JP7207742B2 - 培養細胞の製造方法,脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法 - Google Patents
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Description
慶應大学の中村雅也准教授らのグループが京都市で開かれた日本再生医療学会で,脊髄損傷の患者に対するiPS細胞の臨床研究を2017年度に始める計画を発表した。対象は,事故から2~4週間後で,患部の炎症が収まり傷口が固まり始める前の患者であり,慢性期の患者は適応外である。
本発明の培地は,無血清培地であり,公知の培地における成分を適宜含んでもよい。また,例えば,特許第4385076号公報及び特開2012-157263号公報には動物細胞を無血清培養するための培地が開示されている。このように公知の文献に記載される要素を適宜本発明の培地に添加してもよい。
GFAP遺伝子は,脊損への移植に適しているとされる成体神経幹細胞(adult neural stem cell)または星状細胞(astrocytes)のマーカーである(非特許文献1,20,22)。
細胞採取播種工程:
細胞増殖工程:
継代工程:
分化誘導工程:
移植・加工工程:
以上の工程で脊髄損傷に効果の高い細胞を得て,直接に投与する細胞を提供する方法または他の基剤と結合させた医療機器のための細胞を提供する方法を提供する。さらに以上の工程で得た培養後培地成分を投与する方法を提供する。
本工程で採取される皮膚は首から上の部位が望ましく,更に採取後の美容上の観点からは耳介後部の皮膚が最も望ましい。皮膚の性別や年齢は問われなく,70歳代までは可能である。以下の工程は全て無菌操作で行う。採取組織の除菌は0.1um pore sizeの除菌フィフターで芽胞を取り除いた70%エタノール水にて行う。
カットした組織を10uM Y-27632の入りのDispase溶液(PBS(-))に,4℃で1晩浸漬する。この組織を次に10uM Y-27632の入りのTrypsin溶液(PBS(-))に37℃,20分浸漬する。さらに,この組織をコラゲナーゼ溶液(DMEM)に浸漬し,37℃,1~2時間スターラーで撹拌して皮膚を消化する。この撹拌後の懸濁液を100umのメッシュを通して残渣を取り除く。この液をPBS(-)にて3回遠心・洗浄して酵素を除き,細胞を得る。この細胞をTrypsin Inhibitor中に入れ10分静置する。この細胞から遠心してInhibitorを除いた後,10uM Y-27632の入った培地に懸濁し,培養皿に播種する。
播種6日までは,培地交換は行わず,培地添加のみとする。その後の培地交換はconditioned medium中に増殖浮遊する細胞を遠心して回収し,新培地に懸濁した細胞を培養系に戻す培地交換を行う。
細胞を30分以上10uM Y-27632処理を行い,EDTAとTrypLEx Expressで細胞をdishより回収する。次にTrypsin Inhibitor中に入れ10分静置する。細胞から遠心してInhibitorを除いた後,10uM Y-27632の入った培地に懸濁し,元の4~5倍の面積のdishに播種する。継代1代目に5枚の100mm2 dishに培養し,confluenceに達したら,その3枚を移植に用いるか,移植まで凍結保存する。残り2枚を更に6枚の100mm2 dishに継代培養し,confluenceに達したら因子添加誘導工程に移る。
因子添加誘導工程は,移植前3日目に必要な細胞に薬物処理を行い必要な因子を添加し培養する工程である。
本工程によって,GDNFmRNAを高発現した細胞,例えば,通常培養の10倍以上発現した細胞が得られる。また,本工程によって,CD13が陰性の細胞(CD13(-))が得られる。また,本工程によって,CD34が陰性の細胞(CD34(-))が得られる。また,本工程によって,CD45が陰性の細胞(CD45(-))が得られる。また,本工程によって,CD90が陰性の細胞が得られる(CD90(-))。また,本工程によって, CD73が陽性の細胞(CD73(+))が得られる。培養細胞のうち,CD73が陽性の細胞(CD73(+))の割合(細胞数)の例は,20%以上100%以下でもよいし,40%以上100%以下でもよいし,60%以上99%以下でもよいし,80%以上99%以下でもよい。因子添加誘導工程を終えた細胞は3日後に移植に用いるか,移植まで凍結保存することが好ましい。
(移植・加工工程)
各行程を経て治療必要数に達した細胞を30分以上10uM Y-27632処理を行い,EDTAとTrypLEx Expressで細胞をdishより回収する。次にTrypsin Inhibitor中に入れ10分静置する。細胞から遠心してInhibitorを除いた後,脊髄穿刺で移植する場合は,107 cell/ml濃度で臨床用輸液に懸濁して用いる。この細胞は他の基剤や細胞との加工に供する。
