WO2023199829A1 - 微小粒子、うつ病の予防薬または治療薬およびうつ病の改善方法 - Google Patents

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WO2023199829A1
WO2023199829A1 PCT/JP2023/014156 JP2023014156W WO2023199829A1 WO 2023199829 A1 WO2023199829 A1 WO 2023199829A1 JP 2023014156 W JP2023014156 W JP 2023014156W WO 2023199829 A1 WO2023199829 A1 WO 2023199829A1
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mir
depression
stem cells
microparticles
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祥嗣 古賀
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Ｄｅｘｏｎファーマシューティカルズ株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants

Definitions

  • the present invention relates to microparticles, a preventive or therapeutic agent for depression, and a method for improving depression.
  • Depression is a chronic and debilitating mental illness that causes feelings of sadness, lack of interest or joy, sleep and appetite disorders, decreased concentration, fatigue, feelings of guilt, and low self-esteem. Depression is one of the most common mental disorders worldwide, and further development of treatment and prevention methods for depression is desired.
  • Non-Patent Document 1 describes the results of a systematic review and bioinformatics analysis of miRNAs expressed in depression and their related pathways, and that changes in miRNAs involved in signal transduction pathways related to affective disorders are triggers of depression. It is stated that it can cause deterioration.
  • Non-Patent Document 1 as a result of bioinformatics analysis of miRNAs that are up-regulated or down-regulated (suppressed) in depression, 30 types of miRNAs out of 77 types of miRNAs examined were It has been described that 24 types of miRNA were up-regulated and down-regulated.
  • Patent Document 1 describes a method for assisting in the diagnosis of depression, which includes measuring the level of a specific miRNA contained in exosomes in a biological sample collected from a subject, in which the specific miRNA is hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-204-3p and hsa- A method is described where at least one selected from the group consisting of miR-4497. Furthermore, Patent Document 1 states that these miRNAs are detected in exosomes collected from healthy individuals, but are substantially not detected in exosomes collected from depressed patients, or are compared to normal values. It is stated that the value is low.
  • Non-Patent Document 1 does not consider introducing the miRNA described in this document into a living body from the outside, nor does it describe the use of microparticles such as exosomes as a means for this purpose. Furthermore, in Patent Document 1, the miRNA described in this document is only used as a biomarker to assist in the diagnosis of depression, and introduction into the body from the outside is not considered, and the method for doing so is not considered. The use of microparticles such as exosomes was also not described.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide microparticles containing a specific miRNA that is attracting attention as a means of treating depression.
  • microparticles containing miRNA whose expression is suppressed in depression or miRNA used for the treatment of depression are discovered that the above problems can be solved by microparticles containing miRNA whose expression is suppressed in depression or miRNA used for the treatment of depression.
  • the present invention and preferred configurations of the present invention are as follows.
  • Depression-related miRNA group hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p,
  • microparticle according to [4] wherein the microparticle contains hsa-let-7a-5p, hsa-let-7f-5p, and hsa-miR-26a-5p from the depression-related miRNA group.
  • microparticle according to [4] wherein the microparticle contains hsa-let-7a-5p from the depression-related miRNA group.
  • microparticle according to [4] wherein the microparticle includes hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, and hsa-miR-320a from the depression-related miRNA group.
  • microparticles are microparticles purified and isolated from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, The microparticle according to [1], wherein the microparticle does not contain components other than the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells except for exosomes.
  • a prophylactic or therapeutic agent for depression comprising the microparticles according to [1].
  • Treatment for depression which comprises administering an effective amount of the microparticles according to [1] or an effective amount of the prophylactic or therapeutic agent for depression according to [9] to a subject who has developed depression. How to improve.
  • microparticles containing a specific miRNA that is attracting attention as a means of treating depression.
  • FIG. 1 is a heat map showing the expression level of miRNA expressed in exosomes (microparticles of Example 1) purified from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles of the present invention are microparticles containing miRNA whose expression is suppressed in depression.
  • the microparticles of the present invention contain specific miRNAs that are attracting attention as a means of treating depression.
  • preferred embodiments of the microparticles of the present invention will be explained.
  • Depression is a type of mood disorder, which includes depressed mood, decreased motivation, interest, and mental activity, irritability, loss of appetite, insomnia, persistent sadness and anxiety, decreased concentration, fatigue, feelings of guilt, and decreased self-esteem. It is a mental disorder characterized by In the American Psychiatric Association (APA)'s "Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders," 5th edition (DSM-5), any depressive disorder that is classified as a "depressive disorder group” is considered “depression” in the present invention. included in Furthermore, both major depression and bipolar disorder are included in the term “depression” in the present invention.
  • ⁇ Mechanism of depression> The pathogenesis of depression is not precisely understood and remains unclear. It is believed that there is some kind of disorder in the brain function or signal transmission pathway that controls emotions and motivation. These disorders are thought to be caused by genetic factors, environmental factors such as stress, physical factors such as chronic fatigue and disease, and abnormal neuroplasticity caused by changes in gene expression programs in the brain. ing.
  • the microparticles of the present invention can improve depression.
  • the antidepressant and its mechanism of action will be explained together with the mechanism of action of the microparticles of the present invention.
  • the microparticles of the present invention include hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa -miR-107, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-320a , hsa-miR-532-5p, hsa-miR-590-5p, and hsa-miR-650, it functions as a supplement for miRNA that is down-regulated in depression.
  • Replenishment of miRNAs that are downregulated in depression may be replenishment of miRNAs that are downregulated in any body fluid or in any tissue of a patient with depression.
  • body fluids include blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, lymph, urine, and saliva.
  • blood, plasma, serum, etc. are used.
  • tissue include brain tissue, and examples of the cells include cell populations obtained from the tissue.
  • the supplementation is of miRNAs that are downregulated in the blood, plasma or serum of patients with depression, and more preferably of miRNAs that are downregulated in the blood.
  • Conventional depression treatment drugs include, for example, serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) (e.g., fluvoxamine, paroxetine, sertraline, escitalopram, etc.), serotonin noradrenaline reuptake inhibitors (SNRIs) (e.g., duloxetine, milnacipran, etc.), noradrenergic/specific serotonergic antidepressants (NaSSA) (e.g., mirtazapine, etc.), tricyclic/tetracyclic antidepressants (e.g., amoxapine, nortopuri), Ptyline, clomipramine, maprotiline, mianserin, etc.).
  • SSRIs serotonin reuptake inhibitors
  • SNRIs serotonin noradrenaline reuptake inhibitors
  • NaSSA noradrenergic/specific serotonergic antidepressants
  • microparticles of the present invention are derived from dental pulp-derived stem cells, for example, by secretion, budding, or dispersion from mesenchymal stem cells such as dental pulp-derived stem cells, and are leached, released, or shed into the cell culture medium.
  • the microparticles are preferably contained in the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, and more preferably are microparticles derived from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles derived from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells do not necessarily need to be obtained from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles inside dental pulp-derived stem cells are isolated by any method, if they are the same as the microparticles that can be isolated from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, then It can be said that they are microparticles derived from water.
  • Microparticles derived from a culture supernatant such as dental pulp-derived stem cells may be used in a state contained in the culture supernatant, or may be used in a state purified from the culture supernatant.
  • the microparticles are microparticles purified from culture supernatant.
  • the origin of the microparticles can be determined by a known method. For example, it can be determined whether the microparticles are derived from stem cells such as dental pulp-derived stem cells, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells, or umbilical cord-derived stem cells using the method described in J Stem Cell Res Ther (2016) 8:2. Can be done. Specifically, the origin of each microparticle can be determined based on the miRNA pattern of the microparticle.
  • the microparticles contain miRNA whose expression is suppressed in depression or miRNA used in the treatment of depression.
  • miRNA miRNA
  • miRNA is, for example, an RNA molecule of 21 to 25 bases (nucleotides). miRNAs can regulate gene expression by suppressing target gene (target) mRNA degradation or decoding steps.
  • miRNA may be single-stranded (monomer) or double-stranded (dimer).
  • the miRNA is preferably a mature miRNA that has been cleaved with a ribonuclease such as Dicer.
  • miRNAs described herein are registered in known databases (e.g., miRBase database) in association with accession numbers, and those skilled in the art will be able to identify the sequences. It can be defined uniquely.
  • the accession number of hsa-let-7a-5p is MI0000060, and the sequence is registered in miRBase database.
  • the accession number of each miRNA will be omitted.
  • miRNA in this specification also includes variants that differ by about 1 to 5 bases from mature miRNA such as hsa-let-7a-5p.
  • each miRNA in this specification refers to a polynucleotide consisting of a base sequence having identity with the base sequence of each miRNA (for example, hsa-let-7a-5p), or a polynucleotide consisting of a complementary base sequence thereof. It includes a polynucleotide having the function of miRNA in the present invention.
  • Identity refers to the degree of identity when the sequences to be compared are properly aligned, and refers to the incidence (%) of exact amino acid matches between the sequences. Alignment can be performed, for example, by using any algorithm such as BLAST.
  • Polynucleotides consisting of identical base sequences may have, for example, point mutations, deletions, and/or additions in the miRNA base sequence.
  • the number of bases in the point mutation, etc. is, for example, 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2, or 1.
  • the polynucleotide consisting of a complementary base sequence is, for example, a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence of miRNA, and includes a polynucleotide having the function of miRNA in the present invention.
  • Stringent conditions are not particularly limited, and include, for example, the conditions described in [0028] of JP-A-2017-184642, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • the microparticles contain miRNA that targets depression-related genes at a higher concentration than the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • miRNA that targets depression-related genes at a higher concentration than the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles contain at least one type of the following depression-related miRNA group; Depression-related miRNA group: hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-107, hsa-miR- 15b-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-1915-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-650.
  • Depression-related miRNA group hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7f
  • hsa-let-7a-5p hsa-let-7f-5p
  • hsa-miR-26a-5p hsa-miR-26a-5p among the depression-related miRNA group.
  • depression-related miRNAs that is, miRNAs that are frequently found in signal transduction pathways among miRNAs that are down-regulated in depression.
  • miRNAs that are down-regulated in depression examples of miRNAs that are frequently found in signal transduction pathways (especially union pathway) are as follows (Table of J. Chem. Neuroanat. 100, 101650 (2019)). The contents of this document are incorporated herein by reference. In the list below, "has" at the beginning of each miRNA is omitted).
  • Non-small cell lung cancer (miR-107, miR-103a-3p, miR-532-5p, let-7a-5p, miR-451a, miR-106b-5p, miR-590-5); Huntington's disease (miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-532-5p, let-7a-5p, let-7f-5p, miR-106b-5); Renal cell carcinoma (miR-107, let-7a-5p, miR-106b-5p); Signal transduction pathways that regulate stem cell pluripotency (miR-320a, miR-26a-5p, let-7a-5p, miR-106b-5p); Thyroid cancer (let-7a-5p, let-7d-5p, let-7f-5p, miR-451a, miR-106b-5p); Bacterial invasion of epithelial cells (miR-103a-3p, let-7a-5p, let-7f-5p); Ubiquitin-mediated protein degradation (let-7a-5p
  • miR-107 has a frequency of 4
  • miR-103a-3p has a frequency of 2
  • miR-532-5p has a frequency of 3.
