JP2021112167A - うつ病の診断補助方法及び診断用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】うつ病の診断を補助する方法、及びうつ病の診断用キットの提供。【解決手段】被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む、うつ病の診断を補助する方法、及び該特定のmiRNAを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、うつ病の診断用キット。【選択図】なし
Description
本発明は、うつ病の診断を補助する方法及び診断用キットに関する。
わが国では100万人のうつ病患者が医療機関を受診している。しかしながら、その診断においては、医師が、患者本人への問診や家族への聞き取りの結果に基づいて、特定の症状の有無を評価する方法で実施されている。うつ病の診断基準は、特定の症状がどの程度続いているかに基づいており、部分的に患者等の主観的評価が含まれるため、客観的な評価方法とは言い難い。
うつ病を客観的に評価する方法として、ゲノム情報、脳画像情報など様々な方法が提案されているが、いずれも感度・特異度が低く、実臨床には応用されていない。
うつ病を客観的に評価する方法として、ゲノム情報、脳画像情報など様々な方法が提案されているが、いずれも感度・特異度が低く、実臨床には応用されていない。
近年、バイオマーカーとしてのマイクロRNA（miRNA）の利用が盛んに研究されている。うつ病に関しても、血液中の特定のmiRNAが診断マーカーとして利用可能であることを示唆する報告が散見される（非特許文献１−３）。しかしながら、エクソソームに内包されるmiRNAとうつ病との関連を調べた報告は、これまで皆無である。
また、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497の5種のmiRNAがうつ病の診断マーカーとなり得ることは、これまで全く知られていない。一方、hsa-miR-106a-5p及びhsa-miR-26b-5pの血清又は血漿中レベルは、うつ病患者やマウスモデルで増加しているとの報告がある（非特許文献１−３）。
Journal of Affective Disorders, 2014, 163:133-139
Acta Psychiatrica Scandinavica, 2017, 136(6):594-606
Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10):7021-7028
本発明の課題は、確度の高い新規うつ病診断マーカーを同定し、該マーカーを指標として、客観的にうつ病を診断する手段を提供することにある。
本発明者らは、マイクロアレイを用いた網羅的解析により、健常者の血液由来のエクソソームからは検出されるが、うつ病患者の血液由来のエクソソームからは検出されないか低値である7種の特定のmiRNAを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[1] 被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む、うつ病の診断を補助する方法であって、該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである、方法。
[2] 生体試料が体液である、[1]に記載の方法。
[3] 体液が、血液、血清又は血漿である、[2]に記載の方法。
[4] うつ病の診断用キットであって、hsa-miR-106a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-20a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-26b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-204-3pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、並びにhsa-miR-4497を特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーからなる群から選択される少なくとも1つの核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、キット。
[5] うつ病の診断及び治療方法であって、
（1）被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定すること、
（2）前記測定により該特定のmiRNAのレベルが、検出限界以下であるか、あるいは対照値と比較して低値であった場合に、該被験者はうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断すること、及び
（3）うつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断された被験者に抗うつ療法を実施すること、
を含み、該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである、方法。
[1] 被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む、うつ病の診断を補助する方法であって、該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである、方法。
[2] 生体試料が体液である、[1]に記載の方法。
[3] 体液が、血液、血清又は血漿である、[2]に記載の方法。
[4] うつ病の診断用キットであって、hsa-miR-106a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-20a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-26b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-204-3pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、並びにhsa-miR-4497を特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーからなる群から選択される少なくとも1つの核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、キット。