(組織の採取)
56歳女性のリフト・アップ美容整形手術時に顔部から切除廃棄された約2cm2の皮膚組織の全層部分を用いた。以下の工程は全て無菌操作で行った。この採取組織を0.1um (ミクロン)ポアサイズ(pore size)の除菌フィフターで除菌された70%エタノール水に30秒間浸漬して,直ちにリン酸緩衝食塩水(Phosphate buffer saline)(PBS(-))にて3回洗浄してエタノールを洗浄した。この組織から毛根が存在する箇所を残して皮下脂肪及び真皮結合織を可及的に鋏で除き,次にメスで1mm2程度の大きさにカットした。
カットした組織を10uM Y-27632の入りの予備冷却したディスパーゼ(Dispase)溶液(25 units/ml of PBS(-))5mlに,4℃で1晩浸漬した。
これを遠心して上清を除いた後に,10uM Y-27632の入りのTrypLE Express溶液(5x希釈PBS(-))に37℃,20分浸漬した。
この組織を遠心して上清を除いた後に,20mlのcollagenase溶液(GIBCO: type I)(1400 units/ ml DMEM培地)に浸漬し,37℃,1.5時間スターラーで撹拌した。
撹拌後の懸濁液を100umのメッシュを通して未消化の残渣を取り除いた。この液をPBS(-)にて3回遠心・洗浄して酵素を除き,細胞を得た。
この細胞を大豆トリプシン阻害剤(Soy bean Trypsin Inhibitor)(0.25%/PBS(-))5ml中に入れ10分静置した。
細胞から遠心してInhibitorを除いた後,10uM Y-27632添加培養培地に懸濁し,培養皿に播種した。出発組織の広さ(1~2 cm2)から,1枚の6 well plate (CellBind :COSTAR)の全wellに播種した。
培養培地は以下のとおり調製された。すなわち,基本培地のMCDB153培地(Sigma:Stemline Keratinocyte Basal Medium)中に,インスリン(10mg/L), ホロ・トランスフェリン (5.5mg/L), セレニウム(6.7ug/L),エタノールアミン(2mg/L), ビタミンC(L-Ascorbic acid 2-phosphate semimagnesium salt) (50ug/L), KGF (10ug/L), 脂質(脂肪酸混合物:アラキドン酸(20ug/L),コレステロール(2.2mg/L), DL-a-Tocopherol-acetate (700ug/L), リノール酸(100ug/L),リノレン酸(100ug/L),ミリスチン酸(100ug/L),オレイン酸(100ug/L),パルミトレイン酸(100ug/L),パルミチン酸(100ug/L),ステアリン酸(100ug/L),Tween80(22mg/L), Pluronic F-68(1000mg/L), EGF(20ug/L), FGF(10ug/L),Y-27632(1uM), 1%B-27 supplement XenoFree CTS (Invitrogen)を添加して調製した。
初代培養は,培養7日までは培地交換をすることなく1/3量の割合で培地添加しつつ馴化培養を行った。その後は2日毎に培地交換しながら培養を行った。この培地交換では,古い培地を遠心し,その2/3量を捨て,残った1/3量の培地と遠心で沈殿した浮遊細胞を混ぜて2/3量の新しい培地をさらに加えて培養皿に戻した。100%コンフルエンスに達するまでに10日間を要した。
培養された細胞の培地にY-27632 を10uM濃度で入れて,30分,37℃で静置した。次に培地を全て除き,0.05%EDTA/PBS(-)を2ml/well加えてを10分,37℃で静置した。さらにPBS(-)にて5倍希釈したTrypLEx Expressを0.5ml/well加えてを5分,37℃で静置した。次にピペッティングで細胞をwellより剥離した。ここに2.5ml/wellのTrypsin Inhibitor(0.05%/PBS(-))を加えて回収された細胞を遠心した。上清を除き,2.5mlのTrypsin Inhibitor(0.25%/PBS(-))を入れて細胞を懸濁し10分静置した。細胞から遠心してInhibitorを除いた後,10uM Y-27632の入った培地に懸濁し,培養皿に元の5倍の面積の6 well plate (CellBind :COSTAR)5枚に播種した。1週間後に100%コンフルエンスに達したので,以下の実施例の実験の材料とした。