  • let-7a-5p frequency is 10 times
  • miR-451a frequency is 2 times
  • miR-106b-5p frequency is 8 times
  • miR-26a-5p frequency is 3 times
  • let-7f-5p frequency is The frequency of miR-320a is 2 times
  • the frequency of let-7d-5p is 3 times
  • the frequency of miR-15b-5p is 3 times.
  • depression-related miRNAs include miRNAs that are significantly down-regulated in patients with depression compared to healthy subjects (subjects who have not developed depression). More preferred. miRNAs that are significantly downregulated in patients with depression compared to healthy subjects include hsa-miR-320a (see 4. Discussion in J. Chem. Neuroanat.
  • hsa-miR-106a-5p and hsa-miR-15a-5p are miRNAs that have values in all healthy people but not in all depressed patients. , hsa-miR-20a-5p, and has-miR-26b-5p. Similarly, miRNAs that meet the following conditions are hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-204-3p, and hsa-miR-4497.
  • Condition 1 All healthy subjects have a value (no condition exists for depressed patients).
  • Condition 2 "Average value of healthy people"/"Average value of depressed patients" is greater than 10.
  • the microparticles contain at least one of hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, and hsa-miR-320a, It is particularly preferred that it contains at least hsa-miR-26b-5p.
  • the microparticles preferably contain at least one type of miRNA that is down-regulated in depression as a Log2Ratio of read counts obtained by analysis using IMOTA of 4.0 or more, and preferably 10.0 or more. More preferably, it is particularly preferably 15.0 or more.
  • the microparticles contain hsa-let-7a-5p, hsa-let-7f-5p, and hsa-miR-26a-5p all at 4.0 or more as Log2 Ratio of read count number obtained by analysis using IMOTA. is preferable, and more preferably 10.0 or more. It is particularly preferable that the microparticles contain hsa-let-7a-5p of 15.0 or more as a Log2 Ratio of read counts obtained by analysis using IMOTA.
  • the microparticles of the present invention have hsa-let-7a-5p and/or hsa-miR-26a compared to exosomes obtained from the culture supernatant of adipose-derived stem cells or exosomes obtained from the culture supernatant of umbilical cord-derived stem cells.
  • the expression level of -5p is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.5 times or more, and particularly preferably 2 times or more.
  • the microparticles derived from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells contain about 2600 types of small RNA. Approximately 1800 of these are miRNAs. Among these miRNAs, there are 180 to 200 types of miRNAs that are abundant.
  • the high content of miRNA in microparticles derived from dental pulp-derived stem cells is characterized by the fact that there are many microRNAs related to treatment of cranial nerve diseases and eye diseases. This is my knowledge. This feature is significantly different from the types of miRNA that are contained in large amounts in other mesenchymal stem cell microparticles. For example, miRNAs that are abundant in microparticles of adipose-derived stem cells and microparticles of umbilical cord-derived stem cells contain almost no microRNAs related to treatment of cranial nerve diseases or eye diseases.
  • the microparticles preferably contain 5 or more types of miRNAs whose expression is suppressed in depression or miRNAs used for the treatment of depression, more preferably 10 or more types, particularly 15 or more types. Preferably, it is particularly preferable that 20 or more types are included. Further, the microparticles preferably contain 5 or more types of the aforementioned depression-related miRNA group, more preferably 10 or more types, particularly preferably 15 or more types, and 20 or more types. is particularly preferred.
  • the microparticles are preferably at least one type selected from the group consisting of exosomes, microvesicles, membrane particles, membrane vesicles, ectosomes, exovesicles, or microvesicles. , more preferably exosomes.
  • the diameter of the microparticles is preferably 10 to 1000 nm, more preferably 30 to 500 nm, particularly preferably 50 to 150 nm.
  • molecules called tetraspanins such as CD9, CD63, and CD81 exist on the surface of the microparticles, and it may be CD9 alone, CD63 alone, CD81 alone, or any combination of two or three thereof. good.
  • exosomes are used as microparticles may be described, but the microparticles used in the present invention are not limited to exosomes.
  • exosomes are extracellular vesicles released from cells upon fusion of multivesicular bodies with the plasma membrane.
  • the surface of the exosome preferably contains lipids and proteins derived from the cell membrane of dental pulp-derived stem cells.
  • the interior of the exosome preferably contains intracellular substances of dental pulp-derived stem cells, such as nucleic acids (microRNA, messenger RNA, DNA, etc.) and proteins.
  • Exosomes are known to be used for cell-to-cell communication by transporting genetic information from one cell to another. Exosomes are easily traceable and can be targeted to specific regions.
  • the content of microparticles in the microparticle composition is not particularly limited.
  • the microparticle composition preferably contains 0.5 x 10 8 or more microparticles, more preferably 1.0 x 10 8 or more, particularly preferably 2.0 x 10 8 or more, It is particularly preferable to contain 2.5 ⁇ 10 8 or more, and even more particularly preferably to contain 1.0 ⁇ 10 9 or more. Further, there is no particular restriction on the concentration of fine particles contained in the fine particle composition.
  • the microparticle composition preferably contains 1.0 ⁇ 10 8 particles/mL or more, more preferably 2.0 ⁇ 10 8 particles/mL or more, and 4.0 ⁇ 10 8 particles/mL or more.
  • a preferred embodiment of the microparticles of the present invention can maintain a high amount of miRNA whose expression is suppressed in depression or miRNA used in the treatment of depression by containing the microparticles in such a large amount or at a high concentration.
  • the microparticle composition may contain other components in addition to the microparticles, depending on the type of animal to be administered and the purpose, to the extent that the effects of the present invention are not impaired.
  • Other ingredients include nutritional ingredients, antibiotics, cytokines, protective agents, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, etc. It will be done.
  • nutritional components include fatty acids, vitamins, and the like.
  • antibiotics include penicillin, streptomycin, and gentamicin.
  • the carrier may include materials known as pharmaceutically acceptable carriers.
  • the microparticle composition may be the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells itself or the microparticles themselves, or may be a pharmaceutical composition further containing a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, and the like.
  • the purpose of the pharmaceutical composition is to facilitate administration of microparticles to the recipient.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is a carrier (including diluents) that does not cause significant irritation to the administered subject and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • carriers are propylene glycol; (physiological) saline; emulsions; buffers; media, such as DMEM or RPMI; cryopreservation media containing components that scavenge free radicals.
  • the microparticle composition may contain an active ingredient of a conventionally known therapeutic agent for depression. Those skilled in the art can make appropriate changes depending on the intended use, administration target, etc.
  • the microparticle composition does not contain the predetermined substance.
  • the microparticle composition preferably does not contain dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticle composition preferably does not contain MCP-1. However, it may contain cytokines other than MCP-1. Other cytokines include those described in [0014] to [0020] of JP 2018-023343A.
  • the microparticle composition does not contain Siglec-9. However, it may contain other sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins other than Siglec-9.
  • the microparticle composition preferably does not substantially contain serum (fetal bovine serum, human serum, sheep serum, etc.).
  • the microparticle composition is substantially free of conventional serum replacements, such as Knockout serum replacement (KSR).
  • KSR Knockout serum replacement
  • the content (solid content) of the other components described above is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.1% by mass or less, and 0.01% by mass or less. It is particularly preferable that
  • the microparticles of the present invention may be prepared by preparing a culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, etc., and then purifying microparticles from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles of the present invention may be prepared by purifying microparticles from the culture supernatant of commercially purchased dental pulp-derived stem cells.
  • the microparticles of the present invention are prepared by receiving a composition containing the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells that had been disposed of (or purifying the composition as appropriate) and refining the microparticles therefrom. You may.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells there are no particular limitations on the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells or the like. It is preferable that the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells and the like is substantially free of serum.
  • the serum content of the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells is preferably 1% by mass or less, more preferably 0.1% by mass or less, and preferably 0.01% by mass or less. Particularly preferred.
  • Dental pulp-derived stem cells may be derived from humans or from animals other than humans.
  • animals other than humans include those similar to the animals (species) to which the microparticles of the present invention are administered, which will be described later, and mammals are preferred.
  • dental pulp-derived stem cells used in the culture supernatant.
  • Stem cells from exfoliated deciduous teeth can be used.
  • dental pulp stem cells from deciduous teeth obtained by other methods can be used.
  • dental pulp-derived stem cells derived from animals other than humans such as pig deciduous tooth pulp stem cells, can be used.
  • dental pulp-derived stem cells contain vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and transforming growth factor-beta (TGF-).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- transforming growth factor-beta
  • the dental pulp-derived stem cells used in the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells are dental pulp-derived stem cells that contain many proteins, and it is preferable to use dental pulp stem cells of deciduous teeth. That is, in the present invention, it is preferable to use a culture supernatant of deciduous tooth pulp stem cells.
  • the dental pulp-derived stem cells used in the present invention may be natural or genetically modified, as long as the desired treatment can be achieved.
  • immortalized stem cells derived from dental pulp can be used.
  • the immortalized stem cells are preferably immortalized stem cells that have not become cancerous.
  • Immortalized stem cells of dental pulp-derived stem cells can be prepared by adding the following low molecular weight compounds (inhibitors) alone or in combination to dental pulp-derived stem cells and culturing them.
  • the TGF ⁇ receptor inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of the transforming growth factor (TGF) ⁇ receptor, and for example, 2-(5-benzo[1,3 ] Dioxol-4-yl-2-tert-butyl-1H-imidazol-4-yl)-6-methylpyridine, 3-(6-methylpyridin-2-yl)-4-(4-quinolyl)-1- Phenylthiocarbamoyl-1H-pyrazole (A-83-01), 2-[(5-chloro-2-fluorophenyl)pteridin-4-yl]pyridin-4-ylamine (SD-208), 3-[(pyridine -2-yl)-4-(4-quinonyl)]-1H-pyrazole, 2-(3-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine( Merck & Co.), SB431542 (S
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the effect of inhibiting the function of Rho-binding kinase.
  • ROCK inhibitors include GSK269962A (Axonmedchem), Fasudil hydrochloride (Tocris Bioscience), Y-27632, and H-1152 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Y-27632 Preferred is Y-27632.
  • GSK3 inhibitors are not particularly limited as long as they inhibit GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase 3), and include A 1070722, BIO, BIO-acetoxime (TOCRIS), etc. can be mentioned.
  • MEK inhibitors are not particularly limited as long as they have the effect of inhibiting the function of MEK (MAP kinase-ERK kinase), such as AZD6244, CI-1040 (PD184352), PD0325901, RDEA119 (BAY86 -9766), SL327, U0126-EtOH (all sold by Selleck), PD98059, U0124, and U0125 (all sold by Cosmo Bio Inc.).
