JP2013502915A - フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 - Google Patents
フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)フィブリノゲンを含む組成物を、単離された細胞のサンプルに加える工程と、
(b)工程(a)から得られた生成物に抗線維素溶解薬を加える工程と、
(c)工程(b)から得られた生成物に、少なくとも1つの凝固因子、カルシウム源、トロンビン、またはこれらの任意の組み合わせを加える工程と、
(d)工程(c)から得られた生成物に多糖組成物を加える工程と、
(e)工程(d)から得られた生成物の中または表面で、単離された細胞を培養する工程と、そして
(f)工程(e)から得られた生成物のナノ構造化を誘発する工程と
を含んでなることを特徴とする方法に関する。
本発明は、人工組織を製造するためのインビトロで行われる方法、この方法によって得ることができる人工組織、および損傷した組織または臓器の機能活性を部分的または完全に高め、回復させ、または置き換えるための、この人工組織の使用を提供する。
(a)フィブリノゲンを含む組成物を、単離された細胞のサンプルに加える工程と、
(b)工程(a)から得られた生成物に抗線維素溶解薬を加える工程と、
(c)工程(b)から得られた生成物に、少なくとも1つの凝固因子、カルシウム源、トロンビン、またはこれらの任意の組み合わせを加える工程と、
(d)工程(c)から得られた生成物に多糖組成物を加える工程と、
(e)工程(d)から得られた生成物の中または表面で、単離された細胞を培養する工程と、そして
(f)工程(e)から得られた生成物のナノ構造化を誘発する工程と
を含んでなる方法に関する。
本発明の第2の態様は、上述の本発明の方法によって得ることができる人工組織(以下、本発明の人工組織)に関する。
薬物および化学生成物は、試験動物に投与する前に評価されなければならない。この観点から、化粧品の部門で動物試験を制限し、ときには禁止する目的で、欧州連合によって承認されているいくつかの報告および指示が存在し(化粧品に対する加盟国の法律に類似するものに関連する欧州理事会のDirective 76/768/EEC)、完全な禁止は、次の数年は有効であると考えられる。欧州連合は、すべての測定値を支持し、その主な目的は、試験目的で用いられる動物の幸福であり、試験に用いられる動物の数を最低限に減らすための科学的な置換方法を達成するためのものである(1998年3月23日付けの議会の決定1999/575/EEC、実験および他の科学目的で用いられる脊椎動物を保護するための、欧州条約の共同体による結論に関連する、1999年8月24日のOfficial Record L 222)。
感染性疾患、炎症性疾患、遺伝性疾患もしくは変性疾患、物理的もしくは化学的な損傷、または血流の遮断によって、組織または臓器から細胞が失われることがある。この細胞の消失によって、この組織または臓器の正常な機能が変わってしまい、その結果、患者の生活の質を低下させてしまう疾患または身体的影響が進行してしまうことがある。したがって、この組織または臓器の正常な機能を再生するか、または再確立する試みは重要である。損傷した組織または臓器を、組織工学の技術を用いて実験室で作られた新しい組織または臓器と置き換えてもよい。組織工学の目的は、人工の生体組織を構築し、これを医薬用途に使用し、疾患のある組織および臓器の機能活性を回復させ、置き換え、または高めることである。この種の技術の治療への使用は、実際には、あらゆる分野の用途に対し、制限はない。組織工学技術を使用することで、組織および臓器の待機リストを減らすことができ、その結果、レシピエントにおける疾患の罹患率−死亡率を減らすことができる。結果として、臓器ドナーにおける罹患率−死亡率は、論理的に下がる。それに加えて、自系の細胞または組織を組織工学で用いることに関連する多くの利点が存在し、以下のものを含む。(a)ドナーからレシピエントへ、感染性薬剤による多くの感染を顕著に減らすこと、(b)宿主免疫移植拒絶が起こらず、したがって、患者は、免疫抑制処置を受ける必要がなく、免疫抑制に関連する影響および問題が予防される。
A.ヒト皮膚サンプルを得ること
局所および局所領域へ麻酔を行い、ドナーから得た完全な厚みをもつ皮膚サンプルを使用する。このサンプルを滅菌状態で得たら、真皮層が露出するまで、ハサミを用いて皮下脂肪組織を除去する。次いで、サンプルの汚染を可能な限り防ぐために、除去した組織を、抗生物質(ペニシリンG 500U/mlおよびストレプトマイシン500μg/ml)および抗真菌薬(アンホテリシンB 1.25μg/ml)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)から作られた滅菌輸送媒体にすぐに入れた。
輸送期間の後に、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB(それぞれ、500U/ml、500μg/ml、1.25μg/ml)を含む滅菌PBS溶液ですべてのサンプルを2回洗浄し、サンプルに付着しているかもしれない血液、フィブリン、脂肪または外来物質をすべて除去しなければならない。