細胞のGDNF (Glial cell-derived neurotrophic factor) mRNA発現を増加させる化合物またはサイトカインを見出すために可能性のある以下の6個のものを検討した。Valproic acid (VA) , Platelete-derived growth factor (PDGF), SAG(又はPurmorphamine or rh-Sonic Hedgehog (PeproTech)), Bone morphogenic protein 4 (BMP4) これら6個のものを以下の組合せで実施例1コンフルエントになった7wellに添加した。(1)Control(無添加)(2)VA(1uM) (3)VA(1uM) + PDGF(10ng/ml) (4)VA(1uM)+SAG(0.3uM) (5)PDGF(10ng/ml) (6) SAG(0.3uM) (7)MBP-4(10ng/ml):添加後72時間後に各wellからTRIzol法にてtotal RNAを抽出した。PCR用cDNA合成キット「ReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Kit」を用いて,ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Kitの10μl反応系に対して,各 total RNAを0.5ug でそれぞれ添加し,各cDNA合成を行った。
これらのcDNAサンプルでのGDNF mRNAの発現比較をヒトGDNF リアルタイムPCRプライマーセット(Roche 5326257)を用いてリアルタイムPCR法にてアプラ イドバイオシステムズ社のABI PRISM(登録商標)7700を用いたインターカレーターアッセイ法で行った。qRT-PCR反応はTOYOBOのSYBR(登録商標) Green Realtime PCR Master Mix -Plus- を用いて反応液を調製した。
反応液の調製
蒸留水 11 μL
SYBR(登録商標) Green Realtime PCR Master Mix -Plus- 25 μL
Plus solution 5μL
プライマー 1 (10μM) 2 μL
プライマー 2 (10μM) 2 μL
サンプル溶液 5 μL
合計液量 50 μL
反応液を96 well plateの各wellに入れてPCR反応を行った。
PCRサイクルは3ステップ法で,アニール 60℃/伸長 72℃を条件とし(1)~(2)を40 cycle行った。最後のステップで融解曲線(Melting Curve)解析を行い,primer dimerの形成が見られないことを確認した。
95℃ 60秒
(1)↓
(2)95℃ 15秒
(3)60℃ 15秒
(4)72℃ 45秒(data collection)
また,同時にGAPDHmRNAの検出を行い,GDNFmRNAの発現量を,GDNFmRNA/ GAPDHmRNAとして補正した。その結果,(6)SAGのみが(1)コントロールの10倍以上のGDNFmRNA発現が得られた。(6)のSAGの代わりにPurmorphamine(1.5uM)や, rh-Sonic Hedgehog(10ng/ml)でも同様に10倍近くのGDNFmRNA発現が得られた。(図-1)GAPDHのprimer 配列は以下の配列で合成した。
Forward primer:ATCTTCTTTTGCGTCGCC (配列番号1)
Reverse primer:GATGACAAGCTTCCCGTTC (配列番号2)
発現鎖長:250bp
実施例1でコンフルエンスに達した3wellsのうち2 wellsに神経前駆細胞の分化同定用キット Human/Mouse/Rat Neural Progenitor Cell Functional Identification Kit(R&D Systems SC082)の分化用培地(medium for NPC differentiation)で7日間培養した。もう一つのwellには発明の維持培地で同日間培養した。7日目に実施例2と同様にtotal RNAを抽出後,cDNAを調製した。このcDNAを用いて神経幹細胞のマーカーであるNestin mRNAの発現比較をRT-PCRにてGAPDH mRNAを基底状態として測定した。Nestin のPrimerはForward CGTTGGAACAGAGGTTGGAG(配列番号3)とReverse TCCTGAAAGCTGAGGGAAG(配列番号4)であり,発現鎖長は262bpであった。GAPDHのprimerは実施例2と同様のものを用いた。
その結果を図2に示す。