  • MEK MAP kinase-ERK kinase
  • AZD6244 CI-1040
  • PD0325901 PD0325901
  • RDEA119 BAY86 -9766
  • SL327 U0126-EtOH (all sold by Selleck)
  • PD98059 U0124
  • U0125 all sold by Cosmo Bio Inc.
  • microparticles of the present invention When using the microparticles of the present invention in regenerative medicine, in accordance with the requirements of the Regenerative Medicine Safety Act, dental pulp-derived stem cells, culture supernatants of these immortalized stem cells, and compositions containing microparticles derived therefrom must be This embodiment does not contain any other somatic stem cells other than derived stem cells.
  • the microparticle composition may contain mesenchymal stem cells and other somatic stem cells other than dental pulp-derived stem cells, it is preferable not to contain them. Examples of somatic stem cells other than mesenchymal stem cells include, but are not limited to, stem cells derived from the dermal system, digestive system, bone marrow system, nervous system, etc.
  • Examples of dermal somatic stem cells include epithelial stem cells, hair follicle stem cells, and the like.
  • somatic stem cells of the digestive system include pancreatic (general) stem cells, hepatic stem cells, and the like.
  • Examples of myeloid somatic stem cells (other than mesenchymal stem cells) include hematopoietic stem cells and the like.
  • Examples of somatic stem cells of the nervous system include neural stem cells, retinal stem cells, and the like.
  • the microparticle composition may contain stem cells other than somatic stem cells, but preferably does not contain them.
  • Stem cells other than somatic stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and embryonic carcinoma cells (EC cells).
  • a culture supernatant such as dental pulp-derived stem cells is a culture solution obtained by culturing dental pulp-derived stem cells.
  • a culture supernatant that can be used in the present invention can be obtained by separating and removing cell components after culturing dental pulp-derived stem cells.
  • a culture supernatant that has been appropriately subjected to various treatments for example, centrifugation, concentration, solvent replacement, dialysis, freezing, drying, lyophilization, dilution, desalting, storage, etc. may be used.
  • Dental pulp-derived stem cells for obtaining a culture supernatant of dental pulp-derived stem cells can be selected by conventional methods, and can be selected based on cell size and morphology, or as adherent cells. Dental pulp cells collected from fallen baby teeth or permanent teeth can be sorted as adherent cells or their successor cells. As the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, a culture supernatant obtained by culturing selected stem cells can be used.
  • the "culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, etc.” is preferably a culture solution that does not contain the cells themselves obtained by culturing dental pulp-derived stem cells, etc.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells used in the present invention preferably does not contain any cells (regardless of the type of cells) as a whole. Due to this feature, the composition of this embodiment is clearly distinguished from dental pulp-derived stem cells themselves as well as from various compositions containing dental pulp-derived stem cells.
  • a typical example of this embodiment is a composition that does not contain dental pulp-derived stem cells and is composed only of a culture supernatant of dental pulp-derived stem cells.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells used in the present invention may contain culture supernatants of both deciduous dental pulp-derived stem cells and adult dental pulp-derived stem cells.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells used in the present invention preferably contains the culture supernatant of deciduous dental pulp-derived stem cells as an active ingredient, more preferably 50% by mass or more, and preferably 90% by mass or more. It is particularly preferable that the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells used in the present invention is a composition composed only of the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells of deciduous teeth.
  • a basic medium or a basic medium to which serum or the like is added can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • IMDM Iscove's modified Dulbecco's medium
  • Ham F12 medium Ham F12, SIGMA, GIBCO, etc.
  • RPMI1640 medium etc.
  • a serum-free medium may be used throughout the entire process or during the last or several subcultures from the end. For example, by culturing dental pulp-derived stem cells in a serum-free medium (serum-free medium), a serum-free culture supernatant of dental pulp-derived stem cells can be prepared.
  • serum-free culture supernatant of dental pulp-derived stem cells etc. by performing one or more subcultures and culturing the last or several subcultures in a serum-free medium. Can be done.
  • a serum-free culture supernatant of dental pulp-derived stem cells can also be obtained by removing serum from the collected culture supernatant using dialysis, solvent replacement using a column, or the like.
  • culturing dental pulp-derived stem cells For culturing dental pulp-derived stem cells to obtain a culture supernatant, commonly used conditions can be applied as they are.
  • the method for preparing the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells may be the same as the cell culture method described below, except that the stem cell isolation and selection steps are appropriately adjusted depending on the type of stem cells.
  • Those skilled in the art can appropriately isolate and select dental pulp-derived stem cells according to the type of the dental pulp-derived stem cells.
  • special conditions may be applied to culturing dental pulp-derived stem cells in order to produce a large amount of microparticles such as exosomes. Examples of special conditions include conditions for co-cultivation with some stimulus, such as low temperature conditions, hypoxic conditions, microgravity conditions, and the like.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells used in the preparation of microparticles such as exosomes in the present invention may contain other components in addition to the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, but it does not substantially contain other components. Preferably not. However, various types of additives used for preparing exosomes may be added to the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells and then stored.
  • Microparticles can be prepared by purifying microparticles from culture supernatants such as dental pulp-derived stem cells.
  • microparticles are preferably separation of a fraction containing microparticles from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, and more preferably isolation of microparticles.
  • Microparticles can be isolated by separating them from unassociated components based on the properties of the microparticles. For example, microparticles can be isolated based on molecular weight, size, morphology, composition, or biological activity.
  • microparticles can be purified by separating a specific fraction (eg, precipitate) containing many microparticles obtained by centrifuging the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells. Unnecessary components (insoluble components) in fractions other than the predetermined fractions may be removed.
  • microparticles can be purified by filtering a culture supernatant of dental pulp-derived stem cells or a centrifuged product thereof. Unnecessary components can be removed by filtration treatment. Furthermore, by using a filtration membrane with an appropriate pore size, removal of unnecessary components and sterilization can be performed at the same time.
  • the material, pore size, etc. of the filtration membrane used for the filtration treatment are not particularly limited. Filtration can be carried out using filtration membranes of appropriate molecular weight or size cut-off using known methods.
  • the pore size of the filtration membrane is preferably from 10 to 1000 nm, more preferably from 30 to 500 nm, and particularly preferably from 50 to 150 nm, from the viewpoint of easy separation of exosomes.
  • a culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, a centrifuged product thereof, or a filtered product thereof can be separated using an additional separation means such as lamb chromatography.
  • additional separation means such as lamb chromatography.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column can be a size exclusion column or a binding column.
  • One or more properties or biological activities of the microparticles can be used to track the microparticles (or their activity) in each fraction at each processing step.
  • light scattering, refractive index, dynamic light scattering or UV-visible light detectors can be used to track microparticles.
  • specific enzyme activities, etc. can be used to track the activity in each fraction.
  • As a method for purifying microparticles the method described in [0034] to [0064] of Japanese Patent Publication No. 2019-524824 may be used, and the contents of this publication are incorporated herein by reference.
  • the final form of the microparticle composition is not particularly limited.
  • the microparticle composition can be formed by filling a container with microparticles together with a solvent or dispersion medium; by gelling the microparticles together with a gel and filling the container; by freezing and/or drying the microparticles.
  • it may be solidified into a formulation or filled into a container.
  • containers include tubes, centrifuge tubes, bags, etc. suitable for cryopreservation.
  • the freezing temperature can be, for example, -20°C to -196°C.
  • the microparticles of the present invention are easier to mass-produce than conventional compositions that can be used as therapeutic or preventive agents for depression, and can be produced using stem cell culture fluids that were previously discarded as industrial waste. It has advantages such as being able to be used for various purposes and reducing the cost of disposing of stem cell culture fluid.
  • the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells is the culture supernatant of human dental pulp-derived stem cells
  • the microparticles of the present invention are highly safe from an immunological standpoint when applied to humans. Another advantage is that there are fewer ethical issues.
  • the microparticles of the present invention will be safer and more ethical when applied to that patient. There will be fewer problems.
  • the microparticles of the present invention are derived from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells, they can also be used in restorative medicine.
  • compositions containing microparticles derived from culture supernatants such as dental pulp-derived stem cells are preferably used for restorative medical applications.
  • stem cells are not the main actors in regeneration, but rather that the humoral components produced by stem cells repair organs together with one's own stem cells.
  • Difficult issues associated with conventional stem cell transplantation such as canceration, standardization, administration methods, storage stability, and culture methods, have been resolved, and restorations can be achieved using a composition using the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells or microparticles derived therefrom. Medical care becomes possible.
  • stem cell transplantation when using the microparticles of the present invention, tumor formation is less likely to occur because cells are not transplanted, and it can be said to be safer.
  • the microparticles of the present invention have the advantage of being of uniformly standardized quality. Since mass production and efficient administration methods can be selected, it can be used at low cost.
  • the prophylactic or therapeutic agent for depression of the present invention includes the microparticles of the present invention.
  • prevention refers to preventing the onset of a disease (in this specification, depression).
  • treatment refers to alleviating, suppressing, or preventing the progression of symptoms of a disease that has developed, and improving symptoms.
  • the method for improving depression of the present invention includes administering an effective amount of the microparticles of the present invention or an effective amount of the preventive or therapeutic agent for depression of the present invention to a subject who has developed depression.
  • Administration methods include spraying or inhalation into the oral cavity, nasal cavity, or respiratory tract, dripping, local administration, nasal spray, etc., and minimally invasive methods are preferred. Injection is a preferred method of local administration. Also preferred is electroporation, which temporarily creates minute holes in cell membranes by applying voltage (electrical pulses) to the skin surface, allowing active ingredients to penetrate into the dermal layer, which cannot be reached with normal skin care.
  • examples include intravenous administration, intraarterial administration, intraportal administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, etc.; intraarterial administration, intravenous administration, subcutaneous administration or Intraperitoneal administration is more preferred.
  • various formulation techniques can be used to alter the in vivo distribution of microparticles. Many methods of altering in vivo distribution are known to those skilled in the art. Examples of such methods include protection of exosomes in vesicles composed of materials such as proteins, lipids (eg, liposomes), carbohydrates or synthetic polymers.
  • the microparticles of the present invention administered to a subject who has developed depression may circulate within the subject's body and reach a predetermined tissue.
  • the frequency of administration can be one or more times per week, preferably five or more times, more preferably six or more times, particularly preferably seven or more times.
  • the administration interval is preferably 1 hour to 1 week, more preferably half a day to 1 week, and particularly preferably 1 day (once a day). However, it can be adjusted as appropriate depending on the species to be administered and the symptoms of the subject.
  • the microparticles of the present invention are preferably used to administer the microparticles to a subject who has developed dementia at least once a week over a therapeutically effective period.
