CN107937512A - 用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒 - Google Patents
用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程领域,涉及用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第三microRNA。血清miRNA是新颖的生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,而且定量精确,将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,更具体地,涉及用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。
背景技术
自然流产是指妊娠不足28周、胎儿体重不足1000g而终止的妊娠。流产发生于妊娠12周前者称早期流产,发生在妊娠12周至28周者称晚期流产。据报道,自然流产 的整体发病率为12%~24%,并且发病率有逐年增加的趋势。值得一提的是,复发性流 产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是自然流产中最为特殊的一种类型,其发病 率约为1%~3%,其不良结局较散发性自然流产更为严重,甚至会造成不孕症。对自然 流产病因及发病机制的研究是一直国际生殖领域的热点。自然流产其病因复杂,机制尚 不明确。目前关于自然流产的机制研究的较多的倾向于免疫因素、遗传因素、血栓性疾 病倾向、感染因素、内分泌因素、环境因素等。
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类存在于动植物体内、约21-25个核苷酸内 源性的单链非编码RNA,目前已从线虫、果绳、家鼠和人中都分离到成百上千种miRNA 的初级转录产物(pri-miRNA)在细胞核内被剪切形成前体miRNA(pre-miRNA),然 后通过转运蛋白由细胞核内转运至细胞质中,进一步形成RNA二聚体。二聚体解链后, 一条形成成熟的miRNA,另一条被降解。成熟miRNA与其它蛋白质一起组成RNA诱 导沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex,RISC)。RISC通过与靶mRNA的3’-UTR 完全或不完全互补配对结合,引起靶基因mRNA降解或抑制其蛋白质翻译,从而参与 基因的表达调控,影响细胞增殖、凋亡、分化等生命活动过程。
在胚胎识别、黏附、植入、胎盘形成和胎儿发育过程中,胚胎与子宫内膜、胎儿与胎盘之间存在着极为复杂的信号传导网络,介导母胎对话。除了甾体激素起主导地位外,其它一些分子如细胞因子、生长因子、粘附分子和趋化因子等都参与这些过程的调节。 由子宫内膜形成的蜕膜化组织是母-胎界面间一个非常复杂而又高度协调的微环境,由 来自子宫内膜、胚胎(胎儿)及周围组织的多种细胞及其所分泌的细胞因子共同形成了 母-胎间信息交流的平台,对子宫内膜的免疫容受性、胚胎滋养细胞的“有控性”侵入、 子宫内膜蜕膜化和胎盘的形成进行精确的调控。越来越多的证据表明,miRNA在子宫 内膜蜕膜化发生、胎盘形成过程中起重要作用。
研究发现血清中存在着很多的miRNA,性质相对稳定、表达量丰富,特异性较高,且易于定量检测。据报道,在肺癌、结肠癌等疾病中已经证实miRNA的表达谱对早期 诊断有一定的提示作用,可作为这些疾病的潜在生物标志物。
目前还没有将miRNA应用于复发性流产辅助诊断的报道,若能筛选出复发性流产相关的miRNA作为早期诊断的生物标志物,并研制相应的诊断试剂盒,对复发性流产 的诊断现状必将是一次有力的推动,也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了一条 新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物、引物组及应用和试剂盒。所述试剂盒具有测定microRNA标志物在血清中表达的特异性和灵敏度。
本发明人通过分离和检测复发性流产病例和非医学原因选择流产对照血清中的miRNAs,发现了血清中存在可用于评估复发性流产发生风险的特异性和敏感性的 miRNA组合,因而提出了复发性流产患者的血清miRNA标志物组合,以及所述血清 miRNA标志物或其引物在制备复发性流产辅助诊断试剂中的应用,研制出便于临床应 用的复发性流产诊断试剂盒。
具体地,本发明的第一方面提供一组用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物, 所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列 (5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’)具有90%以上同源性的第一microRNA、 与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列(5’-UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG-3’)具有90% 以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列 (5’-CGGCAACAAGAAACUGCCUGAG-3’)具有90%以上同源性的第三microRNA。
优选地,所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有95%以上同 源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第三 microRNA。
进一步优选地,所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序 列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO:2所示核 苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3 所示核苷酸序列具有96%、97%、98%、99%以上同源性的第三microRNA。