[5] うつ病の診断及び治療方法であって、
（1）被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定すること、
（2）前記測定により該特定のmiRNAのレベルが、検出限界以下であるか、あるいは対照値と比較して低値であった場合に、該被験者はうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断すること、及び
（3）うつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断された被験者に抗うつ療法を実施すること、
を含み、該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである、方法。
本発明によれば、客観的にうつ病の診断を可能にする検査方法、及びそのためのキットが提供される。
1. うつ病の診断を補助する方法
本発明は、うつ病の診断を補助する方法（以下、「本発明の診断補助方法」と称する場合がある。）を提供する。当該方法は、具体的には、被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む。当該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである。これら7種のmiRNA（以下、「本発明のマーカーmiRNA」ともいう。）は、健常者から採取されるエクソソームからは検出されるが、うつ病患者から採取されるエクソソームからは実質的に検出されないか、あるいは正常値と比較して低値である。ここで「実質的に検出されない」とは、少なくともマイクロアレイ解析レベルでは、検出限界以下であることを意味する。
本発明は、うつ病の診断を補助する方法（以下、「本発明の診断補助方法」と称する場合がある。）を提供する。当該方法は、具体的には、被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む。当該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである。これら7種のmiRNA（以下、「本発明のマーカーmiRNA」ともいう。）は、健常者から採取されるエクソソームからは検出されるが、うつ病患者から採取されるエクソソームからは実質的に検出されないか、あるいは正常値と比較して低値である。ここで「実質的に検出されない」とは、少なくともマイクロアレイ解析レベルでは、検出限界以下であることを意味する。
本発明の診断補助方法において、「うつ病の診断を補助する」とは、被験者がうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いか否かの判断のための指標となる情報を提供することをいい、医療行為である、うつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いか否かを判断する工程自体を含まないことを意味する。
本発明において、うつ病とは、気分障害の一種であり、抑うつ気分、意欲・興味・精神活動の低下、焦燥、食欲低下、不眠、持続する悲しみ・不安などを特徴とした精神障害である。アメリカ精神医学会（APA）の『精神障害の診断と統計マニュアル』第5版（DSM-5）において、「抑うつ障害群」に分類されるいずれのうつ病性障害も本発明における「うつ病」に包含される。
本発明の診断補助方法において、被験者は、ヒトであれば特に限定されない。被験者としては、例えば、うつ病に罹患していることが疑われるヒトなどが挙げられる。
本発明の診断補助方法において、生体試料は、被験者から得られたものであって、エクソソームを含むものであれば特に限定されず、例えば、体液、組織もしくは細胞の培養上清等が挙げられる。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、尿及び唾液等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿又は血清等である。組織としては、例えば、脳組織等が挙げられ、細胞としては、当該組織から得られる細胞集団が挙げられる。被験者への侵襲が少ない点から、生体試料は体液が好ましい。組織もしくは細胞の培養上清を用いる場合、これらの組織もしくは細胞は、自体公知の適切な条件下で培養することができる。好ましい一実施態様においては、該組織もしくは細胞は、血清（例、ウシ胎仔血清（FBS）等）を含む培地中で培養されるが、血清には原料動物由来のエクソソームが含まれるため、予めエクソソームが除去された血清を使用すべきである。エクソソームが除去された血清の調製は、例えば、エクソソームの粒子径よりも小さい孔径を有するフィルターに血清を通し、通過液を得ることにより行うことができる。
本発明の診断補助方法においては、生体試料からエクソソームを単離した後で内包されるmiRNAを測定する。エクソソームは、公知の方法によって生体試料から得ることができる。そのような方法としては、例えば、遠心法、密度勾配遠心法、超遠心法、ポリマー沈殿法、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた分離法及びアフィニティーを利用した分離法等が挙げられる。また、市販のキットを添付のプロトコールに従って用いることによって、生体試料からエクソソームを得てもよい。市販のキットとしては、例えば、ExoQuick（System Biosciences）、EVSecond (GL Sciences)、Total Exosome Isolation Kit（Invitrogen）及びCD9 Exo-Flow capture kit（System Biosciences）等が挙げられる。
