TR201809713T4 - Agaroz-fibrin biyomalzemelerini kullanarak doku mühendisliğiyle yapay doku üretimi. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, biyotıp alanına ve özellikle doku mühendisliği alanına girmektedir. Özellikle bir yapay dokunun hazırlanmasına yönelik bir in vitro yöntemle, söz konusu yöntemle elde edilebilen yapay dokuyla ve bir hasarlı doku veya organın fonksiyonel aktivitesini kısmen veya tamamen artırmak, restore etmek veya değiştirmek için bu yapay dokunun kullanımıyla ilgilidir.

Description

Tarifname ve istemler boyunca “içermektedir” kelimesi ve degisik biçimleri, diger teknik özellikleri, katki maddelerini, bilesenleri veya adimlari hariç tutmayi amaçlamamaktadir.

Alanda uzman kisiler için bulusun diger amaçlari, avantajlari ve özellikleri kismen tarifnameden kismen de bulusun uygulamasindan anlasilacaktir. Asagidaki örnekler ve sekiller açiklama amaciyla saglanmis olup, mevcut bulusu sinirlandirmayi amaçlamamaktadir. Örnekler Bu patent belgesinde saglanan asagidaki spesifik örnekler, mevcut bulusun yapisini açiklamaya yaramaktadir. Bu örnekler yalnizca açiklama amaciyla verilmistir ve burada istenen bulusu sinirlandirdiklari seklinde yorumlanmamalidir. Bu nedenle asagida açiklanan örnekler bulusu uygulama alanini sinirlandirmadan açiklamaktadir. Örnek 1. Bir yapay insan cildi ürününün hazirlanmasina yönelik protokol A.-Insan cildi numunelerinin elde edilmesi.

Lokal ve Iokorejyonel anestezi kapsaminda donörlerden elde edilen tam kalinlikta cilt numuneleri kullanilmaktadir. Numune steril olarak elde edildikten sonra subkutan yag dokusu, dermis tabakasi açiga çikana kadar makaslar yardimiyla uzaklastirilacaktir.

Ardindan çikarilan dokular, olasi bir numune kontaminasyonunu önlemek için antibiyotiklerle (500 U/ml penisilin G ve 500 pg/ml streptomisin) ve antimikotik ajanlarla (1.25 ug/ml amfoterisin B) takviye edilmis Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyerinden (DMEM) üretilen bir steril nakil besiyerine derhal aktarilacaktir.

B.- Primer fibroblast ve keratinosit kültürlerinin olusturulmasi.

Nakil döneminden sonra tüm numuneler, numunelere yapismis olabilecek tüm kan, fibrin, yag veya yabanci malzeme kalintilarini uzaklastirmak için penisilin, streptomisin ve amfoterisin B (sirasiyla 500 U/ml, 500 pg/ml ve 1.25 pg/ml) içeren bir steril PBS çözeltisinde iki kez yikanmak zorundadir. Öncelikle dermisin epidermisten ayrilmasi için numuneler, PBS'de 2 mg/ml dispaz II içeren bir steril çözeltide 37°C'de inkübe edilmektedir. Epitelin dermise baglandigi bazal membran bu sekilde dagilmaktadir, dolayisiyla ardindan bir yandan epitel, diger yandan dermis mekanik olarak ayrilacaktir.

Ayrildiktan sonra epidermise karsilik gelen epitel, daha sonra bir tripsin-EDTA çözeltisinde inkübe edilmeleri için küçük fragmanlar elde edilene kadar makaslarla parçalara bölünmektedir. Bu epitel, bir tripsin-EDTA'ya batirilmis pipet yardimiyla önceden sterilize edilmis manyetik karistiriciyla bir cam siseye aktarilmaktadir. 2.5 ml tripsin-EDTA, bir karistiriciyla siseye katilmaktadir ve keratinositlerin epidermisten enzimatik olarak ayrilmasi için 10 dakika süreyle 37°C'de inkübe edilmektedir. Bu süreden sonra ayrilmis keratinositleri içeren tripsin, bir pipet yardimiyla ve epitel fragmanlari beraberinde getirmemeye çalisilarak 50 ml'lik bir konik boruya toplanmaktadir. Bu, %10 fetal bovin serumuyla takviye edilmis ve 1000 dev/dk'da 10 dakika süreyle santrifüjlenmis esit miktarda kültür besiyeriyle nötrlestirilmektedir.