再优选地,所述血清microRNA标志物包括:具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序 列的第一microRNA(hsa-let-7i-5p)、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第二 microRNA(hsa-miR-132-3p)和具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的第三microRNA (hsa-miR-3656)。
本发明的第二方面提供用于检测上述的血清microRNA标志物的引物组,所述引物组包括以下引物:
用于检测第一microRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第二microRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第三microRNA的上游引物和下游引物。
本领域技术人员可根据常规手段设计上述引物,优选地,
用于检测第一microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列,下游引 物具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列;
用于检测第二microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列,下游引 物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列;
用于检测第三microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列,下游引 物具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列。
本发明的第三方面提供上述的血清microRNA标志物和/或引物组在制备复发性流产诊断或监测试剂中的应用。
本发明的第四方面提供一种复发性流产诊断或监测试剂盒,该试剂盒包括上述的引 物组。
所述试剂盒还可以包括内参,以及相关PCR技术常用的其他试剂。优选地,所述 试剂盒还包括:
(1)内参U6的正反向引物(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12);和/或
(2)DNA聚合酶、通用反向引物(SEQ ID NO:10)、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、 水和核酸染料中的至少一种。
本发明的优越性在于:
(1)血清miRNA是新颖的生物标志物,不仅稳定、微创、易于检测,而且定量精 确,将大大提高复发性流产诊断的敏感性和特异性。该类小分子非编码RNA生物标志 物的成功开发,颠覆了以蛋白为主的传统生物标志物的检测方法,将为复发性流产的防 治开创全新局面,同时为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)本发明提供的血清miRNA标志物可用于复发性流产辅助诊断标志物,通过微创方式对复发性流产进行早期辅助诊断,从而为临床医生进一步深入检查提供依据,达 到快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度的效果。同时,为下一步及时采取更具 个性化的防治方案提供支持,延缓和阻止疾病进展。
(3)本发明采用符合复发性流产病例和非医学原因选择流产对照人群的样本进行验证,证明所述几种miRNA标志物表达量存在显著性差异并具有一定的稳定性,以说 明该标志物具有特异性,可作为复发性流产生物标志物应用。
(4)本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。第一阶段,通过预实验miRNA 芯片筛选多种绒毛组织差异miRNAs。第二阶段,应用qRT-PCR等方法对研究人群血清 样本进行验证和独立人群验证,采用分层评分系统对诊断结果进行标化。第三阶段,在 另一组独立人群中对血清miRNA标志物和诊断试剂盒进行盲法评价,保证了该血清 miRNA生物标志物和诊断试剂盒的可靠性。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。
图1为复发性流产绒毛组织样本芯片miRNA表达差异程度的MA图。在Control 组和Case组之间样本中的显著的基因分布(大于0的为上调的基因,小于0的为下调 的基因);
图2为Real-time PCR检测hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656在复发性 流产绒毛组织样本中的表达示意图;*表示P<0.05;
图3为Real-time PCR检测hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656在复发性 流产血清样本中的表达示意图;*表示P<0.05;
图4为个体血清miRNA表达水平波动性分析;
图5为正常对照组和复发性流产病例组之间的ROC曲线。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方 式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为本领域常规方法,一般按照试 剂商所建议的条件与步骤进行。
实施例1:绒毛组织miRNA筛选
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
(1)根据诊断标准:连续2次或2次以上的孕20周前或胎儿体重不足500g的妊 娠丢失的孕妇为病例组;根据年龄、妊娠周数、BMI等指标,以频数匹配法选择生育能 力正常、非医学原因选择流产的孕妇(无流产征兆及体征,无流产史,且至少有一个正 常小孩出生)为对照组。
