JP6616983B2 - 軽度認知障害を検査する方法 - Google Patents
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<1> 下記(a)〜(b)の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法
(a)被検体から分離された生体試料における、下記miRNA群から選択される少なくとも2のmiRNAの発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出したmiRNAの発現レベルから、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する工程、
miRNA群:hsa−miR−101、hsa−miR−191、hsa−miR−103、hsa−miR−222、hsa−miR−192、hsa−miR−197、hsa−miR−19b、hsa−miR−223、hsa−miR−590−5p、hsa−miR−378、hsa−miR−125b、hsa−miR−24、hsa−miR−320a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−20a、hsa−miR−106a、hsa−let−7b、hsa−miR−18a、hsa−miR−484、hsa−miR−152。
<2> <1>に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、下記miRNA群から選択される少なくとも1のmiRNAにハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤
miRNA群:hsa−miR−101、hsa−miR−191、hsa−miR−103、hsa−miR−222、hsa−miR−192、hsa−miR−197、hsa−miR−19b、hsa−miR−223、hsa−miR−590−5p、hsa−miR−378、hsa−miR−125b、hsa−miR−24、hsa−miR−320a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−20a、hsa−miR−106a、hsa−let−7b、hsa−miR−18a、hsa−miR−484、hsa−miR−152。
1.記憶障害の訴えが本人または家族から認められている
2.日常生活動作は正常
3.全般的認知機能は正常
4.年齢や教育レベルの影響のみでは説明できない記憶障害が存在する
5.認知症ではない
(Petersenら、Arch Neurol.、2001年、58巻、1985〜1992ページ、Petersenら、Arch Neurol.、2005年、62巻、1160〜1163ページ 参照)。
hsa−miR−191は、典型的には、miRBaseデータベース(http://www.mirbase.org/)のアクセッション番号:MIMAT0000440によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−103は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000101によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−222は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000279によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−192は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000222によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−197は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000227によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−19bは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000074によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−223は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000280によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−590−5pは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0003258によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−378は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000732によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−125bは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000423によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−24は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000080によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−320aは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000510によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−140−3pは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0004597によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−20aは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000075によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−106aは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000103によって規定されるmiRNAである
