包括SEQ ID NO:7的核苷酸序列，

hsa-miR-15a包括SEQ ID NO:8的核苷酸序列，

hsa-miR-185包括SEQ ID NO:9的核苷酸序列，

hsa-miR-93包括SEQ ID NO:10的核苷酸序列，和

hsa-miR-30c包括SEQ ID NO:11的核苷酸序列。

15.权利要求1-8任一项的组合物在制造用于诊断乳腺癌的试剂或试剂盒中的用途。

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