(2)B超显示无胚芽或无胎心搏动,且需排除因单基因遗传病、多基因遗传病、 染色体异常以及基因突变等因素引发的流产。
(3)研究对象分组:
A组:非医学原因选择流产孕妇对照组(n=80,20人芯片筛选,30人一期验证, 30人独立人群验证);
B组:不明原因复发性流产孕妇(n=80,20人芯片筛选,30人一期验证,30人独 立人群验证)。
(4)经知情同意,样本采集纳入此次研究孕妇的血清和绒毛组织。
注:BMI(即身体质量指数,Body Mass Index,简称BMI),是体重公斤数与身高米数平方 的比值,是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一项标准。
1.2试剂
TRIzolTM Reagent购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒(DRR037A)购自日本Takara公司。荧光实时(Real-time)定量PCR所用SYBR试剂购自南京诺唯赞生物科 技有限公司。所有引物由上海英骏(Invitrogen)生物有限公司设计并合成。
表1 miRNAs的引物序列
2方法
制备cDNA样品:a)取80mg绒毛组织;b)加入900μl Trizol,振荡混匀,4℃,12000rpm离心15分钟,弃下层废液;c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀, 转至离心柱,12000rpm离心15秒,弃下层废液;d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲 液,10000rpm离心15秒,弃下层废液;e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液,10000rpm 离心15秒,弃下层液;f)重复e;g)将离心柱加入一个新的2ml的管子,10000rpm 离心1分钟,用于去除RPE缓冲液;h)在柱子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离 心收集RNA;i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara 公司)、1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步 骤为16℃孵育15分钟,42℃反应1小时,85℃孵育5分钟。(若针对不同miRNA 则采用对应的miRNA反向引物按上述步骤进行)。
逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增:
预扩增的反应条件如下表所示:
将预扩增产物简短离心后,加入0.1×TE(pH 8.0)75μl,颠倒混匀后再做简短离心。 预扩增产物可以直接用于下面的实时荧光定量PCR(qPCR)。
预扩增产物进行qPCR按下表所示配制反应体系:
考虑到吸液损失而放量12.5%。
3结果
检测并比较健康对照、复发性流产患者样本中miRNAs表达谱的差异,筛选出有 4倍差异的miRNAs。经生物信息学分析和动物实验结果,选定其中3条成为候选并 进行进一步验证,具体为:hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656。
实施例2:qRT-PCR方法检测hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656 在绒毛组织中表达水平
1.材料
1.1引物设计
设计引物(如表1所示)分别对80例不明原因复发性流产病例和80例非医学原 因选择流产对照样本绒毛组织进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。
1.2制备cDNA样品
a)取80mg绒毛组织;b)加入900μl Trizol,振荡混匀,4℃,12000rpm离心 15分钟,弃下层废液;c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀,转至离心柱, 12000rpm离心15秒,弃下层废液;d)在离心柱上加入700μl RWT缓冲液,10000rpm 离心15秒,弃下层废液;e)在离心柱上加入500μl RPE缓冲液,10000rpm离心15秒, 弃下层液;f)重复e;g)将离心柱加入一个新的2ml的管子,10000rpm离心1分钟, 用于去除RPE缓冲液;h)在柱子上加入50μlDEPC处理水12000rpm离心收集RNA; i)然后通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲 液、2μl 10mM dNTP混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、 1μl AMV(Takara公司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃ 孵育15分钟,42℃反应1小时,85℃孵育5分钟;
2.方法
qRT-PCR:染料法:取1μl cDNA,将cDNA倍比稀释,加入0.3μl Taq酶(Takara 公司),1μl 20×EVA GREEN,0.25μl 10μM上述单一miRNA对应的正向引物,0.25μl 10μM通用反向引物(URP),1.2μl 25mM MgCl2,1.6μl 2.5mM dNTP混合液(Takara 公司),2μl 10×PCR缓冲液,12.4μl纯水,20μl体系进行荧光定量PCR。10μl TaqMan universal PCR masterMix,6.6μl H2O,20μl体系进行q-PCR。仪器使用的都是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪,PCR的反应条件都是:95℃、5分钟进行1个循环→95℃、 15秒,60℃、1分钟进行40个循环。检测并比较不明原因复发性流产病例和非医学原 因选择流产对照样本绒毛组织中miRNA表达量的变化,各组样本miRNA的表达量比 值可用方程2–△G表示,其中△G=CT group1–CT group2。为保证各次实验间的可比性,在每 板上都设置了U6,以其表达量作为内参调整计算表达量。