細胞がコンフルエンス状態に達したら、異なる線維芽細胞または角化細胞の細胞培養物を滅菌PBSで洗浄し、トリプシン 0.5g/LおよびEDTA 0.2g/Lの溶液1〜3mL中、37℃で10分間インキュベートしなければならない。したがって、細胞接着機構は崩壊し、角化細胞および真皮の培養フラスコ表面に付着しておらず、分離された細胞が得られる。
1−細胞外のフィブリンおよびアガロースの基質を用い、その中に線維芽細胞を浸して真皮代替物を作製する。これらの真皮代替物を、栄養物は通るが、細胞自体は通らないような、直径が0.4μmの多孔性挿入物の上で直接作製する。真皮代替物10mlを以下の様式で製造する。
−献血によって、ヒト血漿7.6mLを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト皮膚線維芽細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに分散させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
−多孔性細胞培養挿入物を可能な限り等分する。
−これを少なくとも30分間休ませ、重合させる。
(1)人工ヒト皮膚産物の顕微鏡分析(組織学的品質制御)。
人工皮膚サンプルの評価から、これらのサンプルの構造は、正常な天然のヒト皮膚と非常によく似ていることがわかったが、培地中での成長時間が、これらの人工産物の構造に直接影響を与えていた。特定的には、培養物中に4週間維持されたサンプルの分析から、以下のことがわかった。
・製造から1週間後に評価した皮膚産物は、厚い間質層を有しており、その中に、多くの増殖している線維芽細胞の集合が存在している。上皮細胞の単一層がこの間質代替物の表面に存在しているようであった。
・培養物を2週間成長させると、間質中にかなり多くの細胞が観察され、また、初期の上皮層形成も見られ、その表面に1列または2列の角化細胞が生成している。
・このときから、角化細胞の増殖は続き、3週目には、上皮中に新しい細胞の列が観察されている。
・4週目に、全部で3〜4列の細胞が存在していたが、上皮の異なる層を区別することはできなかった。乳頭、皮膚付属器または角質層はみられなかった。
・マウスに上の産物を移植してから10日目に、細胞中に非常に大量の真皮が存在し、無秩序な細胞外線維および物質を観察することができた。真皮中に白血球性浸潤物が存在し、また、細動脈、小静脈、毛細管を含む重要な血管組織の新生物が存在することを強調しておく。上皮レベルで、3〜5の細胞層が観察され、有棘層および顆粒層は明確にはわからないが、基底層および初期角質層は明確にみられた。同様に、乳頭または皮膚付属器は存在していないものの、均質な真皮の線がみられる。
・無胸腺動物に移植してから20日後、真皮において線維芽細胞および白血球の濃度が低下し、真皮の原線維含有量が顕著に高まった。4〜6の表皮角化細胞の間に存在しているのも観察され、この時点で、基底層、有棘層、顆粒層、角質層の4種類の異なる層が区別され、有棘層は、4種類の中で一番明確ではかった。進化10日目の場合と同様に、乳頭または皮膚付属器は存在していないものの、均質な真皮の線がみられる。
・30日目のサンプルでは、それまでよりも真皮の原線維含有量が多くなっているのが観察され、大量の上皮層がみられ、6〜9の角化細胞層の間に存在し、明らかな上皮層の分化(基底層、有棘層、顆粒層、角質層)がみられた。乳頭または皮膚付属器は、ここでもみられなかった。
・インビボ進化の40日目、真皮層にもっと多くの線維が含まれているのが観察され、上皮角化細胞層の数(6〜9)が確立された。真皮接合部の乳頭または皮膚付属器は、明確ではなかった。
正常なヒト皮膚コントロールと、実験室で得た皮膚産物について、サイトケラチン(パンサイトケラチン、サイトケラチン1、サイトケラチン10)、フィラグリンおよびインボルクリンの発現を分析し、それぞれの種類のサンプルについて、これらのタンパク質の特異的な発現パターンを決定し、この結果は、人工のヒト皮膚は、正常なヒト皮膚と同じ表面タンパク質を発現することができることを示している。
A.皮膚およびヒト臍帯サンプルを得る
局所および局所領域へ麻酔を行い、ドナーから得た完全な厚みをもつ皮膚サンプルを使用する。このサンプルを滅菌状態で得たら、真皮層が露出するまで、ハサミを用いて皮下脂肪組織を除去する。次いで、サンプルの汚染を可能な限り防ぐために、除去した組織を、抗生物質(ペニシリンG 500U/mlおよびストレプトマイシン500μg/ml)および抗真菌薬(アンホテリシンB 1.25μg/ml)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)から作られた滅菌輸送媒体にすぐに入れた。
輸送期間の後に、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB(それぞれ、500U/ml、500μg/ml、1.25μg/ml)を含む滅菌PBS溶液ですべてのサンプルを2回洗浄し、サンプルに付着しているかもしれない血液、フィブリン、脂肪または外来物質をすべて除去しなければならない。次いで、それぞれのサンプルを独立して処理する。
細胞がコンフルエンス状態に達したら、異なる線維芽細胞培養物またはウォートンジェリー幹細胞培養物を滅菌PBSで洗浄し、トリプシン 0.5g/LおよびEDTA 0.2g/Lの溶液1〜3mL中、37℃で10分間インキュベートしなければならない。