  • the number of administrations per week is preferably large, preferably 5 or more times per week over the effective therapeutic period, and preferably daily.
  • the amount is preferably 0.1 to 5 ml per mouse (about 25 g), and 0.3 to 5 ml per mouse (approximately 25 g). The amount is more preferably 3 ml, and particularly preferably 0.5 to 1 ml.
  • the amount is preferably 1 to 50 ⁇ g, more preferably 3 to 30 ⁇ g, and more preferably 5 to 50 ⁇ g per mouse (approximately 25 g). More particularly preferred is ⁇ 25 ⁇ g.
  • the preferred range of dosage per body weight for other animals can be calculated from the dosage per body weight (about 25 g) for model mice using a proportional relationship. However, it can be adjusted as appropriate depending on the symptoms of the subject.
  • the animals to which the microparticles of the present invention are administered are preferably mammals, birds (chickens, quail, ducks, etc.), and fish (salmon, trout, tuna, bonito, etc.).
  • the mammal may be a human or a non-human mammal, but humans are particularly preferred. More preferably, the non-human mammal is a cow, pig, horse, goat, sheep, monkey, dog, cat, mouse, rat, guinea pig, or hamster.
  • microparticles of the present invention may be used in combination with conventionally known therapeutic agents for depression. Specifically, it may be used in combination with NMDAR antagonists such as tricyclic antidepressants, selective serotonin reuptake inhibitors, serotonin/norepinephrine reuptake inhibitors, atypical antipsychotics, and ketamine.
  • NMDAR antagonists such as tricyclic antidepressants, selective serotonin reuptake inhibitors, serotonin/norepinephrine reuptake inhibitors, atypical antipsychotics, and ketamine.
  • Example 1 ⁇ Preparation of culture supernatant of dental pulp-derived stem cells> Using DMEM medium instead of the DMEM/HamF12 mixed medium and otherwise following the method described in Example 6 of Patent No. 6296622, a culture supernatant of human deciduous dental pulp stem cells was prepared, and the culture supernatant was fractionated. did. In primary culture, fetal bovine serum (FBS) is added to the culture, and in subculture, the supernatant of the subculture medium is cultured using the primary culture medium, and the supernatant of the subculture medium is separated so that it does not contain FBS. culture supernatant was prepared. Note that DMEM is Dulbecco's modified Eagle's medium, and F12 is Ham's F12 medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • exosomes of dental pulp-derived stem cells were purified and collected by the following ultracentrifugation method. After filtering the culture supernatant (100 mL) of deciduous dental pulp stem cells through a filter with a pore size of 0.22 micrometers, the solution was centrifuged at 100,000 ⁇ g at 4° C. for 60 minutes. The supernatant was decanted and the exosome enriched pellet was resuspended in phosphate buffered saline (PBS). The resuspended sample was centrifuged at 100,000 xg for 60 minutes.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the pellet was again collected from the bottom of the centrifuge tube as a concentrated sample (approximately 100 ⁇ l). Protein concentration was determined by microBSA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL). The composition containing exosomes (concentrated solution) was stored at -80°C. A composition containing exosomes purified from the culture supernatant of dental pulp-derived stem cells was used as the microparticle composition sample of Example 1.
  • the average particle diameter and concentration of the microparticles contained in the microparticle composition of Example 1 were evaluated using a nanoparticle analysis system NanoSight (manufactured by Nippon Quantum Design Co., Ltd.).
  • the average particle size of the microparticles contained in the microparticle composition of Example 1 was 50 to 150 nm.
  • the microparticle composition of Example 1 was a high concentration exosome solution of 1.0 ⁇ 10 9 particles/ml or more, specifically, a high concentration exosome solution of 2.0 ⁇ 10 9 particles/ml.
  • the components of the obtained microparticle composition of Example 1 were analyzed by a known method.
  • Example 1 did not contain stem cells of dental pulp-derived stem cells, did not contain MCP-1, and did not contain Siglec-9. Therefore, it was found that an active ingredient different from MCP-1 and Siglec-9, which are the active ingredients of the culture supernatant of mesenchymal stem cells, and their analogs, was the active ingredient of the microparticle composition of Example 1. .
  • Example 1 MicroRNA expressed in exosomes Small RNA contained in the microparticle composition of Example 1 was analyzed by next generation sequencing (NGS) analysis. NGS analysis identified 1787 miRNAs contained in the microparticle composition (dental pulp-derived stem cell exosomes) of Example 1. The results obtained are shown in Table 1 below.
  • IMOTA Interactive Multi-Omics-Tissue Atlas
  • IMOTA is an interactive multi-omics atlas that allows you to investigate interactions and expression levels of miRNAs, mRNAs, and proteins in each tissue and cell (Nucleic Acids Research, Volume 46, Issue D1, 4 January 2018, Pages D770- D775, "IMOTA: an interactive multi-omics tissue atlas for the analysis of human miRNA-target interactions").
  • the Omic counts were 3071 proteins, 14182 mRNAs, and 1124 miRNAs.
  • the counts of Omics with a high expression rate in the cerebral cortex were 1119 for proteins, 1110 for mRNA, and 145 for miRNA.
  • Example 1 Exosomes of dental pulp-derived stem cells
  • Example 2 highly expressed in the cerebral cortex as shown in Tables 2 and 3 below.
  • Example 3 Search for microRNAs involved in diseases Based on the obtained analysis results, microRNAs involved in diseases were searched. Extraction of disease-related miRNAs was performed using IMOTA. Here, we investigated whether microRNAs whose expression is suppressed (downregulated) in depression were included. In this example, of the 24 types of miRNA whose expression is suppressed (downregulated) in depression described in Table 3 of Non-Patent Document 1 (J. Chem. Neuroanat. 100, 101650 (2019)), Example 1 Figure 1 shows the expression levels of microRNA expressed in the microparticle composition (SGF exosome).
  • Example 1 suppresses (down-regulates) the expression of depression listed in Table 3 of Non-Patent Document 1 (J. Chem. Neuroanat. 100, 101650 (2019)).
  • hsa-let-7a-5p hsa-let-7d-5p
  • hsa-let-7f-5p hsa-miR- 103a-3p
  • hsa-miR-106b-5p hsa-miR-107
  • hsa-miR-15b-5p hsa-miR-185-5p
  • hsa-miR-26a-5p It was found that 15 types of hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-590-5

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Abstract

うつで発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む微小粒子は、うつ病の治療手段として注目される特定のｍｉＲＮＡを含む；うつ病の予防薬または治療薬；うつ病の改善方法。

Description