実施例1でコンフルエンスに達した3wellsのうち2 wellsに神経前駆細胞の分化同定用キット Human/Mouse/Rat Neural Progenitor Cell Functional Identification Kit(R&D Systems SC082)の分化用培地(medium for NPC differentiation)で7日間培養した。もう一のwellには発明の維持培地で同日間培養した。7日目に実施例2と同様にtotal RNAを抽出後,cDNAを調製した。このcDNAを用いてAstrocytes又はAdult neural stem cellsのマーカーであるGFAP mRNAの発現比較をRT-PCRにてGAPDH mRNAを基底状態として測定した。GFAP のPrimerはForward :ACATCGAGATCGCCACCTAC(配列番号5)とReverse :ACATCACATCCTTGTGCTCC(配列番号6)であり,発現鎖長は219bpであった。GAPDHのprimerは実施例2と同様のものを用いた。その結果を図3に示す。
培養されてコンフルエントになった細胞を培養皿からtrypsin-EDTA溶液を用いて剥離・単離した。次に3%BSA/PBS(-)溶液で30分間置くことによりブロッキングを行い,非特異的吸着を防いだ。更に4%パラホルムアルデヒドで10分固定後,0.5% Triton X-100/PBS(-)に5分,4℃インキュベートした。この細胞をCD73に対するモノクローナル抗体CD73-PE (BD 561014)にて4℃オーバーナイトでインキュベートした。この細胞を5回洗浄液で洗浄して結合しなかった抗体を除去し,フローサイトメトリーはSONY EC800を用いて抗原の発現を解析した。その結果を図4に示す。
SAG処理等でGDNFを増加させていない培養細胞を酵素Accutase(GIBCO A11105)を用いて培養皿から剥離した。この剥離細胞1x105個を200ulの培養液に懸濁し,1週間前に脊髄に錘で損傷を与え,かつ免疫抑制剤を投与したラットの脊髄損傷部位に注入移植した。対照のラットには同量の培養培地のみを注入するsham operationを行った。細胞移植群は5匹,対照群は4匹のラットを実験に用いた。脊髄損傷の治療効果は動物の動きをビデオ装置で観察して点数化するBBB Score法で測定した。結果を図に示す。図中,横軸は細胞移植後の日数,縦軸はBBB Scoreを示す。実線は上記細胞を移植した結果,点線は対照の結果を示し,*はStudent T testによる有意差検定の結果P<0.05, **はP<0.01, ***はP<0.001であることを示す。投与後3日から対照群に比較して細胞移植群はBBB Scoreで2点差の付く統計的に有意な効果(P<0.05)を示した。移植後35日を過ぎると,対照群に比較して細胞移植群はBBB Scoreで4点差の付く統計的に有意な効果(P<0.001)を示した。骨髄間質細胞移植の報告(非特許文献23)では,有意差がつくまで2週間近くかかっている。また,iPSから誘導した神経幹細胞移植(非特許文献1)では有意差がつくまで3週間を要している。これらに比べ今回の結果は劇的に早く,3日からの効果が見られた。しかも骨髄間質細胞移植では4週間経過しても,有意差はP<0.05であるが,本発明は同時期にP<0.001とより優位であった。この結果は本発明で得られる細胞が脊髄損傷の治療に非常に効果的であることを示している。
動物及び試験法
実験にはNOD/Shi-scid, IL-2Rγnull(登録商標)系統のマウス(6週齢,♀,公共財団法人 実験動物中央研究所)を用いた。1週間の順化期間の後,汎用群分けシステム(株式会社ヴィジョンズ)を用いて,可能な限り体重の平均値が同じくなるようにして3群に群分けした. それぞれの群のマウスの右側腹部に,実施例1と同じ方法で培養した(細胞Aとする),陰性対照細胞として培養液,陽性対照細胞としてのHeLa S3(DSファーマバイオメディカル株式会社)をそれぞれシリンジ(マイジェクター(登録商標),針仕様:27G)により移植(いずれも0.2 mL/個体)した。それぞれの群を細胞A群(10個体),培養液群(10個体),HeLa S3群(5個体)とする。なお,細胞Aは,実施例1と同じ方法で培養した細胞を3系統用意し,α-MEM培地にそれぞれ1x107 cells/mLで懸濁し,空気を含まないように2 mlのクライオチューブに分注した。分注のおよそ3時間後,α-MEM培地を除いて培養培地液に再懸濁し,3系統を等量の細胞数ずつ混合して5x107 cells/mLの懸濁液を調製し,移植まで4℃にて保存し,調製開始後2時間以内に移植を行った。なお,直前に計測した3系統を混合した検体の移植後の生存率は75%であった。
それぞれの群のマウスは,「公益財団法人実験動物中央研究所・本所における実験動物の飼育管理に関する作業基準」に準拠して移植から13週飼育し,一般状態観察,体重測定および結節の観察・サイズ測定を週1回行った。結節を観察する際は,被験物質移植部位を指で触診し,硬い感触のある場合に結節の形成が確認されたものとし,長径(L)と短径(W)をノギスで測定した。結節体積(V)は「ヌードマウスと抗癌剤評価」(野口達次,櫻井欽夫,稲葉實編著,蟹書房,1991年6月)の腫瘍体積簡易計算式を用い,計算式V=LW2/2で算出した(単位は長径と短径はmm, 体積はmm3). なお,HeLaS3群の個体は,観察期間中に結節重量(比重を1として体積より計算)が体重の1/10を超えたことが確認されたため,第5週~第8週の時点で人道的エンドポイントとして観察を終了し安楽死処分した。