1−細胞外のフィブリンおよびアガロースの基質を用い、その中に線維芽細胞を浸して真皮代替物を作製する。これらの真皮代替物を、栄養物は通るが、細胞自体は通らないような、直径が0.4μmの多孔性挿入物の上で直接作製する。真皮代替物10mlを以下の様式で製造する。
−献血によって、ヒト血漿7.6mLを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト皮膚線維芽細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに分散させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
−多孔性細胞培養挿入物を可能な限り等分する。
−これを少なくとも30分間休ませ、重合させる。
(1)ウォートンジェリー幹細胞の生存能力の決定(顕微鏡分析による品質制御)(図3A)。
エネルギー分散型のx線顕微鏡分析技術によって細胞の生存能力を決定すると、細胞内のNa、Mg、P、Cl、K、S、Caイオンの濃度プロフィールを決定することができ、それによって、この次の人工組織を構築するときに使用するのに最も適した継代培養物を知ることができる。この目的のために、以下の方法論を行うことが必要である。
(a)樹脂(ピオロフォーム)の層であらかじめコーティングしておいた金の格子の上で、細胞を培養すること。細胞がサブコンフルエンス状態に達したら、格子を4℃の水道水で10秒間洗浄し、培地を取り除く。
(b)細胞を液体窒素中で凍らせて固定すること。
(c)凍らせて固定したサンプルに、低温(−100℃)で20分間、減圧凍結乾燥技術を用いることによって乾燥させること。凍らせて固定するのは、Polaron E5300凍結乾燥器で行う。
(d)凍らせて固定し、乾燥させたサンプルを、特定のサンプルフォルダに取り付けること。
(e)Sputtering Polaron E−5000中、細胞を炭素でコーティングすること。
(f)エネルギー分散型x線検出器(EDAX)と、逆分散する電子の検出器とを備えるPhilips XL−30 Scanning Electron Microscopeで観察すること。
(g)以下の定数を用いる、定性的な微量分析による分析。電圧10Kv、倍率10,000倍、表面の角度0°、観察角度35°、500cps、計測蓄積時間200秒。定性的なスペクトルをそれぞれの試験した細胞について得る。このスペクトルで、K軌道でのNa、Mg、P、Cl、K、Caの値を選び、1秒あたりの計測(CPS)、バックグラウンド(BKGD)または特徴的ではない放射線、ピーク/バックグラウンド(P/B)指数を計測する。
(h)定量的な微量分析による分析。乾燥重量1kgあたり、単位mmol/KgでのNa、Mg、P、Cl、S、K、Ca元素の濃度を、Hall法を変えることによって最初に定量する(Hallら、1973;Staham and Pawley、1978)。この目的のために、標準的なNa、Mg、P、Cl、K、S、Ca塩を20%デキストラン(300,000ダルトン)に溶解したものを用い、標準的な曲線または直線を得る。これらの塩を、分析する標本と同じ様式で処理する。それぞれの分析した元素の濃度は、最後に標準的な曲線からの線形回帰法を用いて算出する。
人工皮膚サンプルの評価から、これらのサンプルの構造は、正常な天然のヒト皮膚と非常によく似ていることがわかったが、培地中での成長時間が、これらの人工産物の構造に直接影響を与えていた。特定的には、培養物中に4週間維持されたサンプルの分析から、5つまでの上皮層は、構築物の表面に次々と作製されるが、最後の段階になるまで、細胞間の接合は形成されないことがわかった。次に行った、ウォートンジェリー幹細胞を用いて作製したヒト皮膚産物のインビボ評価は、人工間質の上に厚い上皮層が成長し、多くのデスモソーム型細胞間接合および十分に構築された基底膜が作製されることを示していた。これらすべてのことから、通常の天然ヒト皮膚と見分けがつかない人工皮膚が得られ、作製した産物の有用性を示している。
正常なヒト皮膚コントロールと、実験室でウォートンジェリー幹細胞から得た皮膚産物について、サイトケラチン(パンサイトケラチン、サイトケラチン1、サイトケラチン10)、フィラグリンおよびインボルクリンの発現を分析し、それぞれの種類のサンプルについて、これらのタンパク質の特異的な発現パターンを決定し、この結果は、人工のヒト皮膚は、正常なヒト皮膚と同じ表面タンパク質を発現することができることを示している。
人工角膜を製造するためのプロトコル
以下に記載するプロトコルは、ヒトおよび動物の角膜産物のプロトコルに似ており、ただし、動物の角膜産物に内皮層を組み込むことだけが異なる。
−局所および全身領域へ麻酔を行い、角膜縁から生体組織を得て、これを滅菌生理食塩水に入れて実験室に輸送する。
−角膜を手術によって除き、虹彩、結膜、血餅残渣を除去する。
−動物の角膜産物の場合、デスメ膜を手術で切除し、上皮細胞を単離し、これを内皮細胞用培地で培養する。この培地の組成は、DMEM培地3部と、Ham F−12培地1部であり、すべて、10%ウシ胎仔血清、抗生物質−抗真菌薬、アデニン24μg/mlおよび異なる成長因子:ヒドロコルチゾン0.4μg/ml、インスリン5μg/ml、トリヨードチロニン1.3ng/ml、コレラ毒素8ng/ml、上皮成長因子(EGF)10ng/mlが加えられていた。