微小粒子、うつ病の予防薬または治療薬およびうつ病の改善方法
　本発明は、微小粒子、うつ病の予防薬または治療薬およびうつ病の改善方法に関する。
　うつ病は、うつ病は慢性で消耗性の精神疾患であり、悲しみ、興味や喜びの欠如、睡眠・食欲障害、集中力の低下、疲労、罪悪感、自尊心の低下などを引き起こす。精神障害の中でうつ病は世界中で最も多いものの１つであり、うつ病の治療法や予防法のさらなる発展が望まれている。
　これまでの研究で、生体内のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とうつ病には関係があることが知られてきている。
　非特許文献１には、うつ病に発現するｍｉＲＮＡとその関連経路の系統的レビューとバイオインフォマティックス解析の結果と、感情障害に関連するシグナル伝達経路に関与するｍｉＲＮＡの変化がうつ病の誘因や悪化の原因となることが記載されている。特に、非特許文献１では、うつ病でアップレギュレートまたはダウンレギュレート（抑制）されたｍｉＲＮＡをバイオインフォマティクスにより解析した結果、検討された７７種類のｍｉＲＮＡ中、うつ病患者では３０種類のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされ、２４種類のｍｉＲＮＡがダウンレギュレートされたことが記載されている。
　また、うつ病患者におけるｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして利用する方法が知られている。例えば、特許文献１には、被験者から採取した生体試料中のエクソソーム内に含まれる特定のｍｉＲＮＡのレベルを測定することを含む、うつ病の診断を補助する方法であって、特定のｍｉＲＮＡは、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3p及びhsa-miR-4497からなる群から選択される少なくとも１つである、方法が記載されている。また、特許文献１には、これらのｍｉＲＮＡは、健常者から採取されるエクソソームからは検出されるが、うつ病患者から採取されるエクソソームからは実質的に検出されないか、あるいは正常値と比較して低値であることが記載されている。
特開２０２１－１１２１６７号公報
Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９）
　しかし、非特許文献１には、この文献に記載のｍｉＲＮＡを外部から生体内に導入することは検討されておらず、その手段としてエクソソーム等の微小粒子を用いることも記載されていなかった。また、特許文献１では、この文献に記載のｍｉＲＮＡをバイオマーカーとしてうつ病の診断の補助する際に用いているに過ぎず、外部から生体内に導入することは検討されておらず、その手段としてエクソソーム等の微小粒子を用いることも記載されていなかった。
　本発明が解決しようとする課題は、うつ病の治療手段として注目される特定のｍｉＲＮＡを含む微小粒子を提供することである。
　本発明者らは、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡまたはうつ病の治療に用いられるｍｉＲＮＡを含む微小粒子により、上記課題を解決できることを見出した。
　具体的に、本発明および本発明の好ましい構成は、以下のとおりである。
［１］　うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む、微小粒子。
［２］　微小粒子がエクソソームである、［１］に記載の微小粒子。
［３］　微小粒子が、歯髄由来幹細胞の培養上清よりも高い濃度で、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む、［１］に記載の微小粒子。
［４］　微小粒子が下記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち少なくとも１種類を含む、［１］に記載の微小粒子；
うつ病関連ｍｉＲＮＡ群：
hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-650。
［５］　微小粒子がうつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5pおよびhsa-miR-26a-5pを含む、［４］に記載の微小粒子。
［６］　微小粒子が、うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうちhsa-let-7a-5pを含む、［４］に記載の微小粒子。
［７］　微小粒子が、うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5pおよびhsa-miR-320aを含む、［４］に記載の微小粒子。
［８］　微小粒子が歯髄由来幹細胞の培養上清から精製されて単離された微小粒子であり、
　微小粒子が、歯髄由来幹細胞の培養上清からエクソソームを除いた成分を含まない、［１］に記載の微小粒子。
［９］　［１］に記載の微小粒子を含む、うつ病の予防薬または治療薬。
［１０］　有効量の［１］に記載の微小粒子、あるいは有効量の［９］に記載のうつ病の予防薬または治療薬を、うつ病を発症した対象に投与することを含む、うつの改善方法。
　本発明によれば、うつ病の治療手段として注目される特定のｍｉＲＮＡを含む微小粒子を提供することができる。
図１は、歯髄由来幹細胞の培養上清から精製したエクソソーム（実施例１の微小粒子）に発現するｍｉＲＮＡの発現量を示したヒートマップである。
　以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
［微小粒子］
　本発明の微小粒子は、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む、微小粒子である。
　本発明の微小粒子は、うつ病の治療手段として注目される特定のｍｉＲＮＡを含む。
　以下、本発明の微小粒子の好ましい態様を説明する。
＜うつ病の定義＞
　うつ病とは、気分障害の一種であり、抑うつ気分、意欲・興味・精神活動の低下、焦燥、食欲低下、不眠、持続する悲しみ・不安、集中力の低下、疲労、罪悪感、自尊心の低下などを特徴とした精神障害である。アメリカ精神医学会（ＡＰＡ）の『精神障害の診断と統計マニュアル』第５版（ＤＳＭ－５）において、「抑うつ障害群」に分類されるいずれのうつ病性障害も本発明における「うつ病」に包含される。また、大うつ病、双極性障害のいずれも本発明における「うつ病」に包含される。
＜うつ病の発生機序＞
　うつ病の発生機序は正確にはわかっておらず、不明である。感情や意欲を司る脳の働きやシグナル伝達経路に何らかの不調が生じていると考えられている。これらの不調は、遺伝的要因、ストレスなどの環境要因、慢性的な疲労や疾患などの身体的要因に加え、脳内遺伝子発現プログラムが変化することなどで生じる神経可塑性異常なども要因と考えられている。
＜うつ病治療薬と作用機序＞
　本発明の微小粒子は、うつ病の改善をできることが好ましい。以下、うつ病治療薬と作用機序を、本発明の微小粒子の作用機序とあわせて説明する。
　うつ病治療薬と作用機序としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡの補充
　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９）には、うつ病においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡが記載されている。このようなｍｉＲＮＡを補充することは、うつ病への新しい治療手段となる。
　本発明の微小粒子は、うつ病においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充として機能する。特に、本発明の微小粒子が、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-650のうち少なくとも１種類を含む場合、うつ病においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充として機能する。
　うつ病においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充は、うつ病の患者のいずれの体液またはいずれの組織においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充であってもよい。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、尿および唾液等が挙げられる。好ましくは、血液、血漿または血清等である。組織としては、例えば、脳組織等が挙げられ、細胞としては、当該組織から得られる細胞集団が挙げられる。うつ病の患者の血液、血漿または血清においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充であることが好ましく、血液においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡの補充であることがより好ましい。
（ｂ）従来のうつ病治療薬
　従来のうつ病治療薬として、例えば、セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）（例、フルボキサミン、パロキセチン、セルトラリン、エスシタロプラム等）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）（例、デュロキセチン、ミルナシプラン等）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（ＮａＳＳＡ）（例、ミルタザピン等）、三環系・四環系抗うつ薬（例、アモキサピン、ノルトプリプチリン、クロミプラミン、マプロチリン、ミアンセリン等）などが挙げられる。
＜微小粒子の詳細＞
　本発明の微小粒子の有効成分であるｍｉＲＮＡは、微小粒子に含まれる。
　本発明の微小粒子は、例えば、歯髄由来幹細胞等の間葉系幹細胞からの分泌、出芽または分散などにより、歯髄由来幹細胞等から導き出され、細胞培養培地に浸出、放出または脱落するものである。微小粒子は、歯髄由来幹細胞等の培養上清に含まれることが好ましく、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子であることがより好ましい。ただし、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子は、必ずしも歯髄由来幹細胞の培養上清から取得する必要がない。例えば、歯髄由来幹細胞の内部の微小粒子を任意の方法で単離したものであっても、歯髄由来幹細胞の培養上清から単離できる微小粒子と同じものであれば、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子と言える。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子は、培養上清に含まれた状態で用いてもよく、または培養上清から精製した状態で用いてもよい。微小粒子が培養上清から精製された微小粒子であることが好ましい。
　微小粒子の由来は、公知の方法で判別することができる。例えば、微小粒子は、Ｊ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ　Ｔｈｅｒ　（２０１８）　８：２に記載の方法で、歯髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、臍帯由来幹細胞などのいずれの幹細胞に由来するか判別することができる。具体的には、微小粒子のｍｉＲＮＡパターンに基づいて、それぞれの微小粒子の由来を判別することができる。
（ｍｉＲＮＡ）
　本発明では、微小粒子がうつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡまたはうつ病の治療に用いられるｍｉＲＮＡを含む。
　本発明において、ｍｉＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ）は、例えば２１～２５塩基（ヌクレオチド）のＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ；ターゲット）ｍＲＮＡの分解または解読段階における抑制により遺伝子発現を調節できる。
　本発明において、ｍｉＲＮＡは、一本鎖（一量体）でもよいし、二本鎖（二量体）であってもよい。また、本発明において、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ等のリボヌクレアーゼにより切断された成熟型ｍｉＲＮＡが好ましい。
　なお、hsa-let-7a-5pなどの本明細書に記載のｍｉＲＮＡの配列は公知のデータベース（例えば、ｍｉＲＢａｓｅ　ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号と関連づけられて登録されており、当業者であれば配列を一義的に定めることができる。例えば、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－５ｐのアクセッション番号はＭＩ０００００６０であり、ｍｉＲＢａｓｅ　ｄａｔａｂａｓｅに配列が登録されている。以下、各ｍｉＲＮＡのアクセッション番号は省略する。
　ただし、本明細書におけるｍｉＲＮＡは、hsa-let-7a-5pなどの成熟型ｍｉＲＮＡに対して１～５個程度の塩基が異なるバリアントも含む。また、本明細書における各ｍｉＲＮＡは、各ｍｉＲＮＡ（例えばhsa-let-7a-5p）の塩基配列と同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、それらの相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、本発明におけるｍｉＲＮＡの機能を有するポリヌクレオチドを含む。「同一性」とは、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。アライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ等の任意のアルゴリズムの利用により行うことができる。同一性は、例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％である。同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、ｍｉＲＮＡの塩基配列において、点変異、欠失および／または付加を有してもよい。前記点変異等の塩基数は、例えば、１～５個、１～３個、１～２個、または１個である。また、相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、ｍｉＲＮＡの塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、本発明におけるｍｉＲＮＡの機能を有するポリヌクレオチドを含む。ストリンジェントな条件としては、特に限定されないが、例えば、特開２０１７－１８４６４２号公報の［００２８］に記載の条件を挙げることができ、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。
　本発明では、微小粒子が、歯髄由来幹細胞の培養上清よりも高い濃度で、うつ病に関する遺伝子を標的遺伝子とするｍｉＲＮＡを含むことが好ましい。
　以下、微小粒子が含むｍｉＲＮＡの好ましい態様を説明する。