あるいは、後述の実施例に示すとおり、孔径がエクソソームの粒径よりも小さいフィルター（例えば、孔径が50 nmのフィルター）に生体試料を通すことによっても、簡便にエクソソームを単離することができる。エクソソームは、孔径がエクソソームの粒径よりも小さいフィルターを通ることができずに捕捉されるため、緩衝液等を逆流させることによって当該フィルターで捕捉されたエクソソームを得ることができる。別の好ましい一実施態様においては、孔径が異なる2種類以上のフィルターを用いて、生体試料からエクソソームを得ることができる。即ち、孔径がエクソソームの粒径よりも大きいフィルター（例えば、孔径が220 nmのフィルター）、及び孔径がエクソソームの粒径よりも小さいフィルター（例えば、孔径が50 nmのフィルター）に連続して生体試料を通し、緩衝液等を逆流させることによって、孔径がエクソソームの粒径よりも小さいフィルターに捕捉されたエクソソームを得ることができる。
本発明の診断補助方法において、測定対象となるmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである。
当該miRNAは既に公知の分子であり、その配列情報はmiRBase（http://www.mirbase.org/）等のデータベースから入手可能である。hsa-miR-106a-5pはAccession No. MIMAT0000103として、hsa-miR-15a-5pはAccession No. MIMAT0000068として、hsa-miR-20a-5pはAccession No. MIMAT0000075として、hsa-miR-26b-5pはAccession No. MIMAT0000083として、hsa-miR-15b-5pはAccession No. MIMAT0000417として、hsa-miR-204-3pはAccession No. MIMAT0022693として、hsa-miR-4497はAccession No. MIMAT0019032として、それぞれmiRBaseに登録されている。本明細書中、hsa-miR-106a-5pのヌクレオチド配列は配列番号1、hsa-miR-15a-5pのヌクレオチド配列は配列番号2、hsa-miR-20a-5pのヌクレオチド配列は配列番号3、hsa-miR-26b-5pのヌクレオチド配列は配列番号4、hsa-miR-15b-5pのヌクレオチド配列は配列番号5、hsa-miR-204-3pのヌクレオチド配列は配列番号6、hsa-miR-4497のヌクレオチド配列は配列番号7で表される。
当該miRNAは既に公知の分子であり、その配列情報はmiRBase（http://www.mirbase.org/）等のデータベースから入手可能である。hsa-miR-106a-5pはAccession No. MIMAT0000103として、hsa-miR-15a-5pはAccession No. MIMAT0000068として、hsa-miR-20a-5pはAccession No. MIMAT0000075として、hsa-miR-26b-5pはAccession No. MIMAT0000083として、hsa-miR-15b-5pはAccession No. MIMAT0000417として、hsa-miR-204-3pはAccession No. MIMAT0022693として、hsa-miR-4497はAccession No. MIMAT0019032として、それぞれmiRBaseに登録されている。本明細書中、hsa-miR-106a-5pのヌクレオチド配列は配列番号1、hsa-miR-15a-5pのヌクレオチド配列は配列番号2、hsa-miR-20a-5pのヌクレオチド配列は配列番号3、hsa-miR-26b-5pのヌクレオチド配列は配列番号4、hsa-miR-15b-5pのヌクレオチド配列は配列番号5、hsa-miR-204-3pのヌクレオチド配列は配列番号6、hsa-miR-4497のヌクレオチド配列は配列番号7で表される。
hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497の各miRNAは、天然で生じる多型、突然変異等による変異（ヌクレオチドの置換、欠失、挿入又は付加）を含んでもよく、従って、本発明の診断補助方法においては、そのような変異を含むmiRNAの発現レベルが測定されてもよい。
miRNAの発現レベルは、各miRNA又はその相補的核酸（cRNA又はcDNA）を特異的に検出し得る核酸プローブ又は核酸プライマーを用いて、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等の自体公知の方法により測定することが出来る。そのような測定方法としては、例えば、miRNAアレイ、ノーザンブロッティング、定量PCR（リアルタイムPCR等）等を挙げることができる。
miRNAの発現レベルの測定は、被験者から得られた生体試料中のエクソソームに由来するmiRNAを対象として行う。miRNAを抽出する方法は、被験者から得られた生体試料中のエクソソームから、miRNAを含むRNA（例えば、total RNA）を抽出する方法である限り特に限定されず、例えば、市販の試薬（例えば、ISOGEN（Nippongene）、QIAZOL（Qiagen））やキット（例えば、NucleoSpin miRNA Plasma Kit（Macherey-Nagel）、フェノールベース試薬Tripure Isolation Reagent（Roche Applied Science）、液体試料用フェノールベース試薬ISOGEN-LS（ニッポンジーン）、miRNeasy Mini Kit（Qiagen）、RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen）等）を添付のプロトコールに従って用いることによって、miRNAを含むRNAを抽出することができる。あるいは、被験者から得られた生体試料から、エクソソームに内包されるmiRNAを含む全RNAを抽出してもよい。例えば、Plasma/Serum Exosome Purification and RNA Isolation（Norgen Biotek Corp.）等の市販の試薬やキットを用いて、エクソソーム中のmiRNAを含む全RNAを抽出することができる。
また、被験者から得られた生体試料からエクソソーム中のmiRNAを含む全RNAを抽出した後、更にmiRNAを単離してもよい。miRNAの単離は、自体公知の方法により行なうことができ、例えば、市販の試薬やキット（例えば、RNeasy Mini Column（Qiagen）、High Pure miRNA Isolation Kit（Roche Applied Science）等）を添付のプロトコールに従って用いることによって実施することができる。ここで「miRNAの単離」とは、miRNA以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。