−角膜中央部2mmを切断し、2% コラゲナーゼI中、37℃で6時間インキュベートする。1000rpmで10分間遠心分離し、角膜基質の成人幹細胞(有角赤血球)を集め、これを、10%ウシ胎仔血清および抗生物質を含むDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)中で培養させる。
−約1mmの小さな外植片中、角膜縁を断片化し、初代角膜上皮細胞を得るために、これらの外植片を培養フラスコ表面で直接培養する。
1−栄養物は通るが、細胞自体は通らないような、直径が0.4μmの多孔性挿入物を用い、あらかじめ単離しておいた内皮細胞を継代する。選択される細胞は、4回目の継代培養物に属していなければならない(内皮細胞の生存能力が最大)。この第1の工程は、動物の三層構造の角膜産物を作製するためだけに行われるだろう。
2−直径が0.4μmの多孔性挿入物の上で、細胞外フィブリンおよびアガロースの基質を用い、有角赤血球が中に含まれている角膜間質代替物を作製する(これは、二層構造のヒト角膜産物の場合には、第1の工程であろう)。間質代替物10mlを製造するために、
−献血によってヒト血漿7.6mlを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト有角赤血球を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−フィブロネクチン10μlを濃度500mg/mlで加える。この目的は、間質代替物に表面上皮細胞が接着しやすくなり、現時点で開発されている角膜産物中に存在する分離の危険性をなくすことである。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに分散させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
−多孔性細胞培養挿入物を可能な限り等分する。
−これを少なくとも30分間休ませ、重合させる。
(1)角膜産物の顕微鏡分析および免疫組織化学的分析(組織学的品質制御)(図4A)。
顕微鏡分析から、組織工学によって作られた角膜産物が、コントロールとして使用した天然の角膜と構造的によく似ていることがわかった。特定的には、十分に形成された角膜上皮がみられ、多くの細胞間接合と間質が、その間に有角赤血球を含む多くのフィブリン線維で構成されている。これらすべてのことから、上述のプロトコルに基づいて作られた二層構造または三層構造の人工角膜産物は、ヒトおよび動物の正所性角膜と適合性であることを示唆している。
二層構造または三層構造の人工角膜産物の機械特性の分析は、上述のプロトコルに基づいて行われ、この組織の粘弾挙動を示し、角膜では、アガロース含有量が増えるにつれて弾性係数が大きくなり、アガロースが低濃度で使用される場合、降伏点が顕著に低下する。粘弾性および降伏点の分析から、フィブリンおよびアガロースの産物の物理特性は、フィブリンまたはコラーゲンのみを含む産物よりも大きいことがわかった。これらすべてのことから、フィブリンおよびアガロースの角膜の物理特性は最適であり、コントロールとして使用する正常なヒト角膜と部分的に似ていることが示唆される。
人工角膜産物の光学特性は、ヒトまたは動物の角膜の機能を発揮しなければならない組織にとって適切であった。特定的には、分光透過率の分析から、角膜産物が、非常に適切なレベルの透明度を示す傾向があり、この透明度が、正常なヒト角膜に匹敵し、非常によく似た散乱度を示すことが示された。さらに、フィブリンおよびアガロースの産物の吸収係数、分散係数、吸光係数は、フィブリン組織を用いて得られる係数よりも大きかった。しかし、短波長(紫外線範囲)での吸光度は、二層構造または三層構造の人工角膜産物において、コントロールよりも小さく、このことは、この種類の産物に紫外光フィルタを用いる必要性を示唆している。全体的に、角膜産物の透明度は、特に、厚みが0.7mmを超えない生成物では、許容される範囲にある。
遺伝子発現分析の場合、ヒト上皮および間質の有角赤血球細胞の初代角膜培養物およびヒトの二層人工角膜産物からから全RNAを抽出し、後者は、顕微鏡によって分析されている(Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0(登録商標))。この分析は、ヒト人工角膜産物で発現した遺伝子は、正常な角膜の機能と適合性であるが、組織の成長に関連する多くの遺伝子が、正常な角膜に関連して過剰に発現することを示している。特定的には、人工角膜産物は、細胞間接合(コネキシン、インテグリン、デスモプラキン、プラコグロビンなど)、上皮の成長(Sema3A、RUNX2、TBX1)、細胞の分化(PLXNA4A、FLG、DKK4、DCN)、基底膜(ラミニン、コラーゲンIV)、細胞外基質(コラーゲン、デコリン、ビグリカン、MMP、フィブロネクチン)などを確立することに集中した機能をもつ大量の遺伝子を発現した。これらの結果は、作られた角膜産物が、正常な角膜で起こるのと同じ進化プロセスを受けることができ、これらの産物によって発現する遺伝子の機能が、正常なものに匹敵することを示唆している。
人工角膜産物6の臨床的な挙動を評価するために、部分的な厚みをもつ二層構造のヒト角膜を実験用ウサギに移植し、その進化を6ヵ月間追いかけた。このアッセイの結果は、適切な生体適合性レベルを示し、炎症または完全はまったく存在せず、良好な透明度を維持していることを示している。これらすべてのことから、組織工学によって作製した角膜産物は、実験的な薬理学および臨床の観点から有用である潜在能力をもつことを示唆している。