hsa−let−7bは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000063によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−18aは、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000072によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−484は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0002174によって規定されるmiRNAである
hsa−miR−152は、典型的には、miRBaseデータベースのアクセッション番号:MIMAT0000438によって規定されるmiRNAである。
後述の実施例において示す通り、30の健常体及び23の軽度認知障害(MCI)の患者に由来するmiRNAにて構成されたデータセット(143のmiRNA)を対象として共発現差解析(相関係数の差の解析)を行った結果、hsa−miR−101等の20のmiRNAから構成されるmiRNAペアの発現レベルを指標とすることによって、軽度認知障害患者と健常体とを高い精度にて判別できることが明らかになった。したがって、本発明においては、これらmiRNAペアの発現レベルを指標とする、下記(a)〜(b)の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法が提供される。
(a)被検体から分離された生体試料における、下記miRNA群から選択される少なくとも2のmiRNAの発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出したmiRNAの発現レベルから、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する工程、
miRNA群:hsa−miR−101、hsa−miR−191、hsa−miR−103、hsa−miR−222、hsa−miR−192、hsa−miR−197、hsa−miR−19b、hsa−miR−223、hsa−miR−590−5p、hsa−miR−378、hsa−miR−125b、hsa−miR−24、hsa−miR−320a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−20a、hsa−miR−106a、hsa−let−7b、hsa−miR−18a、hsa−miR−484、hsa−miR−152。
上述の通り、本発明の検査方法においては、miRNAの発現レベルを検出することにより、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することができる。したがって、本発明は、上述の検査方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、下記miRNA群から選択される少なくとも1のmiRNAにハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤を提供する。
本実施例において解析した、30人の健常人対照群(ノーマル、男性12人、女性18人)、23のMCI患者群(男性11人、女性12人)及び15人のアルツハイマー病(AD)患者(男性3人、女性12人)を、サンプル数、平均年齢及びMMSE(ミニメンタルステート検査)スコアと共に、表1に示す。なお、全てのMCI患者は、上記Petersenらの定義により、軽度認知障害と診断された患者である。また、全てのAD患者は、米国の国立神経障害・脳卒中研究所(U.S. National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke)及びアルツハイマー病・関連障害協会(Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association)が定めた診断基準、又は、日本に於けるアルツハイマー病脳画像診断法の先導的研究(J−ADNI)が定めた診断基準に基づき、ADに罹患していると診断された患者である(なお、前者の診断基準については、McKhann,G.ら、Neurology、1984年、34巻、7号、939〜944ページ 参照のこと)。さらに、全てのAD患者は、アリセプト(ドネぺジル)が服薬されていない患者である。また、健常人は、前記Petersenらの定義及び前記ADに関する診断基準に基づき、これら疾患に罹患していないことが明らかになった人である。
上記被検体から分離された血漿からトータルRNAを、miRNeasyミニキット(Qiagen社製)を用い、そのメーカー説明書に記載の方法に改良を加えて行った。すなわち先ず、血漿を氷上で融かした後、4℃に設定した微小遠心機に入れ、3000×gにて5分間遠心処理した。1サンプルあたり200μLの血漿アリコートを新しいチューブに移し、1.25μg/mL MS2バクテリオファージRNA(Roche Applied Science社製)を含むQiazol混合液750μLを加えた。チューブの中の内容物を混合し、5分間インキュベーションした後、200μLのクロロホルムを加ええた。さらにチューブの中の内容物を混合し、2分間インキュベーションした後、4℃に設定した微小遠心機に入れ、12000×gにて15分間遠心処理した、。次いで、上部水層を新しい微小遠心チューブに移し、1.5倍量の100%エタノールを添加した。そして、チューブの内容物を完全に混合した後、750μLのサンプルを、回収チューブに備えたQiagen RNeasyミニスピンカラムに移し、室温下、15000×gにて30秒間遠心した。全ての残余サンプルを載せるまで、この工程を繰り返した後、スピンカラムを700μLのQiagenRWTバッファーにてリンスし、室温下、15000×gにて1分間遠心した。次いで、500μLのQiagenRPEバッファーにてもう1回リンスし、室温下、15000×gにて1分間遠心した。この500μLのQiagenRPEバッファーによるリンス工程を2回繰り返した後、スピンカラムを新しい回収チューブに移し、室温下、15000×gにて、2分間遠心した。次いで、スピンカラムを新しい微小遠心チューブに移し、1分間蓋を開けたままにし、カラムを乾燥させた。そして、スピンカラムのメンブレンにRNaseフリーの水50μLを加え、1分間インキュベーションし、次いで、室温下、15000×gにて1分間遠心することにより、トータルRNAを抽出した。得られたRNAは−80℃に保存した。