miRNAの発現レベルの測定においては、上記miRNAの抽出及び単離に起因する試料間のばらつきを補正するために、適切な内部標準でmiRNAの発現レベルを補正することが好ましい。内部標準は、被験者由来の試料に天然に含まれいれば特に限定されない。例えば、U6等を内部標準とすることができる。
本明細書において、核酸プローブが「miRNA又はその相補的核酸を特異的に検出し得る」とは、核酸プローブがmiRNA又はその相補的核酸に対して、当該miRNA又はその相補的核酸以外の核酸に対するよりも高いアフィニティーを有することにより、適切なハイブリダイゼーション条件下で当該miRNA又はその相補的核酸にはハイブリダイズするが、その他の核酸へはハイブリダイズしないことを意味する。
このようなハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件として、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1%SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC、0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、0.1×SSC、0.1%SDSである。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては、温度や塩濃度等の複数の要素があり、当業者はこれらの要素を適宜選択することで、同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
miRNA又はその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブとしては、例えば、当該miRNAのヌクレオチド配列の一部又は全部に相補的な約10塩基以上（例えば、10〜24塩基、好ましくは15〜24塩基）の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含み、当該miRNA又はその相補的核酸にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドを挙げることができる。そのような核酸プローブは、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の情報等に基づいて、自体公知の方法により適宜設計することができる。あるいは、市販の核酸プローブを用いることもできる。例えば、配列番号1〜7で表される各ヌクレオチド配列からなるmiRNA又はその相補的核酸は、それぞれThermoFisher Scientific社から提供されるhsa-miR-106a-5p（Assay ID: 478225_mir）、hsa-miR-15a-5p（Assay ID: 477858_mir）、hsa-miR-20a-5p（Assay ID: 000580）、hsa-miR-26b-5p（Assay ID: 478418_mir）、hsa-miR-15b-5p（Assay ID: 000390）、hsa-miR-204-3p（Assay ID: 463101_mat）及びhsa-miR-4497（Assay ID: 479836_mir）定量キットに含まれる核酸プローブを用いて検出することができる。
本明細書において、核酸プライマーが「miRNA又はその相補的核酸を特異的に検出し得る」とは、核酸プライマーが、適切なPCR反応条件下において、当該miRNA又はその相補的核酸を鋳型として、その全部又は一部の領域をPCR増幅するが、当該miRNA又はその相補的核酸以外の核酸を鋳型として、その全部又は一部の領域をPCR増幅しないことを意味する。
miRNAを特異的に検出し得る核酸プライマーは、当該miRNA又はその相補的核酸のヌクレオチド配列の一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。PCRによるmiRNAの定量は、通常、ポリ(A)ポリメラーゼにより3'末端にポリ(A)配列を付加し、オリゴ（dT）プライマーを用いた逆転写反応によりcDNAを合成した後、当該cDNAを定量することにより行なう。この場合、各miRNAの相補的核酸（cDNA）のヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約10塩基以上（例えば、10〜24塩基、好ましくは15〜24塩基）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（フォワードプライマー）と、このハイブリダイゼーション部位より3’側の当該cDNA配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約10塩基以上（例えば、10〜24塩基、好ましくは15〜24塩基）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（リバースプライマー）との組み合わせにより、各miRNA又はその相補的核酸のヌクレオチド配列の一部又は全部の領域を特異的に増幅し得る。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、各miRNA又はその相補的核酸のヌクレオチド配列、前記逆転写反応の際に使用するプライマーの配列等の情報に基づき、自体公知の方法により適宜設計することができる。あるいは、市販の核酸プライマーを用いることもできる。例えば、配列番号：1〜7で表される各ヌクレオチド配列からなるmiRNAの相補的核酸の特異的な増幅には、それぞれThermoFisher Scientific社から提供されるhsa-miR-106a-5p（Assay ID: 478225_mir）、hsa-miR-15a-5p（Assay ID: 477858_mir）、hsa-miR-20a-5p（Assay ID: 000580）、hsa-miR-26b-5p（Assay ID: 478418_mir）、hsa-miR-15b-5p（Assay ID: 000390）、hsa-miR-204-3p（Assay ID: 463101_mat）及びhsa-miR-4497（Assay ID: 479836_mir）定量キットに含まれるプライマーセットを用いることができる。