安楽死処分の際,マウスはイソフルラン麻酔下で全放血により安楽死させ,胸腔内,腹
腔内諸臓器を観察した。また移植部位皮膚を皮下組織を含めて採材し,10%中性緩衝ホル
マリン液で固定した。ホルマリン固定標本は常法にてパラフィン包埋後薄切しHE染色,抗HLA(Human Leucocyte Antigen)免疫染色を行い,光学顕微鏡で観察した。
その結果を図6に示す。図6は,発癌性の評価を示す図面に替わるグラフである。HeLa S3群においては,移植後3週で100%(5/5例)の個体に結節の形成が認められたが,培養液群及び細胞A群では観察終了時まで結節の形成は認められなかった。HeLa S3群の全例で結節が形成された。この結節は連続した体積増加を示し低分化型癌の組織像と共に抗HLA反応を示したため,HeLa S3細胞に由来する腫瘍であると判断された。細胞A群では病理組織検査により6/10例に抗HLA反応陽性を示す繊維増殖が確認され,移植細胞が残存したものと判断された。しかし,全観察期間を通じて全例で結節の形成は認められず,病理組織検査におけるHE染色像において過形成変化あるいは腫瘍性変化を認める所見は認められなかった。この結果は,本試験の条件下では細胞Aは造腫瘍性を示さないことを示している。
自己細胞を各自己皮膚より培養し,SAG等を用いたGDNFを増加させない培養細胞を酵素Accutase(GIBCO A11105)を用いて培養皿から剥離した。事前に腰椎穿刺で1 mlの脊髄液を採取した後に,1 mlの注射用生理食塩液に懸濁した剥離細胞1x107個を穿刺跡に自家移植した。この症例1~7の脊損患者7名は年齢は32~51歳で,男性6名,女性1名であった。投与回数は2~3回で,投与間隔は1~3か月であった。損傷から投与までの期間は3~23年,C4~7の頚髄損傷で,四肢麻痺であった。副作用は投与日の頭痛・発熱が見られた。7名中3名には治療効果はなかった。他の4名は治療効果が認められ,腕の発汗,皮膚感覚回復,尿の貯留改善,握力アップ,指の動き改善等の自覚症状があった。症例8のみ細胞のSAG処理を行い,GDNF mRNAを増加させた細胞を移植した。上記と同じ細胞数を1か月以内に2回投与した。症例8の患者は47歳男性で,胸髄Th3損傷で,損傷から投与までの期間は2年半,下肢麻痺であった。副作用は投与時の頭痛があった。治療効果は投与1か月後に現れ,補助下での立位歩行が可能となった。症例8は症例1~7に比較して下肢麻痺と軽症で投与までの2年半と短かったが効果は劇的でまた回復時間も短かった。
配列番号2:プライマー
配列番号3:プライマー
配列番号4:プライマー
配列番号5:プライマー
配列番号6:プライマー
Claims (7)
- 採取されたヒト皮膚をディスパーゼ処理,トリプシン処理,及びコラゲナーゼ処理の順で処理してヒト皮膚由来幹細胞を得るヒト皮膚由来幹細胞取得工程と,
前記ヒト皮膚由来幹細胞取得工程で得られた前記ヒト皮膚由来幹細胞を,SAGを含む無血清培地で培養する培養工程を含む,グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)mRNA及びCD73タンパク質を含む培養細胞の製造方法であって,
前記無血清培地は,基本培地,リン脂質,脂質,EGF,線維芽細胞増殖因子,ROCK阻害剤,及びB-27サプリメントと,
「インスリン,トランスフェリン及びセレニウム」からなる群より選ばれるいずれか1種又は2種以上をさらに含む,培養細胞の製造方法。 - 請求項1に記載の方法であって,
前記無血清培地は,パルモルファミン(Purmorphamine)及びソニック・ヘッジホッグ (Sonic hedgehog,SHH)タンパク質のいずれか又は両方をさらに含む,方法。 - 請求項1に記載の方法であって,
前記無血清培地は,インスリン,トランスフェリン及びセレニウムを含む,方法。 - 請求項1~3のいずれかに記載の方法であって,
前記無血清培地は,抗酸化剤をさらに含む,方法。 - 請求項1~4のいずれかに記載の方法であって,
前記無血清培地は,表皮細胞増殖因子(KGF)をさらに含む,方法。 - 請求項1に記載の方法であって,
前記無血清培地は,カルシウム・イオン濃度が0.03mM以上0.12mM以下である,方法。 - 請求項1に記載の方法を用いて培養細胞を製造する工程と,
前記培養細胞,前記培養工程において得られた培地,及び前記培養工程において得られた分泌物のいずれか1種又は2種以上を含む脊髄損傷疾患の治療剤の製造方法。
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