　本発明では、微小粒子が下記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち少なくとも１種類を含むことがより好ましい；
うつ病関連ｍｉＲＮＡ群：
hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-650。
　さらにうつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5pおよびhsa-miR-26a-5pのうちいずれか１種類を含むことがより好ましい。
　本発明の好ましい一態様では、うつ病関連ｍｉＲＮＡ、すなわちうつ病でダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの中でシグナル伝達経路において高頻度に見出されるｍｉＲＮＡを含むことがより好ましい。うつ病でダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡの中でシグナル伝達経路（特にユニオン経路）において高頻度に見出されるｍｉＲＮＡの例は以下のとおりである（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９）のＴａｂｌｅ　５参照。この文献の内容は参照して本明細書に組み込まれる。以下のリストにおいて各ｍｉＲＮＡの冒頭の「has」は省略した）。
非小細胞肺癌（miR-107、miR-103a-3p、miR-532-5p、let-7a-5p、miR-451a、miR-106b-5p、miR-590-5）；
ハンチントン病（miR-26a-5p、miR-26b-5p、miR-532-5p、let-7a-5p、let-7f-5p、miR-106b-5）；
腎細胞癌（miR-107、let-7a-5p、miR-106b-5p）；
幹細胞の多能性を調節するシグナル伝達経路（miR-320a、miR-26a-5p、let-7a-5p、miR-106b-5p）；
甲状腺ガン（let-7a-5p、let-7d-5p、let-7f-5p、miR-451a、miR-106b-5p）；
上皮細胞の細菌侵入（miR-103a-3p、let-7a-5p、let-7f-5p）；
ユビキチンを介したタンパク質分解（let-7a-5p、let-7d-5p、miR-15b-5p、miR-106b-5p）；
エプスタインバーウイルス感染（let-7f-5p、miR-15b-5p）；
グリコサミノグリカン生合成－コンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸（miR-1285-5p、miR-26b-5p、miR-15b-5p）
癌の中心的な炭素代謝（miR-320a、miR-107、miR-650）；
ステロイド生合成（miR-107、miR-26a-5p、miR-532-5p、let-7d-5p）；
ＭＡＰＫシグナル伝達経路（let-7a-5p、let-7f-5p、miR-106b-5p）；
ＨＴＬＶ－Ｉ感染（let-7a-5p、miR-106b-5p）；
ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路（let-7a-5p、let-7f-5p）。
　上記したｍｉＲＮＡが複数のユニオン経路に現れる頻度（２回以上）をまとめると、miR-107の頻度は４回、miR-103a-3pの頻度は２回、miR-532-5pの頻度は３回、let-7a-5pの頻度は１０回、miR-451aの頻度は２回、miR-106b-5pの頻度は８回、miR-26a-5pの頻度は３回、let-7f-5pの頻度は６回、miR-320aの頻度は２回、let-7d-5pの頻度は３回、miR-15b-5pの頻度は３回である。
　この本発明の好ましい一態様の場合、シグナル伝達経路において高頻度に見出される観点からは、微小粒子が、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5pを含むことが好ましく（頻度２回以上）、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、miR-26a-5p、miR-532-5pを含むことがより好ましく（頻度３回以上）、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107を含むことが特に好ましく（頻度４回以上）、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-106b-5pを含むことがより特に好ましい（頻度６回以上）。微小粒子がhsa-let-7a-5pを少なくとも含むことがさらにより特に好ましい（頻度１０回以上）。
　本発明の別の好ましい一態様では、うつ病関連ｍｉＲＮＡのうち、うつ病の患者が健常者（うつ病を発症していない対象）と比較して顕著にダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡを含むことがより好ましい。うつ病の患者が健常者と比較して顕著にダウンレギュレートされるｍｉＲＮＡとしては、hsa-miR-320a（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９）の4. Discussion参照）や、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3pおよびhsa-miR-4497（特開２０２１－１１２１６７号公報の０００７～００５０段落参照。この文献の内容は参照して本明細書に組み込まれる）を挙げることができる。
　なお、特開２０２１－１１２１６７号公報の０００４８段落のとおり、健常者全員に値があって、うつ病患者全員に値がないｍｉＲＮＡとして、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-20a-5p、has-miR-26b-5pが挙げられる。同様に、次の条件を満たすｍｉＲＮＡは、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-204-3pおよびhsa-miR-4497である。
条件１：健常者全員に値がある（うつ病患者に条件なし）。
条件２：「健常者の平均値」／「うつ病患者の平均値」が１０より大きい。
条件３：「健常者の最小値」／「うつ病患者の最大値」が３より大きい。
　この本発明の別の好ましい一態様の場合、微小粒子がhsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5pおよびhsa-miR-320aのうちいずれか１種類を少なくとも含むことがより好ましく、hsa-miR-26b-5pを少なくとも含むことが特に好ましい。
　微小粒子は、うつ病においてダウンレギュレーションされるｍｉＲＮＡのうち少なくとも１種類を、ＩＭＯＴＡを用いた解析で得られるリードカウント数のＬｏｇ２Ｒａｔｉｏとして、４．０以上含むことが好ましく、１０．０以上含むことがより好ましく、１５．０以上含むことが特に好ましい。微小粒子は、ＩＭＯＴＡを用いた解析で得られるリードカウント数のＬｏｇ２Ｒａｔｉｏとして、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5pおよびhsa-miR-26a-5pをいずれも４．０以上含むことが好ましく、１０．０以上含むことがより好ましい。微小粒子は、ＩＭＯＴＡを用いた解析で得られるリードカウント数のＬｏｇ２Ｒａｔｉｏとして、hsa-let-7a-5pを１５．０以上含むことが特に好ましい。
　本発明の微小粒子は、脂肪由来幹細胞の培養上清から得られるエクソソームまたは臍帯由来幹細胞の培養上清から得られるエクソソームと比較して、hsa-let-7a-5pおよび／またはhsa-miR-26a-5pの発現量が１．１倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、２倍以上であることが特に好ましい。
（ｍｉＲＮＡの種類）
　ここで、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する微小粒子には、約２６００種類のｓｍａｌｌ　ＲＮＡが含まれる。このうちの約１８００種類がｍｉＲＮＡである。これらのｍｉＲＮＡのうち、含有量が多いｍｉＲＮＡは１８０～２００種類である。歯髄由来幹細胞に由来する微小粒子における含有量が多いｍｉＲＮＡは、脳神経疾患や眼疾患に治療に関連するマイクロＲＮＡが多い点が特徴であり、従来知られておらず、本発明者が新たに見出した知見である。この特徴は、その他の間葉系幹細胞の微小粒子における含有量が多いｍｉＲＮＡの種類とは大きく異なる。例えば、脂肪由来幹細胞の微小粒子や臍帯由来幹細胞の微小粒子における含有量が多いｍｉＲＮＡには、脳神経疾患や眼疾患に治療に関連するマイクロＲＮＡはほとんど含まれない。
　微小粒子は、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡまたはうつ病の治療に用いられるｍｉＲＮＡとして５種類以上を含むことが好ましく、１０種類以上を含むことがより好ましく、１５種類以上を含むことが特に好ましく、２０種類以上を含むことがより特に好ましい。また、微小粒子は、前述のうつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち５種類以上を含むことが好ましく、１０種類以上を含むことがより好ましく、１５種類以上を含むことが特に好ましく、２０種類以上を含むことがより特に好ましい。
（微小粒子の種類）
　微小粒子は、エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、微小胞、膜粒子、膜小胞、エクトソーム（Ｅｃｔｏｓｏｍｅ）およびエキソベシクル（ｅｘｏｖｅｓｉｃｌｅ）、またはマイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）からなる群から選択される少なくとも１種類であることが好ましく、エクソソームであることがより好ましい。
　微小粒子の直径は、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
　また、微小粒子の表面には、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１などのテトラスパニンという分子が存在することが望ましく、それはＣＤ９単独、ＣＤ６３単独、ＣＤ８１単独でもよく、あるいはそれらの２つないしは３つのどの組み合わせでも良い。
　以下、微小粒子として、エクソソームを用いる場合の好ましい態様を説明することがあるが、本発明に用いられる微小粒子はエクソソームに限定されない。
　エクソソームは、原形質膜との多胞体の融合時に細胞から放出される細胞外小胞であることが好ましい。
　エクソソームの表面は、歯髄由来幹細胞の細胞膜由来の脂質およびタンパク質を含むことが好ましい。
　エクソソームの内部には、核酸（マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡなど）およびタンパク質など歯髄由来幹細胞の細胞内の物質を含むことが好ましい。
　エクソソームは、ある細胞から別の細胞への遺伝情報の輸送による、細胞と細胞とのコミュニケーションのために使用されることが知られている。エクソソームは、容易に追跡可能であり、特異的な領域に標的化され得る。
（微小粒子の含有量）
　微小粒子組成物における、微小粒子の含有量は特に制限はない。微小粒子組成物は、微小粒子を０．５×１０８個以上含むことが好ましく、１．０×１０８個以上含むことがより好ましく、２．０×１０８個以上含むことが特に好ましく、２．５×１０８個以上含むことがより特に好ましく、１．０×１０９個以上含むことがさらにより特に好ましい。
　また、微小粒子組成物における、微小粒子の含有濃度は特に制限はない。微小粒子組成物は、微小粒子を１．０×１０８個／ｍＬ以上含むことが好ましく、２．０×１０８個／ｍＬ以上含むことがより好ましく、４．０×１０８個／ｍＬ以上含むことが特に好ましく、５．０×１０８個／ｍＬ以上含むことがより特に好ましく、２．０×１０９個／ｍＬ以上含むことがさらにより特に好ましい。
　本発明の微小粒子の好ましい態様は、微小粒子をこのように多量または高濃度で含むことにより、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡまたはうつ病の治療に用いられるｍｉＲＮＡの量を高く維持できる。
＜その他の成分＞
　微小粒子組成物は、微小粒子の他に、投与する対象の動物の種類や目的に応じて、本発明の効果を損なわない範囲でその他の成分を含有していてもよい。その他の成分としては、栄養成分、抗生物質、サイトカイン、保護剤、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤などを挙げられる。
　栄養成分としては、例えば、脂肪酸等、ビタミン等を挙げることができる。
　抗生物質としては、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等が挙げられる。
　担体としては、薬学的に許容可能な担体として公知の材料を挙げることができる。
　微小粒子組成物は、歯髄由来幹細胞の培養上清それ自体または微小粒子それ自体であってもよく、薬学的に許容可能な担体や賦形剤などをさらに含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物の目的は、投与対象への微小粒子の投与を促進することである。
　薬学的に許容可能な担体は、投与対象に対して顕著な刺激性を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しない担体（希釈剤を含む）であることが好ましい。担体の例は、プロピレングリコール；（生理）食塩水；エマルション；緩衝液；培地、例えばＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど；フリーラジカルを除去する成分を含有する低温保存培地である。
　微小粒子組成物は、従来公知のうつ病の治療薬の有効成分を含んでいてもよい。当業者であれば用途や投与対象などにあわせて適切に変更することができる。
　一方、微小粒子組成物は、所定の物質を含まないことが好ましい。
　例えば、微小粒子組成物は、歯髄由来幹細胞を含まないことが好ましい。
　また、微小粒子組成物は、ＭＣＰ－１を含まないことが好ましい。ただし、ＭＣＰ－１以外のサイトカインを含んでいてもよい。その他のサイトカインとしては、特開２０１８－０２３３４３号公報の［００１４］～［００２０］に記載のもの等が挙げられる。
　また、微小粒子組成物は、シグレック９を含まないことが好ましい。ただし、シグレック９以外のその他のシアル酸結合免疫グロブリン様レクチンを含んでいてもよい。
　なお、微小粒子組成物は、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）を実質的に含まないことが好ましい。また、微小粒子組成物は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）などの従来の血清代替物を実質的に含まないことが好ましい。
　微小粒子組成物は、上記したその他の成分の含有量（固形分量）がいずれも１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。
＜微小粒子の製造方法＞