先ず、前記にて調製したRNA抽出液19.2μLに、miRCURY LNA(登録商標)ユニバーサルRTcDNA合成キット(Exiqon社製)を加え、計80μLの反応液とし、逆転写反応に供した。得られたcDNA産物を57.25倍希釈し(80μLのcDNA反応液に4500μLの水を加えて)、miRCURY LNA(登録商標)ユニバーサルRTマイクロRNA PCRシステムのプロトコールに従って、10μL PCR反応を行った。より具体的には、マイクロRNA Ready−to−Use PCR, ヒト パネル1及びパネル2、V2を用い、qPCRによって各マイクロRNAについて1回解析を行った。また、逆転写反応から鋳型RNAを除去したサンプルを陰性対照として分析し、他のサンプル同様にプロファイリングした。次に、ライトサイクラー(登録商標)480リアルタイムPCシステム(Roche社製)及び384ウェルプレートを用いて、増幅反応を行った。得られた増幅曲線は、Roche LCソフトウェア(ver 1.5)を用い、第2誘導法によるCpの決定及び融解曲線分析によって分析した。
先ず、生データを、ライトサイクラー480ソフトウェアから抽出した。そして、GenExソフトウェア(Exiqon社製)を用いて、データ分析を行った。結果、クロッシングポイント(Cp)が37未満である、またはネガティブコントロールのCpよりも少なくとも3低い、検定データ値を、データ解析に含める値として全て検出した。これらの基準を満たさないデータは、いかなる解析から除外した。また、LinRegPCRソフトウェアを用いて、増幅効率を算出した。そして、増幅効率が1.6未満である反応も除外した。さらに、全てのデータは、各サンプルにおいて検出された平均分析値に正規化した(dCp=平均Cp[<37]−分析Cp)。
前述の通り、表2に示す85のmiRNAを対象として、従来からよく利用されている伝統的な解析法 t検定によって、MCI患者において発現が上方制御又は下方制御されているmiRNAを、MCIのバイオマーカーとして探索した。t検定において、各miRNAにおけるp値をバイオマーカーとしての有効性の評価基準とした。例えば、0.05未満の小さいp値をとるmiRNAを、MCI患者において上方制御又は下方制御されているmiRNAとして評価した。このようにして、miRNAの発現量に応じ、患者候補を予測することができる。
健常人対照群とMCI患者群との相関係数の差を調べる手法、共発現差解析によって有効なMCIマーカーを検出することを、以下の方法にて試みた。
logp/(1−p)=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β4X4+β5X5+β12X1X2+β13X1X3+β45X4X5
という判別式を作成する。
年齢を合わせた30の健常人対照群及び23のMCI患者群由来の、85のmiRNAにて構成されたデータセットを対象として、従来からよく利用されている伝統的なt検定を行った。
年齢を合わせた30の健常人対照群及び23のMCI患者群由来の、85のmiRNAにて構成されたデータセットを対象として、共発現差解析を行った。すなわち、85のmiRNAがとり得る3570のペアから、健常人とMCI患者とを有意に判別できるバイオマーカー(|r1−r2|が0.8以上を示すmiRNAのペア)として、20のmiRNAのペアを選択した(表4 参照)。なお、これら20のmiRNAペアによるAUCは、0.800±0.051であった。
Claims (4)
- 下記(a)〜(b)の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法(但し、人間に対する医師による診断行為を除く)
(a)被検体から分離された生体試料における、hsa−miR−101及びhsa−miR−191の発現レベルを検出する工程、
(b)工程(a)で検出したmiRNAの発現レベルから前記被検体が軽度認知障害を有している確率を算出し、当該確率が閾値と比較して高い場合、前記被検体が軽度認知障害を有していると判断する工程。 - 請求項1に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有し、hsa−miR−101にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、及び
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有し、hsa−miR−191にハイブリダイズする、オリゴヌクレオド
を含む薬剤。 - 前記工程(a)が、被検体から分離された生体試料における、下記miRNA群から選択される少なくとも1のmiRNAの発現レベルを、更に検出する工程である、請求項1に記載の軽度認知障害を検査する方法(但し、人間に対する医師による診断行為を除く)
miRNA群:hsa−miR−103、hsa−miR−222、hsa−miR−192、hsa−miR−197、hsa−miR−19b、hsa−miR−223、hsa−miR−590−5p、hsa−miR−378、hsa−miR−125b、hsa−miR−24、hsa−miR−320a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−20a、hsa−miR−106a、hsa−let−7b、hsa−miR−18a、hsa−miR−484、hsa−miR−152。 - 請求項3に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有し、hsa−miR−101にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有し、hsa−miR−191にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、及び
少なくとも15ヌクレオチドの鎖長を有し、下記オリゴヌクレオチド群から選択されるいずれかのmiRNAにハイブリダイズする、少なくとも1のオリゴヌクレオチドを含む薬剤
miRNA群:hsa−miR−103、hsa−miR−222、hsa−miR−192、hsa−miR−197、hsa−miR−19b、hsa−miR−223、hsa−miR−590−5p、hsa−miR−378、hsa−miR−125b、hsa−miR−24、hsa−miR−320a、hsa−miR−140−3p、hsa−miR−20a、hsa−miR−106a、hsa−let−7b、hsa−miR−18a、hsa−miR−484、hsa−miR−152。
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