人工ヒト尿道産物を製造するプロトコル:
A.ヒト尿道サンプルを得ること
人工尿道を作製するために、正常な患者またはドナーの内視鏡検査によって得られた正常なヒト尿道の小さな生体組織を使用する。このサンプルを滅菌状態で得たら、真皮層が露出するまで、ハサミを用いて皮下脂肪組織を除去する。次いで、サンプルの汚染を可能な限り防ぐために、除去した組織を、抗生物質(ペニシリンG 500U/mlおよびストレプトマイシン500μg/ml)および抗真菌薬(アンホテリシンB 1.25μg/ml)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)から作られた滅菌輸送媒体にすぐに入れた。
輸送期間の後に、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB(それぞれ、500U/ml、500μg/ml、1.25μg/ml)を含む滅菌PBS溶液ですべてのサンプルを2回洗浄し、サンプルに付着しているかもしれない血液、フィブリン、脂肪または外来物質をすべて除去しなければならない。
1−細胞外のフィブリンおよびアガロースの基質を用い、その中に線維芽細胞を浸して間質代替物を作製する。これらの間質代替物を、細胞培養ペトリ皿の上で直接作製する。間質代替物10mlを以下の様式で製造する。
−献血によって、ヒト血漿7.6mLを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト皮膚線維芽細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに分散させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
−細胞培養ペトリ皿に、可能な限り等分する。
−これを少なくとも30分間休ませ、重合させる。
(1)人工ヒト尿道産物の顕微鏡分析(組織学的品質制御)(図5A)。
人工尿道サンプルの評価から、これらのサンプルの構造は、正常な天然のヒト尿道と非常によく似ていることがわかった。特定的には、培養物中に4週間維持されたサンプルの分析から、人工間質の表面に層状の扁平上皮が生成し、線維を多く含む密度の大きな間質を生成することがわかり、間質細胞は、活発に増殖することがわかった。これらすべてのことから、人工尿道の構造は、正常な天然の尿道の構造と同じであった。
正常な尿道コントロールと、実験室で得た人工尿道産物について、サイトケラチン発現の分析から、人工尿道上皮によるインテグリンの発現が示され、このことは、この上皮が完全な機能をもち、ヒト尿道を置換するのに使用可能であることを示唆している。
人工尿膀胱産物を製造するプロトコル:
A.ヒト膀胱サンプルを得ること
人工膀胱代替物を作製するために、正常な患者またはドナーの内視鏡検査によって得られた正常なヒト膀胱の小さな生体組織を使用する。このサンプルを滅菌状態で得たら、サンプルの汚染を可能な限り防ぐために、除去した組織を、抗生物質(ペニシリンG 500U/mlおよびストレプトマイシン500μg/ml)および抗真菌薬(アンホテリシンB 1.25μg/ml)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)から作られた滅菌輸送媒体にすぐに入れた。
輸送期間の後に、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB(それぞれ、500U/ml、500μg/ml、1.25μg/ml)を含む滅菌PBS溶液ですべてのサンプルを2回洗浄し、サンプルに付着しているかもしれない血液、フィブリン、脂肪または外来物質をすべて除去しなければならない。
1−細胞外のフィブリンおよびアガロースの基質を用い、その中に線維芽細胞を浸して間質代替物を作製する。これらの間質代替物を、細胞培養ペトリ皿の上で直接作製する。間質代替物10mlを以下の様式で製造する。
−献血によって、ヒト血漿7.6mLを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト皮膚線維芽細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに溶解させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
−細胞培養ペトリ皿でできる限りすばやく等分する。
−これを少なくとも30分間休ませ、重合させる。
(1)人工ヒト膀胱産物の顕微鏡分析および免疫組織化学的分析(組織学的品質制御)(図6Aおよび6B)。
人工膀胱産物の評価から、これらの構造は、正常な天然のヒト膀胱に非常によく似ていることがわかった。特定的には、培養物中に4週間維持されたサンプルの分析から、人工間質の表面に立方形または扁平状態の単層上皮が生成し、線維を多く含む密度の大きな間質を生成することがわかり、間質細胞は、活発に増殖することがわかった(図6A)。
人工ヒト口腔粘膜産物を製造するプロトコル:
A.初代上皮細胞および間質細胞を作製
上皮細胞(口腔粘膜上皮細胞)および間質細胞(線維芽細胞)の一次培養を確立するために、以下の方法およびプロトコルを用い、ヒトドナーまたは実験動物に由来する正常な口腔粘膜の試験組織を用いる。
−口腔粘膜の生体組織を得て、滅菌生理食塩水中で実験室に移す、