　微小粒子の製造方法は、特に制限はない。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清を調製し、続けて歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を精製して、本発明の微小粒子を調製してもよい。あるいは、商業的に購入して入手した歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を精製して、本発明の微小粒子を調製してもよい。さらには、廃棄処理されていた歯髄由来幹細胞の培養上清を含む組成物を譲り受けて（またはその組成物を適宜精製して）、そこから微小粒子を精製して、本発明の微小粒子を調製してもよい。
（歯髄由来幹細胞等の培養上清の調製方法）
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、特に制限はない。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清を実質的に含まないことが好ましい。例えば、歯髄由来幹細胞等の培養上清は、血清の含有量が１質量％以下であることが好ましく、０．１質量％以下であることがより好ましく、０．０１質量％以下であることが特に好ましい。
　歯髄由来幹細胞は、ヒト由来であっても、ヒト以外の動物由来であってもよい。ヒト以外の動物としては、後述する本発明の微小粒子を投与する対象の動物（生物種）と同様のものを挙げることができ、哺乳動物が好ましい。
　培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞としては、特に制限はない。脱落乳歯歯髄幹細胞（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｅｘｆｏｌｉａｔｅｄ　ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ　ｔｅｅｔｈ）や、その他の方法で入手される乳歯歯髄幹細胞や、永久歯歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌ　ｐｕｌｐ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ＤＰＳＣ）を用いることができる。ヒト乳歯歯髄幹細胞やヒト永久歯歯髄幹細胞の他、ブタ乳歯歯髄幹細胞などのヒト以外の動物由来の歯髄由来幹細胞を用いることができる。
　歯髄由来幹細胞は、エクソソームに加え、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子－ベータ（ＴＧＦ－β）－１および－３、ＴＧＦ－α、ＫＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＳＰＡＲＣ、その他の成長因子、ケモカイン等の種々のサイトカインを産生し得る。また、その他の多くの生理活性物質を産生し得る。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清に用いられる歯髄由来幹細胞が、多くのタンパク質が含まれる歯髄由来幹細胞であることが特に好ましく、乳歯歯髄幹細胞を用いることが好ましい。すなわち、本発明では、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を用いることが好ましい。
　本発明に用いられる歯髄由来幹細胞は、目的の処置を達成することができれば、天然のものであってもよく、遺伝子改変したものであってもよい。
　特に本発明では、歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞を用いることができる。実質的に無限増殖が可能な不死化幹細胞を用いることで、幹細胞の培養上清中に含まれる生体因子の量と組成を、長期間にわたって安定させることができる。歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞としては、特に制限はない。不死化幹細胞は、癌化していない不死化幹細胞であることが好ましい。歯髄由来幹細胞の不死化幹細胞は、歯髄由来幹細胞に、以下の低分子化合物（阻害剤）を単独または組み合わせて添加して培養することにより、調製することができる。
　ＴＧＦβ受容体阻害薬としては、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－４－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン、３－（６－メチルピリジン－２－イル）－４－（４－キノリル）－１－フェニルチオカルバモイル－１Ｈ－ピラゾール（Ａ－８３－０１）、２－［（５－クロロ－２－フルオロフェニル）プテリジン－４－イル］ピリジン－４－イルアミン（ＳＤ－２０８）、３－［（ピリジン－２－イル）－４－（４－キノニル）］－１Ｈ－ピラゾール、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（以上、メルク社）、ＳＢ４３１５４２（シグマアルドリッチ社）などが挙げられる。好ましくはＡ－８３－０１が挙げられる。
　ＲＯＣＫ阻害薬としては、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害薬としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｙ－２７６３２、Ｈ－１１５２（以上、富士フイルム和光純薬株式会社）などが挙げられる。好ましくはＹ－２７６３２が挙げられる。
　ＧＳＫ３阻害薬としては、ＧＳＫ－３（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｋｉｎａｓｅ　３，グリコーゲン合成酵素３）を阻害するものであれば特に限定されることはなく、Ａ　１０７０７２２、ＢＩＯ、ＢＩＯ－ａｃｅｔｏｘｉｍｅ（以上、ＴＯＣＲＩＳ社）などが挙げられる。
　ＭＥＫ阻害薬としては、ＭＥＫ（ＭＡＰ　ｋｉｎａｓｅ－ＥＲＫ　ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６－９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ（以上、Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５（以上、コスモ・バイオ株式会社）などが挙げられる。
　本発明の微小粒子を再生医療に用いる場合、再生医療等安全性確保法の要請から、歯髄由来幹細胞またはこれらの不死化幹細胞の培養上清や、それに由来する微小粒子を含む組成物は、歯髄由来幹細胞等以外のその他の体性幹細胞を含有しない態様とする。微小粒子組成物は、歯髄由来幹細胞等以外の間葉系幹細胞やその他の体性幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。
　間葉系幹細胞以外のその他の体性幹細胞の例としては、真皮系、消化系、骨髄系、神経系等に由来する幹細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。真皮系の体性幹細胞の例としては、上皮幹細胞、毛包幹細胞等が含まれる。消化系の体性幹細胞の例としては膵臓（全般の）幹細胞、肝幹細胞等が含まれる。（間葉系幹細胞以外の）骨髄系の体性幹細胞の例としては、造血幹細胞等が含まれる。神経系の体性幹細胞の例としては、神経幹細胞、網膜幹細胞等が含まれる。
　微小粒子組成物は、体性幹細胞以外の幹細胞を含有していてもよいが、含有しないことが好ましい。体性幹細胞以外の幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞）が含まれる。
　歯髄由来幹細胞またはこの不死化幹細胞の培養上清の調製方法としては特に制限はなく、従来の方法を用いることができる。
　歯髄由来幹細胞等の培養上清は、歯髄由来幹細胞を培養して得られる培養液である。例えば歯髄由来幹細胞の培養後に細胞成分を分離除去することによって、本発明に使用可能な培養上清を得ることができる。各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清を用いることにしてもよい。
　歯髄由来幹細胞の培養上清を得るための歯髄由来幹細胞は、常法により選別可能であり、細胞の大きさや形態に基づいて、または接着性細胞として選別可能である。脱落した乳歯や永久歯から採取した歯髄細胞から、接着性細胞またはその継代細胞として選別することができる。歯髄由来幹細胞の培養上清には、選別された幹細胞を培養して得られた培養上清を用いることができる。
　なお、「歯髄由来幹細胞等の培養上清」は、歯髄由来幹細胞等を培養して得られる細胞そのものを含まない培養液であることが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、その一態様では全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まないことが好ましい。当該態様の組成物はこの特徴によって、歯髄由来幹細胞自体は当然のこと、歯髄由来幹細胞を含む各種組成物と明確に区別される。この態様の典型例は、歯髄由来幹細胞を含まず、歯髄由来幹細胞の培養上清のみで構成された組成物である。
　本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞および大人歯髄由来幹細胞の両方の培養上清を含んでいてもよい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清を有効成分として含むことが好ましく、５０質量％以上含むことがより好ましく、９０質量％以上含むことが好ましい。本発明で用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、乳歯歯髄由来幹細胞の培養上清のみで構成された組成物であることがより特に好ましい。
　培養上清を得るための歯髄由来幹細胞の培養液には基本培地、或いは基本培地に血清等を添加したもの等を使用可能である。なお、基本培地としてはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の他、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、ＧＩＢＣＯ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）など）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
　但し、血清を含まない「歯髄由来幹細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後または最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）で歯髄由来幹細胞を培養することによって、血清を含まない歯髄由来幹細胞の培養上清を調製することができる。１回または複数回の継代培養を行うことにし、最後または最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞等の培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない歯髄由来幹細胞の培養上清を得ることができる。
　培養上清を得るための歯髄由来幹細胞の培養には、通常用いられる条件をそのまま適用することができる。歯髄由来幹細胞の培養上清の調製方法については、幹細胞の種類に応じて幹細胞の単離および選抜工程を適宜調整する以外は、後述する細胞培養方法と同様とすればよい。歯髄由来幹細胞の種類に応じた歯髄由来幹細胞の単離および選抜は、当業者であれば適宜行うことができる。
　また、歯髄由来幹細胞の培養には、エクソソームなどの微小粒子を多量に生産させるために、特別な条件を適用してもよい。特別な条件として、例えば、低温条件、低酸素条件、微重力条件など、何らかの刺激物と共培養する条件などを挙げることができる。
　本発明でエクソソームなどの微小粒子の調製に用いる歯髄由来幹細胞の培養上清は、歯髄由来幹細胞の培養上清の他にその他の成分を含んでいてもよいが、その他の成分を実質的に含まないことが好ましい。
　ただし、エクソソームの調製に使用する各種類の添加剤を、歯髄由来幹細胞の培養上清に添加してから保存しておいてもよい。
（微小粒子の調製）
　歯髄由来幹細胞等の培養上清から、微小粒子を精製して、微小粒子を調製することができる。
　微小粒子の精製は、歯髄由来幹細胞の培養上清から微小粒子を含む画分の分離であることが好ましく、微小粒子の単離であることがより好ましい。
　微小粒子は、微小粒子の特性に基づいて非会合成分から分離されることにより、単離され得る。例えば、微小粒子は、分子量、サイズ、形態、組成または生物学的活性に基づいて単離され得る。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清を遠心処理して得られた、微小粒子を多く含む特定の画分（例えば沈殿物）を分取することにより、微小粒子を精製することができる。所定の画分以外の画分の不要成分（不溶成分）は除去してもよい。微小粒子組成物からの、溶媒および分散媒、ならびに不要成分の除去は完全な除去でなくてもよい。遠心処理の条件を例示すると、１００～２００００ｇで、１～３０分間である。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清またはその遠心処理物を、ろ過処理することにより、微小粒子を精製することができる。ろ過処理によって不要成分を除去することができる。また、適切な孔径のろ過膜を使用すれば、不要成分の除去と滅菌処理を同時に行うことができる。ろ過処理に使用するろ過膜の材質、孔径などは特に限定されない。公知の方法で、適切な分子量またはサイズカットオフのろ過膜でろ過をすることができる。ろ過膜の孔径はエクソソームを分取しやすい観点から、１０～１０００ｎｍであることが好ましく、３０～５００ｎｍであることがより好ましく、５０～１５０ｎｍであることが特に好ましい。
　本発明では、歯髄由来幹細胞の培養上清またはその遠心処理物あるいはそれらのろ過処理物を、ラムクロマトグラフィーなど、さらなる分離手段を用いて分離することができる。例えば様々なカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用できる。カラムは、サイズ排除カラムまたは結合カラムを使用できる。
　各処理段階におけるそれぞれの画分中で、微小粒子（またはその活性）を追跡するために、微小粒子の１つ以上の特性または生物学的活性を使用できる。例えば、微小粒子を追跡するために、光散乱、屈折率、動的光散乱またはＵＶ－可視光検出器を使用できる。または、それぞれの画分中の活性を追跡するために、特定の酵素活性などを使用できる。
　微小粒子の精製方法として、特表２０１９－５２４８２４号公報の［００３４］～［００６４］に記載の方法を用いてもよく、この公報の内容は参照して本明細書に組み込まれる。
　微小粒子組成物の最終的な形態は、特に制限はない。例えば、微小粒子組成物は、微小粒子を溶媒または分散媒とともに容器に充填してなる形態；微小粒子をゲルとともにゲル化して容器に充填してなる形態；微小粒子を凍結および／または乾燥して固形化して製剤化または容器に充填してなる形態などが挙げられる。容器としては、例えば凍結保存に適したチューブ、遠沈管、バッグなどが挙げられる。凍結温度は、例えば－２０℃～－１９６℃とすることができる。
　本発明の微小粒子は、従来のうつ病の治療薬または予防薬として用いることができる組成物と比較して、大量生産しやすい、従来は産業廃棄物等として廃棄されていた幹細胞の培養液を利活用できる、幹細胞の培養液の廃棄コストを減らせる等の利点がある。特に歯髄由来幹細胞の培養上清が、ヒト歯髄由来幹細胞の培養上清である場合は、本発明の微小粒子をヒトに対して適用する場合に、免疫学上などの観点での安全性が高く、倫理性の問題も少ないという利点もある。歯髄由来幹細胞の培養上清が、認知症の患者からの歯髄由来幹細胞の培養上清である場合は、本発明の微小粒子をその患者に対して適用する際により安全性が高まり、倫理性の問題も少なくなるであろう。