3.结果
根据结果分析得出,hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656这3条miRNA在两组之间均有显著差别(如图2所示)。说明上述miRNAs可能参与调控复发性流产 的发生过程,具有应用于复发性流产辅助诊疗的潜在可能。
实施例3:检测hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656在血清中表 达水平
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。
1.2试剂
qPCR所用试剂同实施例1。
2方法
2.1提取总RNA
以80例正常对照组和80例复发性流产病例组的血清样品为对象,取5ml新鲜肝素抗凝血于离心机3000rpm离心5min,取上清分装至洁净1.5ml EP管中,每管100μl。 向EP管中加入900μl TRIzol,充分震荡混匀后,4℃,12000rpm离心15min,立即取 上清转移至洁净1.5ml EP管中。向EP管中加入1.5倍上清水相体积的无水乙醇,充分 混匀后转移至离心柱,10000rpm 4℃离心15秒,弃下层废液。在离心柱上加入700μl RWT 缓冲液(QiagenmiRNeasy Mini Kit,货号217004),10000rpm 4℃离心15秒,弃下 层废液。在离心柱上加入500μl RPE缓冲液(Qiagen miRNeasy Mini Kit,货号217004), 10000rpm 4℃离心15秒,弃下层废液。此步骤重复一遍。往离心柱加入一个新的2ml 的管子,10000rpm 4℃离心1分钟,目的用于去除RPE缓冲液。将离心柱安装于一新的 1.5ml的离心管中,同时在柱子上加入50μl DEPC处理的水,离心1分钟。-70℃保存处 理后的样本。
2.2逆转录合成cDNA
a)取经前处理的血清RNA,b)加入900μl Trizol,振荡混匀,4℃,12000rpm 离心15分钟,弃下层废液;c)加入上清1.5倍体积的无水乙醇震荡混匀,转至离 心柱,12000rpm离心15秒,弃下层废液;d)在离心柱上加入700μl RWT 缓冲液,10000rpm离心15秒,弃下层废液;e)在离心柱上加入500μl RPE 缓冲液,10000rpm离心15秒,弃下层液;f)重复e;g)将离心柱加入一个 新的2ml的管子,10000rpm离心1分钟,用于去除RPE缓冲液;h)在柱 子上加入50μl DEPC处理水12000rpm离心收集RNA;i)然后通过RNA逆 转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP 混合液(Takara公司)、0.5μl RNA酶抑制剂(Takara公司)、1μl AMV(Takara公 司)以及1.5μl单一miRNA对应的反向引物。反应步骤为16℃孵育15分钟,42℃反 应1小时,85℃孵育5分钟;
2.3实时定量PCR
检测样品中miRNAs表达水平使用如下体系:
按下列条件进行qPCR反应:预变性(1循环):95℃30s;循环反应(40循环): 95℃10s+60℃30s;溶解曲线(1循环):95℃15s+60℃1min+95℃15s。检测并比较 正常对照组和复发性流产病例组血清中miRNA表达量的变化。分析引物的特异性及扩 增效率,根据溶解曲线判断引物的反应的特异性。各组样本miRNA的表达量比值可用 方程2–△G表示,其中△G=CT group1–CT group2。为保证各次实验间的可比性,我们在每板 上都设置了U6,以其表达量作为内参调整计算表达量。
3结果
根据结果分析得出,hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656这3条miRNA在两组之间均有显著差别(如图3所示),并且与绒毛组织中表达趋势水平一致,进一 步验证了上述miRNAs应用于复发性流产辅助诊疗的可能性。
实施例4:个体血清miRNA表达量的稳定性分析
1材料
1.1研究对象选择和样本采集
本实施例的研究对象选择和样本采集同实施例1。从中选取6名(3名对照组和3 名复发性流产病例组)成人,连续三次采集研究对象血清(间隔时间为1周,间隔期 内无疾病)作为样本。
1.2试剂
qPCR所用试剂同实施例1。
2方法
采用实施例3的方法对20名(10名对照组和10名复发性流产病例组)成人血 清miRNA水平的稳定性进行评价。
3结果
血清中hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656这3条miRNA表达水平较稳定(如图4所示)。这些都说明上述个体血清miRNA的表达量较为稳定,具备作为 诊断标志物的特性。
实施例5:miRNA组合对复发性流产的判断
当对hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656这三个标志物的表达水平进行分 层评分时(五分位数分层后累加),能够对是否会发生复发性流产进行评估,表述为积分越高,确认为复发性流产的风险越高。
表1三个miRNAs五分位数得分并求和
注:每个miRNA按表达量的五分位数分为五个等级0、1、2、3、4,最低的0分,最高的4分,3条miRNA综合可以得分为0~12分,而正常对照组绝大多数得分很低(表达量低,积分按反向计 算),而复发性流产绝大多数得分很高。举例来说,如有一个样本评分为12分(最高的分值组), 则其应为复发性流产。
针对得出的评估分值(即根据具体得分判断其分组,得高分的归入复发性流产组,得低分的归入对照组;比较而言,≥9为高分,≤3为低分),对另一组独立采 集的人群进行盲法首诊,即采用双盲试验,对独立人群(另一医院采集的40例孕妇) 同时进行常规诊断分析和血清样品的miRNA检测,结果显示通过3个miRNA检测评 分,可以将复发性流产患者及正常对照很好的区分开(40例随机选择样本中有10例 评分较高(≥9分),其中达到12分(最高分)的有3例,这3例经诊断均为复发 性流产患者,其余评分较低(≤3分)的均为正常对照),说明这几种miRNA可作为 评估复发性流产的标志物。