−標準的な酵素消化技術(上皮単離のために、トリプシンまたはディスパーゼ、間質単離のために、コラゲナーゼ)または標準的な組織移植技術を用い、上皮細胞および間質細胞を単離し、培養する、
−細胞がコンフルエンス状態になるまで、上皮細胞または間質細胞に特異的な培地中で培養する。
1−間質細胞が中に入った組織間質代替物を作製する。間質代替物20mlを製造するために、
a.−濃度が6.4mg/mlの液体コラーゲン濃縮物8.81mlを取ることによって、液体のI型コラーゲン10mlを製造する。10倍のPBS 1.1mlを加え、NaOH 約90μLを用い、pHを7.4±0.2に調節する。0.1〜1Mの濃度でのNaOHのpHを上げることが通常行われるが、他の生成物を用いてもよい。予定よりも早くゲル化してしまうのを防ぐために、穏やかに撹拌し、氷中で撹拌を維持することによって混合する。
b.−フィブリンおよびアガロースの混合物10mlを以下の様式で製造する。
−献血によって、ヒト血漿7.6mLを得る(自系由来でもよい)。
−あらかじめ培養しておいた150,000個のヒト皮膚線維芽細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−トラネキサム酸150μlを加え、フィブリンゲルの線維素溶解を防ぐ。
−1% ClCa2 1mlを加え、凝固反応を誘発させ、フィブリン線維網を作製する。
−PBSに分散させた2%VII型アガロース0.5mlをすばやく加え、融点に達するまで加熱し、撹拌によって穏やかに混合する。混合物中の最終アガロース濃度は、0.1%であろう。生存能力のある真皮産物を可能にするアガロース濃度範囲は、0.025%〜0.3%であり、使用する患者の目的と関連して達成されなければならない。
c.−作製する生成物に依存して、両溶液(コラーゲン溶液およびフィブリン−アガロース溶液)を種々の比率で混合する。すべての場合において、混合のときまでコラーゲン溶液を冷やしておき、両溶液はできるだけすばやく混合する。
−コラーゲン溶液10mlと、フィブリン−アガロース溶液10mlとを加え、生成物A(コラーゲン2.8g/L、フィブリン1.25g/L、アガロース0.5g/L)を作製する。
−コラーゲン溶液15mlと、フィブリン−アガロース溶液5mlとを加え、生成物B(コラーゲン3.8g/L、フィブリン0.6g/L、アガロース0.25g/L)を作製する。
−コラーゲン溶液5mlと、フィブリン−アガロース溶液15mlとを加え、生成物C(コラーゲン1.9g/L、フィブリン1.9g/L、アガロース0.75g/L)を作製する。
d.−多孔性細胞培養挿入物またはペトリ皿に、可能な限り等分する。
e.−これを37℃のインキュベーターで少なくとも30分間休ませ、重合させる。
2−間質代替物の上にある口腔粘膜上皮細胞を継代培養することによる、間質代替物の表面にある上皮層の成長。上皮細胞に特異的な培地で覆う。
3−標準的な細胞培養プロトコルにしたがって、37℃のインキュベーター中、高湿環境下、5% CO2を含む状態で維持する。上皮細胞が、間質代替物の表面でコンフルエンス状態に達するまで、培地を3日ごとに新しいものに換える(約1週間)。
4−間質代替物を培地の中に沈めたままで、上皮表面を空気にさらし(空気−液体技術)、上皮層形成および成熟を促す(約1週間)。
5−培養物表面から人工ヒト皮膚産物を除去し、平坦な滅菌ガラス表面に置かれた、厚みが3〜5mmの滅菌濾紙の上に置くことによって、部分的に脱水する。70%アルコールで滅菌したナイロンから作られた多孔性のチュール片または布を、皮膚代替物の表面に置き、皮膚代替物の上皮層が濾紙に付着するのを防ぐ。この後に、第2の厚みが3〜5mmの滅菌濾紙を、この布地で覆われた皮膚代替物の上に置く。その表面に平坦な滅菌ガラス片を置き、約250gの重さの物体を後者の上に置く(図1)。すべてのプロセスは、ラミナ―フローフード中、室温、10分間で行わなければならない。このプロセスの目的は、最適なコンシステンシーおよび弾性のレベルにするため、生成物の水分濃度をかなり減らすことである。
6−組織を脱水したら、測定するために切断し、モノフィラメント縫合糸を用いることによって、望ましい形態を与える。組織を脱水すると、適切なコンシステンシーおよび弾性のレベルが得られ、これによって、なんら困難なく縫合することができる。
1−間質細胞が中に入った組織間質代替物を作製する。間質代替物20mlを製造するために、
−濃度が6.4mg/mlの液体コラーゲン濃縮物17.62mlを取ること;10倍のPBS1.45mlを加え、NaOHを約180μL用い、pHを7.4±0.2に調節すること。0.1〜1Mの濃度でのNaOHのpHを上げることが通常行われるが、他の生成物を用いてもよい。予定よりも早くゲル化してしまうのを防ぐために、穏やかに撹拌し、氷中で撹拌を維持することによって混合する。
−あらかじめ培養しておいた150,000個の間質細胞を加え、DMEM培地750μlに再懸濁させる。
−多孔性細胞培養挿入物またはペトリ皿に、可能な限り等分する。
−これを37℃のインキュベーターで少なくとも30分間休ませ、重合させる。
2−間質代替物の上にある口腔粘膜上皮細胞を継代培養することによる、間質代替物の表面にある上皮層の成長。上皮細胞に特異的な培地で覆う。
3−標準的な細胞培養プロトコルにしたがって、37℃のインキュベーター中、高湿環境下、5% CO2を含む状態で維持する。上皮細胞が、間質代替物の表面でコンフルエンス状態に達するまで、培地を3日ごとに新しいものに換える(約1週間)。