　本発明の微小粒子が、歯髄由来幹細胞の培養上清に由来する場合、修復医療の用途にも用いられる。特に歯髄由来幹細胞等の培養上清に由来する微小粒子を含む組成物は、修復医療の用途に好ましく用いられる。ここで、幹細胞移植を前提とした再生医療において、幹細胞は再生の主役ではなく、幹細胞の産生する液性成分が自己の幹細胞とともに臓器を修復させる、ということが知られている。従来の幹細胞移植に伴うがん化、規格化、投与方法、保存性、培養方法などの困難な問題が解決され、歯髄由来幹細胞の培養上清またはそれに由来する微小粒子を用いた組成物により修復医療が可能となる。幹細胞移植と比較すると、本発明の微小粒子を用いた場合は細胞を移植しないために腫瘍化などが起こりにくく、より安全と言えるだろう。また、本発明の微小粒子は一定に規格化した品質のものを使用できる利点がある。大量生産や効率的な投与方法を選択することができるので、低コストで利用ができる。
［うつ病の予防薬または治療薬］
　本発明のうつ病の予防薬または治療薬は、本発明の微小粒子を含む。
　本明細書において「予防」とは、疾患（本明細書ではうつ病）の発症を未然に防ぐことをいう。また、本明細書において「治療」とは、発症した疾患における症状の進行を緩和し、抑制し、又は阻止すること、及び症状を改善することをいう。
［うつ病の改善方法］
　本発明のうつ病の改善方法は、有効量の本発明の微小粒子あるいは有効量の本発明のうつ病の予防薬または治療薬を、うつ病を発症した対象に投与することを含む。
　本発明の微小粒子を、うつ病を発症した対象に投与する工程は特に制限はない。
　投与方法は、口腔、鼻腔または気道への噴霧または吸引、点滴、局所投与、点鼻薬などを挙げることができ、侵襲が少ないことが好ましい。局所投与の方法としては、注射が好ましい。また、皮膚表面に電圧（電気パルス）をかけることにより細胞膜に一時的に微細な穴をあけ、通常のケアでは届かない真皮層まで有効成分を浸透させられるエレクトロポレーションも好ましい。局所投与する場合、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与などを挙げることができ、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与または腹腔内投与であることがより好ましい。
　また、種々の製剤化技法を用い、微小粒子のインビボ分布を変えることができる。インビボ分布を変える多数の方法が当業者に既知である。そのような方法の例には、たとえば、タンパク質、脂質（たとえば、リポソーム）、炭水化物または合成ポリマーのような物質で構成される小胞におけるエクソソームの保護が挙げられる。
　うつ病を発症した対象に投与された本発明の微小粒子は対象の体内を循環し、所定の組織に到達してもよい。
　投与回数および投与間隔は、特に制限はない。投与回数は１週間当たり１回以上とすることができ、５回以上であることが好ましく、６回以上であることがより好ましく、７回以上であることが特に好ましい。投与間隔は、１時間～１週間であることが好ましく、半日間～１週間であることがより好ましく、１日（毎日１回）であることが特に好ましい。ただし、投与対象の生物種や投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。
　本発明の微小粒子は、微小粒子を治療有効期間にわたって１週間に１回以上、認知症を発症した対象に投与する用途であることが好ましい。投与対象がヒトである場合は、１週間当たりの投与回数は多い方が好ましく、治療有効期間にわたって１週間に５回以上投与することが好ましく、毎日投与することが好ましい。
　２．０×１０９個／ｍｌの濃度の歯髄由来幹細胞の培養上清を用いる場合、マウスモデルでは、マウス１匹（約２５ｇ）当たり０．１～５ｍｌであることが好ましく、０．３～３ｍｌであることがより好ましく、０．５～１ｍｌであることがより特に好ましい。
　０．１×１０８個／μｇの濃度の微小粒子を用いる場合、マウスモデルでは、マウス１匹（約２５ｇ）当たり１～５０μｇであることが好ましく、３～３０μｇであることがより好ましく、５～２５μｇであることがより特に好ましい。
　その他の動物への体重当たりの投与量の好ましい範囲は、モデルマウスへの体重（約２５ｇ）当たりの投与量から比例関係を用いて計算することができる。ただし、投与対象の症状に応じて、適宜調整することができる。
　本発明の微小粒子を投与する対象の動物（生物種）は、特に制限はない。本発明の微小粒子を投与する対象の動物は、哺乳動物、鳥類（ニワトリ、ウズラ、カモなど）、魚類（サケ、マス、マグロ、カツオなど）であることが好ましい。哺乳動物としては、ヒトであっても、非ヒト哺乳動物であってもよいが、ヒトであることが特に好ましい。非ヒト哺乳動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターであることがより好ましい。
　本発明の微小粒子は、従来公知のうつ病の治療薬と併用してもよい。具体的には、例えば三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、セロトニン・ノルエピネフリン再取り込み阻害薬、非定型抗精神病薬、ケタミンなどのＮＭＤＡＲアンタゴニストと併用してもよい。
　以下に実施例と比較例または参考例とを挙げて本発明の特徴をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
［実施例１］
＜歯髄由来幹細胞の培養上清の調製＞
　ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２混合培地の代わりにＤＭＥＭ培地を用い、その他は特許第６２９６６２２号の実施例６に記載の方法に準じて、ヒト乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製して、培養上清を分取した。初代培養ではウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加して培養し、継代培養では初代培養液を用いて培養した継代培養液の上清をＦＢＳが含まれないように分取し、乳歯歯髄幹細胞の培養上清を調製した。なお、ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地であり、Ｆ１２はハムＦ１２培地である。
＜エクソソームの調製＞
　得られた歯髄由来幹細胞の培養上清から、歯髄由来幹細胞のエクソソームを以下の超遠心法により、精製および回収した。
　乳歯歯髄幹細胞の培養上清（１００ｍＬ）を０．２２マイクロメーターのポアサイズのフィルターで濾過したのち、その溶液を、６０分間、４℃で１０００００×ｇで遠心分離した。上清をデカントし、エクソソーム濃縮ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。再懸濁サンプルを、６０分間１０００００×ｇで遠心分離した。再度ペレットを濃縮サンプルとして遠心チューブの底から回収した（およそ１００μｌ）。タンパク濃度は、マイクロＢＳＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって決定した。エクソソームを含む組成物（濃縮溶液）は、－８０℃で保管した。
　歯髄由来幹細胞の培養上清から精製したエクソソームを含む組成物を、実施例１の微小粒子組成物サンプルとした。
　実施例１の微小粒子組成物に含まれる微小粒子の平均粒径、濃度をナノ粒子解析システム　ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ナノサイト）（日本カンタム・デザイン株式会社製）を用いて評価した。
　実施例１の微小粒子組成物に含まれる微小粒子の平均粒径は５０～１５０ｎｍであった。
　実施例１の微小粒子組成物は１．０×１０９個／ｍｌ以上の高濃度エクソソーム溶液であり、具体的には２．０×１０９個／ｍｌの高濃度エクソソーム溶液であった。
　また、得られた実施例１の微小粒子組成物の成分を公知の方法で分析した。その結果、実施例１の微小粒子は、歯髄由来幹細胞の幹細胞を含まず、ＭＣＰ－１を含まず、シグレック９も含まないことがわかった。そのため、間葉系幹細胞の培養上清の有効成分であるＭＣＰ－１およびシグレック９ならびにこれらの類縁体とは異なる有効成分が、実施例１の微小粒子組成物の有効成分であることがわかった。
［試験例１］：エクソソームで発現するマイクロＲＮＡ
　実施例１の微小粒子組成物に含まれるｓｍａｌｌ　ＲＮＡを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析により解析した。ＮＧＳ解析により、実施例１の微小粒子組成物（歯髄由来幹細胞のエクソソーム）に含まれるｍｉＲＮＡが１７８７個同定された。得られた結果を下記表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［試験例２］：大脳皮質のｍｉＲＮＡとの対比
　マイクロＲＮＡの解析にはＩＭＯＴＡ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ　Ｍｕｌｔｉ－Ｏｍｉｃｓ－Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｔｌａｓ）を用いた。
　タンパクを制御するマイクロＲＮＡをＩＭＯＴＡで大脳皮質（Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｃｏｒｔｅｘ）を中心に検索した。ＩＭＯＴＡは、各組織や細胞におけるｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ、タンパク質の相互作用や発現量について調べることができる対話型のマルチオミクスアトラスである（Nucleic Acids Research, Volume 46, Issue D1, 4 January 2018, Pages D770-D775, "IMOTA: an interactive multi-omics tissue atlas for the analysis of human miRNA-target interactions"）。大脳皮質では、Ｏｍｉｃのカウント数は、タンパク質が３０７１個、ｍＲＮＡが１４１８２個、ｍｉＲＮＡが１１２４個であった。また、大脳皮質で発現率（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｒａｔｅ）がＨｉｇｈのＯｍｉｃのカウント数は、タンパク質が１１１９個、ｍＲＮＡが１１１０個、ｍｉＲＮＡが１４５個であった。
　大脳皮質で発現している１１２４個のｍｉＲＮＡと、歯髄由来幹細胞の培養上清から精製したエクソソーム（実施例１の微小粒子組成物；ＳＧＦ　ｅｘｏｓｏｍｅ）で発現しているｍｉＲＮＡ１７８７個の間で、共通に発現しているｍｉＲＮＡは８５９個であった。すなわち、実施例１の微小粒子組成物（歯髄由来幹細胞のエクソソーム）で発現しているｍｉＲＮＡのうち、大脳皮質でも発現しているｍｉＲＮＡの割合は４８．１％であり、非常に高かった。
　また、実施例１の微小粒子組成物（歯髄由来幹細胞のエクソソーム）で発現があり、大脳皮質での発現がＨｉｇｈであるｍｉＲＮＡは、下記表２および表３に記載の１２２個であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［試験例３］：疾患に関わるマイクロＲＮＡの探索
　得られた解析結果をもとに疾患に関わるマイクロＲＮＡを探索した。疾患に関連するｍｉＲＮＡの抽出を、ＩＭＯＴＡを用いて行った。ここでは、うつ病で発現が抑制（ダウンレギュレート）されるマイクロＲＮＡが含まれているかを探索した。本実施例では、非特許文献１（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９））のＴａｂｌｅ　３に記載のうつ病で発現が抑制（ダウンレギュレート）されるｍｉＲＮＡ２４種類のうち、実施例１の微小粒子組成物（ＳＧＦ　ｅｘｏｓｏｍｅ）で発現しているマイクロＲＮＡの発現量を図１に示した。
　図１より、実施例１の微小粒子組成物には、非特許文献１（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．　１００，　１０１６５０　（２０１９））のＴａｂｌｅ　３に記載のうつ病で発現が抑制（ダウンレギュレート）されるｍｉＲＮＡ、すなわちうつ病の新たな治療標的として挙げられた２４種類のｍｉＲＮＡうち、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-650の１５種類が発現していることがわかった。
　以上より、本発明の微小粒子は、うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含むことがわかった。

Claims (10)

  1. 　うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む、微小粒子。
  2. 　前記微小粒子がエクソソームである、請求項１に記載の微小粒子。
  3. 　前記微小粒子が、歯髄由来幹細胞の培養上清よりも高い濃度で、前記うつ病で発現が抑制されるｍｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の微小粒子。
  4. 　前記微小粒子が下記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち少なくとも１種類を含む、請求項１に記載の微小粒子；
    うつ病関連ｍｉＲＮＡ群：
    hsa-let-7a-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-107、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-1915-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-650。
  5. 　前記微小粒子が前記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち、hsa-let-7a-5p、hsa-let-7f-5pおよびhsa-miR-26a-5pを含む、請求項４に記載の微小粒子。
  6. 　前記微小粒子が、前記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうちhsa-let-7a-5pを含む、請求項４に記載の微小粒子。
  7. 　前記微小粒子が、前記うつ病関連ｍｉＲＮＡ群のうち、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5pおよびhsa-miR-320aのうちいずれか１種類を含む、請求項４に記載の微小粒子。
  8. 　前記微小粒子が歯髄由来幹細胞の培養上清から精製されて単離された微小粒子であり、
    　前記微小粒子が、前記歯髄由来幹細胞の培養上清から前記エクソソームを除いた成分を含まない、請求項１に記載の微小粒子。
  9. 　請求項１に記載の微小粒子を含む、うつ病の予防薬または治療薬。
  10. 　有効量の請求項１に記載の微小粒子、あるいは有効量の請求項９に記載のうつ病の予防薬または治療薬を、うつ病を発症した対象に投与することを含む、うつの改善方法。

     
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