实施例6:用于复发性流产监测和风险评估的miRNA诊断试剂盒的制备
本发明的miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程主要基于上述qRT-PCR技术。首 先通过miRNA芯片的方法筛选出对照组和复发性流产病例组具有差异的miRNA,并 用qRT-PCR方法验证两组中差异的候选miRNA。结合生物信息学,最后筛选出对应 的血清miRNA的数量控制在3条,以此作为复发性流产监测和风险评估的指标。
所述试剂盒包括至少一组血清miRNA引物组,其中miRNA引物组包括 hsa-let-7i-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-3656、U6的正反向引物(见表1)。还可以包 括相关PCR技术常用的试剂,如Taq酶、PCR缓冲液、MgCl2、三磷酸碱基脱氧核苷 酸混合液、染料等试剂,这些试剂也可采用相应的市售产品。本发明试剂盒的优势在 于只需要一次提供少量血液(2ml),即可检测血清miRNA生物标志物的变化趋势, 再通过该变化趋势来预测复发性流产发生的可能性,并易于进行动态监测。
根据本发明一种优选实施方式,试剂盒含有以下三对引物:SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9,各 10μM 0.25μl。
试剂盒中还可以含有0.3μl Taq酶,1μl 20×EVA GREEN,1.2μl 25mM MgCl2,1.6μl 2.5mM dNTP混合液,2μl 10×PCR缓冲液,12.4μl纯水。
试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(表1)。
或者试剂盒中除正向引物外还含有1μl 10μM通用反向引物,10μl TaqMan通用PCR混合液,6.6μl H2O。
试剂盒中的组分除引物外的试剂可以采用现有技术中用于miRNA含量检测的相应试剂。
上述实验结果表明,hsa-let-7i-5p和hsa-miR-132-3p在病例血清中的表达量显著高 于对照组,而hsa-miR-3656在病例血清中的表达量显著低于对照组,同时这些miRNAs在血清中表达具有稳定性。采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3构成的组合 可以将对照组、病例组区分开。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本 技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (8)
1.一组用于诊断复发性流产的血清microRNA标志物,其特征在于,所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第一microRNA、与SEQID NO:2所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有90%以上同源性的第三microRNA。
2.根据权利要求1所述的血清microRNA标志物,其中,所述血清microRNA标志物包括:与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第一microRNA、与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第二microRNA和与SEQ ID NO:3所示核苷酸序列具有95%以上同源性的第三microRNA。
3.根据权利要求1所述的血清microRNA标志物,其中,所述血清microRNA标志物包括:具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第一microRNA、具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的第二microRNA和具有如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的第三microRNA。
4.用于检测权利要求1-3中任意一项所述的血清microRNA标志物的引物组,其特征在于,所述引物组包括以下引物:
用于检测第一microRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第二microRNA的上游引物和下游引物;
用于检测第三microRNA的上游引物和下游引物。
5.根据权利要求4所述的引物组,其中,
用于检测第一microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列;
用于检测第二microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列;
用于检测第三microRNA的上游引物具有SEQ ID NO:8所示核苷酸序列,下游引物具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列。
6.权利要求1-3中任意一项所述的血清microRNA标志物和/或权利要求4或5所述的引物组在制备复发性流产诊断或监测试剂中的应用。
7.一种复发性流产诊断或监测试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括权利要求4或5所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包括:
(1)内参U6的正反向引物;和/或
(2)DNA聚合酶、通用反向引物URP、PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、水和核酸染料中的至少一种。
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