4−間質代替物を培地の中に沈めたままで、上皮表面を空気にさらし(空気−液体技術)、上皮層形成および成熟を促す(約1週間)。
5−培養物表面から人工ヒト皮膚産物を除去し、平坦な滅菌ガラス表面に置かれた、厚みが3〜5mmの滅菌濾紙の上に置くことによって、部分的に脱水する。70%アルコールで滅菌したナイロンから作られた多孔性のチュール片または布を、皮膚代替物の表面に置き、皮膚代替物の上皮層が濾紙に付着するのを防ぐ。この後に、第2の厚みが3〜5mmの滅菌濾紙を、この布地で覆われた皮膚代替物の上に置く。その表面に平坦な滅菌ガラス片を置き、約250gの重さの物体を後者の上に置く(図1)。すべてのプロセスは、ラミナ―フローフード中、室温、10分間で行わなければならない。
6−組織を脱水したら、測定するために切断し、モノフィラメント縫合糸を用いることによって、望ましい形態を与える。
上のプロトコルにしたがって得られた産物を評価した。製造したそれぞれの産物のフィブリン、アガロース、コラーゲンの濃度を以下に示す。
A.−フィブリン(1.25g/L)、アガロース(0.5g/L)、コラーゲン(2.8g/L)。
B.−フィブリン(0.6g/L)、アガロース(0.25g/L)、コラーゲン(3.8g/L)。
C.−フィブリン(1.9g/L)、アガロース(0.75g/L)、コラーゲン(1.9g/L)。
D.−フィブリン(0g/L)、アガロース(0g/L)、コラーゲン(5.6g/L)。
顕微鏡分析から、組織工学を用いて作製した人工組織は、コントロールとして使用した天然の組織と構造的に似ていることがわかった。特定的には、間質細胞の間に、多くの線維で構成された間質がみられ、このことは、適切な細胞増殖レベルであることを示す。すでに記載した他のモデルと比較して(特に、フィブリンモデル、アガロースを含むフィブリンモデル)、フィブリン、アガロース、コラーゲンの組織は、間質レベルで原線維の密度が大きい。これらすべてのことから、上述のプロトコルに基づいて構築された組織産物は、正常な天然ヒト組織と適合性であることを示唆している。
上述のプロトコルに基づいて構築された組織産物の生物力学特性をレオメーターによって分析する。結果を図7Cに示し、この結果から、最もよい組織は、生成物Aであり、Cがそれに続き、Bは、D(コラーゲンのみ)と非常に似ていることがわかる。したがって、分析結果から、コラーゲン濃度を高めることによって、人工コラーゲン組織で示される値よりも粘弾性挙動が向上し、限界応力が大きくなることが示された。
ナノ構造化技術を適用すると、このプロセスを受けた生体材料の構造および挙動を実質的に変えることができる。0.1%フィブリンおよびアガロース生体材料(この特許出願の最終的な好ましい濃度)に対するナノ構造化の主な効果は、以下のとおりである。
−組織の生物力学特性が顕著に向上。これにより、ナノ構造の組織を操作することができ、生体材料のレオロジー特性をかなり大きく、予測できないレベルで向上させる。図8に示されるように、限界応力は、ナノ構造の組織は、非ナノ構造の組織に比べ、3.8倍大きかった(それぞれ、16.2パスカル、4.23パスカル)。一方、ナノ構造化を受けたサンプルの粘性係数G”は、非ナノ構造のサンプルと比べ、5.26倍大きかった(それぞれ、19.3Pa、3.67Pa)(図9)。これらのデータは、ナノ構造の生体材料の耐性は、非ナノ構造の組織の耐性よりもかなり大きいことを示す。
Claims (40)
- 人工組織を製造するためのインビトロで行われる方法であって、
(a)フィブリノゲンを含む組成物を、単離された細胞のサンプルに加える工程と、
(b)工程(a)から得られた生成物に抗線維素溶解薬を加える工程と、
(c)工程(b)から得られた生成物に、少なくとも1つの凝固因子、カルシウム源、トロンビン、またはこれらの任意の組み合わせを加える工程と、
(d)工程(c)から得られた生成物に多糖組成物を加える工程と、
(e)工程(d)から得られた生成物の内部または表面で、単離された細胞を培養する工程と、そして
(f)工程(e)から得られた生成物のナノ構造化を誘発する工程と
を含んでなる、方法。 - 前記工程(a)の細胞が、線維芽細胞または有角赤血球である、請求項1に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が、口腔粘膜、腹壁、皮膚、膀胱、尿道または角膜を含んでなる群から選択される組織または臓器の間質に由来するものである、請求項2に記載の方法。
- 前記工程(a)のフィブリノゲンを含む組成物が、血漿である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血漿が、自己の血漿である、請求項4に記載の方法。
- 前記工程(b)の抗線維素溶解薬がトラネキサム酸である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(c)のカルシウム源がカルシウム塩である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(c)のカルシウム塩が塩化カルシウムである、請求項7に記載の方法。
- 前記工程(d)の多糖がアガロースである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アガロースがVII型アガロースである、請求項9に記載の方法。