核酸プローブ及び核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
また、核酸プローブ及び核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、ビオチン等で標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
核酸プローブ及び核酸プライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、またDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また核酸プローブ及び核酸プライマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、通常一本鎖である。なお、本発明において、核酸プローブ及び核酸プライマーがRNAである場合は、核酸プローブ及び核酸プライマーの塩基配列のうち、チミン（T）はウラシル（U）と読み替えてもよい。
核酸プローブ及び核酸プライマーは、人工的な修飾を有する核酸の誘導体であってもよい。人工的な修飾を有する核酸の誘導体としては、例えば、ホスホロチオエート型、ボラノフォスフェート型DNA/RNA等のリン酸骨格を修飾したもの；2'-OMe修飾RNA、2'-F修飾RNA等の2'修飾ヌクレオチド；LNA（Locked Nucleic Acid）やENA（2'-O,4'-C-Ethylene-bridged nucleic acids）等のヌクレオチドの糖分子を架橋した修飾ヌクレオチド；PNA（ペプチド核酸）、モルフォリノヌクレオチド等の基本骨格が異なる修飾ヌクレオチド；5-フルオロウリジン、5-プロピルウリジン等の塩基修飾型ヌクレオチド等が挙げられるがこれらに限定されない。
上記核酸プローブ及び核酸プライマーは、例えば、本明細書に記載されたヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
測定対象のmiRNA又はその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを、適切な支持体の上に結合して、核酸アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ビーズ、ガラス、プラスチック、金属等が挙げられる。
前記のとおり、本発明のマーカーmiRNAは、健常者由来のエクソソームからは検出されるが、うつ病患者由来のエクソソームからは実質的に検出されないか、あるいは正常値と比較して低値である。したがって、miRNAの測定手段として上記核酸アレイを用いる場合、被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内から本発明のマーカーmiRNAが検出されないか、あるいは正常値よりも低値であった場合、該被験者はうつ病に罹患しているか将来罹患する可能性が高いと判断することができる。例えば、miRNAの測定手段として、マイクロアレイ解析を用いる場合、うつ病患者由来のエクソソームからは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p及びhsa-miR-26b-5pは通常検出されない。したがって、被験者から採取した生体試料中のエクソソームにおいてこれらのマーカーmiRNAが検出限界以下であった場合、該被験者はうつ病に罹患しているか将来罹患する可能性が高いと判断することができる。あるいは、被験者から採取した生体試料中のエクソソームにおいて、本発明のマーカーmiRNAのレベルが、予め設定された対照値（カットオフ値）以上、例えば、十分な数（例、5、10、20、30、40又は50名以上）の健常者群から得られたエクソソーム内の該miRNAのレベルの平均値＋3SD以上、好ましくは平均値＋5SD以上であった場合、被験者はうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断することができる。好ましい一実施態様においては、本発明のマーカーmiRNAのレベルが、十分な数の健常者群の血液から得られたエクソソーム内の該miRNAのレベルの最小値の1/3未満であった場合、被験者はうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断することができる。miRNAの測定手段として、定量的リアルタイムPCR等の検出感度の高い方法を用いる場合にも、被験者から採取した生体試料中のエクソソームにおいて、本発明のマーカーmiRNAのレベルが、予め設定された対照値（カットオフ値）以上、例えば、十分な数（例、5、10、20、30、40又は50名以上）の健常者群から得られたエクソソーム内の該miRNAのレベルの平均値＋3SD以上、好ましくは平均値＋5SD以上であった場合や、十分な数の健常者群の血液から得られたエクソソーム内の該miRNAのレベルの最小値の1/3未満であった場合に、被験者はうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断することができる。
2. うつ病の診断及び治療方法
また、本発明は、うつ病の診断及び治療方法を提供する。前記のとおり、本発明の診断補助方法により得られた情報に基づいて、うつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断された被験者に対して、抗うつ療法を実施することができる。抗うつ療法としては、休養、精神療法（例、認知療法、対人関係療法等）、薬物療法等が挙げられる。抗うつ薬としては、うつ病の治療及び／又は予防作用を有する薬剤であれば特に制限はないが、例えば、セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）（例、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム等）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（SNRI）（例、デュロキセチン、ミルナシプラン等）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（NaSSA）（例、ミルタザピン等）、三環系・四環系抗うつ薬（例、アモキサピン、ノルトプリプチリン、クロミプラミン、マプロチリン、ミアンセリン等）などが挙げられる。2種以上の抗うつ薬を併用することもできる。これらの抗うつ薬の投与方法・投与量は、臨床上で通常使用されている用法・用量に従うことができる。