- 工程(b)と(c)の間に、タンパク質を加える工程(工程b2)をさらに含んでなる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b2)で加えられる前記タンパク質がフィブロネクチンである、請求項11に記載の方法。
- 工程(d)と(e)の間に、工程(d)から得られた生成物に、タンパク質を含んでなる組成物を加えることを含んでなる工程(d2)を含んでなる、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(d2)で加えられる前記タンパク質がコラーゲンである、請求項13に記載の方法。
- 前記コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項14に記載の方法。
- 工程(e)の前記細胞が、臍帯血の幹細胞を含んでなるものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(e)の前記細胞が上皮細胞を含んでなるものである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(e)の前記上皮細胞が、角化細胞、尿路上皮細胞、尿道上皮細胞、角膜上皮細胞または口腔粘膜上皮細胞を含んでなる群から選択されるものである、請求項17に記載の方法。
- 工程(a)の前記細胞および/または工程(e)の前記細胞が自己細胞である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(f)のナノ構造化誘発が、工程(e)から得られた生成物の脱水および/または機械的圧縮を含むものである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(e)から得られた生成物の脱水が、水切り、エバポレーション、吸引、毛細管圧、浸透または電気浸透から選択される方法を含むものである、請求項20に記載の方法。
- 毛細管圧による、工程(e)から得られた生成物の脱水が、工程(e)から得られた生成物に吸収材料を適用することを含むものである、請求項21に記載の方法。
- 工程(f)の機械的圧縮が、静荷重の適用、水圧の適用、カムの適用、1つ以上のローラーの適用、バルーンの適用、押出または遠心分離から選択される方法を含むものである、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(f)の静荷重の適用が、工程(e)から得られた生成物に重りを置くことを含むものである、請求項23に記載の方法。
- 工程(e)と工程(f)の間に、工程(e)から得られた生成物を空気にさらす追加の工程が存在する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる人工組織。
- 医薬品および/または化学生成物を評価するための、請求項26に記載の人工組織の使用。
- 医療における、請求項26に記載の人工組織の使用。
- 病変または損傷した組織または臓器の機能活性を部分的にまたは完全に高め、回復させ、または置き換える薬剤を製造するための、請求項26に記載の人工組織の使用。
- 損傷した組織または臓器が、皮膚、膀胱、尿道、角膜、粘膜、結膜、腹壁、結膜、鼓膜、咽頭、喉頭、腸、腹膜、靭帯、腱、骨、髄膜または膣を含んでなる群から選択されるものである、請求項29に記載の使用。
- 皮膚が、創傷、潰瘍、熱傷、良性もしくは悪性の新生物、感染、打撲、外傷性傷害、苛性化または先天性奇形を含んでなる群から選択される機能不全、損傷または疾患の結果として病変しているか、または損傷している、請求項30に記載の使用。
- 膀胱が、良性もしくは悪性の新生物、感染、外傷性傷害、先天性奇形、神経因性膀胱、尿失禁、膀胱機能不全、感染または膀胱結石を含んでなる群から選択される機能不全、損傷または疾患の結果として病変しているか、または損傷している、請求項30に記載の使用。
- 尿道が、良性もしくは悪性の新生物、感染、外傷性傷害、先天性奇形または狭窄を含んでなる群から選択される機能不全、損傷または疾患の結果として病変しているか、または損傷している、請求項30に記載の使用。
- 角膜が、角膜潰瘍、円錐角膜、球状角膜、デスメ膜瘤、外傷性傷害、苛性化、大脳辺縁系の欠損、萎縮性角膜炎、角膜ジストロフィー、原発性もしくは続発性の角膜症、感染、白斑、水疱性角膜症、角膜内皮の傷害、または良性もしくは悪性の新生物を含んでなる群から選択される機能不全、損傷または疾患の結果として病変しているか、または損傷している、請求項30に記載の使用。
- 粘膜が、創傷、潰瘍、熱傷、良性もしくは悪性の新生物、感染、打撲、外傷性傷害、苛性化、先天性奇形、実質欠損または歯周疾患を含んでなる群から選択される機能不全、損傷または疾患の結果として病変しているか、または損傷している、請求項30に記載の人工組織の使用。
- 粘膜が口腔粘膜である、請求項35に記載の使用。
- 組織が、工程(d2)を用いて得られたものである、請求項35または36に記載の使用。
- 請求項26に記載の人工組織を含んでなる医薬組成物。
- 医薬的に許容されるキャリアをさらに含んでなる、請求項38に記載の医薬組成物。
- 別の活性成分をさらに含んでなる、請求項38または39のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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