また、本発明は、うつ病の診断及び治療方法を提供する。前記のとおり、本発明の診断補助方法により得られた情報に基づいて、うつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いと判断された被験者に対して、抗うつ療法を実施することができる。抗うつ療法としては、休養、精神療法（例、認知療法、対人関係療法等）、薬物療法等が挙げられる。抗うつ薬としては、うつ病の治療及び／又は予防作用を有する薬剤であれば特に制限はないが、例えば、セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）（例、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム等）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（SNRI）（例、デュロキセチン、ミルナシプラン等）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（NaSSA）（例、ミルタザピン等）、三環系・四環系抗うつ薬（例、アモキサピン、ノルトプリプチリン、クロミプラミン、マプロチリン、ミアンセリン等）などが挙げられる。2種以上の抗うつ薬を併用することもできる。これらの抗うつ薬の投与方法・投与量は、臨床上で通常使用されている用法・用量に従うことができる。
3. うつ病の診断用キット
本発明は、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、うつ病の診断用キットを提供する。以下、「本発明のキット」と称する場合がある。本発明のキットを用いれば、本発明の診断補助方法を容易に実施することが可能となる。
本発明は、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、うつ病の診断用キットを提供する。以下、「本発明のキット」と称する場合がある。本発明のキットを用いれば、本発明の診断補助方法を容易に実施することが可能となる。
本発明のキットにおいて、うつ病は、「1. うつ病の診断を補助する方法」に記載のとおりである。
本発明のキットにおいて、核酸プローブ及び核酸プライマーは、「1. うつ病の診断を補助する方法」に記載のとおりである。本発明のキットに含まれる核酸プローブ及び核酸プライマーは、hsa-miR-106a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-20a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-26b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-204-3pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、並びにhsa-miR-4497を特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーからなる群から選択される少なくとも1つの核酸プローブ及び/又は核酸プライマーである。
本発明のキットは、測定対象の各miRNA又はその相補的核酸を特異的に検出し得る核酸プローブを、適切な支持体の上に結合して、核酸アレイとして提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ビーズ、ガラス、プラスチック、金属等が挙げられる。
本発明のキットに含まれる各構成要素は、各々別個に（或いは可能であれば混合した状態で）水又は適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBS等）中に適当な濃度となるように溶解されるか、或いは凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。
本発明のキットは、miRNAの発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成として更に含んでもよい。本発明のキットにより、例えば、miRNAアレイ、ノーザンブロッティング、定量PCR（リアルタイムPCR等）等によりmiRNAの発現レベルを測定することにより、うつ病の診断を補助することができる。リアルタイムPCRを測定に用いる場合には、本発明のキットは、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5 U/μL）、逆転写酵素等を更に含むことができる。miRNAアレイやノーザンブロッティングを測定に用いる場合には、本発明の検査試薬は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等を更に含むことができる。
以下に実施例等を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例等により限定されるものではない。
（材料及び方法）
うつ病患者13名（男性7名、女性6名）及び健常者13名（すべて男性）から血液を採取し、常法により血清に分離した後、500 μLを50 nmのシリンジフィルター（SFPES013022N、Membrane Solutions Ltd、米国）に通してエクソソームを単離した。次いで、該シリンジフィルターに生理食塩水を通してエクソソームを洗浄した。
うつ病患者13名（男性7名、女性6名）及び健常者13名（すべて男性）から血液を採取し、常法により血清に分離した後、500 μLを50 nmのシリンジフィルター（SFPES013022N、Membrane Solutions Ltd、米国）に通してエクソソームを単離した。次いで、該シリンジフィルターに生理食塩水を通してエクソソームを洗浄した。
1 mLのISOGEN（Nippongene、東京、日本）によって、50 nmフィルターで捕捉されたエクソソームを溶出した。溶出液を200 μLのクロロホルムと混合し、遠心分離した（12,000 xg、15分）。NucleoSpin miRNA Plasma Kit（Macherey-Nagel、Germany）により、製造業者のプロトコルに従って全RNAを精製した。100 μLのH2OでRNAの全量を溶出後、10 μLの3.0 M酢酸カリウム、100 μLのイソプロパノール及び1 μLのPellet PaintでRNAを沈殿させた。ペレットを洗浄及び乾燥後、マイクロアレイに用いるために、RNAを2μLのH2Oで溶解した。Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア、米国）のEukaryote Total RNA Nano Series IIを用いてマイクロRNA精製の検証を行った。
精製したマイクロRNAを使ってマイクロアレイ解析を行った。2,565プローブセットを含むHuman miRNA Oligo chip-4 plex（TORAY、東京、日本）でのマイクロアレイ解析は、製造業者のプロトコルに従って、3D-Geneアレイシステム（TORAY、東京、日本）により、以下のとおり行った。マイクロRNAアレイのために、2 μLのRNA溶液を、Human miRNA Oligoチップとハイブリダイズした。得られた数値（Raw data）は global normalization (Raw dataからback groundを引いた値の中央値が25になるように補正）を実施した。
（結果）
マイクロアレイ解析の結果のまとめを表１に示す。
マイクロアレイ解析の結果のまとめを表１に示す。
（結果）
(1）次の条件を満たすマイクロRNAが4種類（下記）見出された。
条件：健常者全員に値があって、うつ病患者全員に値がない
・hsa-miR-106a-5p
・hsa-miR-15a-5p
・hsa miR-20a-5p
・hsa-miR-26b-5p
(2）次の条件を満たすマイクロRNAが3種類（下記）見出された。
条件1：健常者全員に値がある（うつ病患者に条件なし）
条件2：「健常者の平均値」／「うつ病患者の平均値」が10より大きい
条件3：「健常者の最小値J／「うつ病患者の最大値」が3より大きい
・hsa miR-15b-5p
・hsa-miR-204-3p
・hsa-miR-4497
(3）次の条件を満たすマイクロRNAはなかった。
上記（1）の「健常者」と「うつ病愚者」を入れ替えた場合
上記（2）の「健常者」と「うつ病患者」を入れ替えた場合
(1）次の条件を満たすマイクロRNAが4種類（下記）見出された。
条件：健常者全員に値があって、うつ病患者全員に値がない
・hsa-miR-106a-5p
・hsa-miR-15a-5p
・hsa miR-20a-5p
・hsa-miR-26b-5p
(2）次の条件を満たすマイクロRNAが3種類（下記）見出された。
条件1：健常者全員に値がある（うつ病患者に条件なし）
条件2：「健常者の平均値」／「うつ病患者の平均値」が10より大きい
条件3：「健常者の最小値J／「うつ病患者の最大値」が3より大きい
・hsa miR-15b-5p
・hsa-miR-204-3p
・hsa-miR-4497
(3）次の条件を満たすマイクロRNAはなかった。
上記（1）の「健常者」と「うつ病愚者」を入れ替えた場合
上記（2）の「健常者」と「うつ病患者」を入れ替えた場合
以上の結果から、血清エクソソーム内における上記の7つのマイクロRNAを定量することで、うつ病を診断することが可能であることが示された。
本発明によれば、被験者から得られた、エクソソームを含む生体試料中の特定のmiRNAのレベルを測定することによって、該被験者がうつ病に罹患している又は将来罹患する可能性が高いか否かを、簡便かつ客観的に判定することができる。また、早期段階で、従来法では診断の難しいうつ病患者もしくはその予備群に対しても、診断が可能になる可能性があり、きわめて有用である。
Claims (4)
- 被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のmiRNAのレベルを測定することを含む、うつ病の診断を補助する方法であって、該特定のmiRNAは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも1つである、方法。
- 生体試料が体液である、請求項１に記載の方法。
- 体液が、血液、血清又は血漿である、請求項２に記載の方法。
- うつ病の診断用キットであって、hsa-miR-106a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-20a-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-26b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-15b-5pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、hsa-miR-204-3pを特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマー、並びにhsa-miR-4497を特異的に検出し得る核酸プローブ及び/又は核酸プライマーからなる群から選択される少なくとも1つの核酸プローブ及び/又は核酸プライマーを含む、キット。
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| WO2023199829A1 (ja) * | 2022-04-11 | 2023-10-19 | Ｄｅｘｏｎファーマシューティカルズ株式会社 | 微小粒子、うつ病の予防薬または治療薬およびうつ病の改善方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN110272990A (zh) | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 中央民族大学 | 外泌体microRNA作为抑郁症标志物及其应用 |
-
2020
- 2020-01-20 JP JP2020007168A patent/JP7436004B2/ja active Active
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