Büyük miktarda ayrilmis keratinosit içeren elde edilen pelet, tercihen fibroblasta göre epitel hücre büyümesini destekleyen 2-3 ml keratinosit kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmektedir. Bu besiyer, 3 kisim glukoz bakimindan zengin DMEM besiyerinden ve bir kisim Ham F-12 besiyerinden olusmaktadir, tüm bunlar %10 fetal bovin serumla, antibiyotik-antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 ug/ml streptomisin ve 0.25 ug/ml amfoterisin B), 24 pg/ml adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmistir: 0.4 ug/ml hidrokortizon, 5 ug/ml insulin, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 1.3 ng/ml triiyodotironin ve 8 ng/ml kolera toksin.

Cildin dermisinin ekstrasellüler matriksini parçalamak ve söz konusu matrikste bulunan stromal fibroblastlari ayirmak için numuneler, 6 saat süreyle fetal bovin serumsuz DMEM kültür besiyerinde Clostridium histolyticum tip 1 kollajenazin 2 mg/ml steril çözeltisinde 37°C'de inkübe edilmek zorundadir. Bu çözelti, dermis kollajenini parçalayabilmekte ve stromal iibroblastlari serbest birakabilmektedir. Primer fibroblast kültürlerini elde etmek için dermisin parçalanmis stromal hücrelerini içeren parçalama çözeltisi 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmek zorundadir ve fibroblastlara karsilik gelen hücre peleti 15 cm2 yüzey alani olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Antibiyotikler ve antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 ug/ml streptomisin ve takviye edilmis glukoz bakimindan zengin DMEM kültür besiyeri olarak kullanilmaktadir. Bu bazik kültür besiyeri, fibroblast besiyeri olarak adlandirilmaktadir.

Her halükarda hücreler standart hücre kültür kosullarinda %5 karbondioksitle 37°C'de inkübe edilecektir. Kültür besiyeri her üç günde bir yenilenmektedir.

C.- Primer cilt kültürlerinden gelen hücrelerin alt kültürlenmesi.

Hücre konflüansina ulasildiktan sonra farkli fibroblast veya keratinosit hücre kültürleri steril PBS ile yikanmak ve 10 dakika süreyle 37°C'de 0.5 g/I tripsin ve 0.2 g/I EDTA çözeltisinin 1-3 ml'si ile inkübe edilmek zorundadir. Bu nedenle hücre yapisma mekanizmalari parçalara ayrilmaktadir ve keratinosit ve dermis kültür sisesi yüzeyine yapismamis ayri hücreler elde edilmektedir.

Dermis açisindan hücreler kültür siselerinin yüzeyinden söküldükten sonra kullanilan tripsin 10 ml fibroblast kültür besiyeri katilarak etkisiz hale getirilmektedir. Bol serum protein varligi, tripsinin proteolitik etkisini etkisiz hale getirebilmektedir. Keratinosit kültür besiyeri, keratinostilerde kullanilmaktadir.

Sökülen hücrelerin bulundugu keratinosit ve fibroblast çözeltileri daha sonra bir hücre peleti ya da Ilgi duyulan hücrelerle bir hücre kümesi elde etmek için 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmektedir, tripsin içeren süpernatant atilmaktadir. Hücre peleti 5 ml kültür ortaminda özenle yeniden süspansiyon haline getirilmekte ve bu hücreler yüzey alani 15, 25 veya 75 cm2 olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Keratinosit kültürleri normalde yeni kültür siselerinde yaklasik bes kereye kadar genisletilmektedir.

Her halükarda ve yeterli hücre viyabilitesi saglamak için dört ilk alt kültüre karsilik gelen hücreler kullanilarak cilt replasmanlari hazirlanmistir.

D.- Doku mühendisligi yoluyla fibrin ve agaroz bazli yapay insan cildi ürünlerinin yapilmasi 1- Ekstrasellüler fibrin ve agaroz matriksleri kullanarak içine batirilmis fibroblastlarla dermis replasmanlari üretme. Bu dermal replasmanlar, besin maddelerinin geçmesine imkân vermek ancak hücrelerin geçmesine imkân vermemek için dogrudan 0.4 um çapli gözenekli sistemlerde üretilecektir. 10 ml dermal replasman asagidaki sekilde hazirlanacaktir: o bagislardan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde o önceden kültürlenmis ve 750 i.il DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 insan cildi fibroblastini ekleme. o fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 pl traneksamik asit ekleme. o koagülasyon reaksiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml %1 CICaz ekleme. o PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yi hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu %0.1 olacaktir.

Canli dermal ürünlere imkân veren agaroz konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. 0 gözenekli hücre kültürü sistemlerinde olabildigince bölüntüleme. o en az 30 dakika süreyle dinlenirken polimerize olmaya birakma. 2- Dermal replasmandaki keratinositlerin alt kültürlenmesiyle dermal replasman yüzeyinde bir epitel tabaka (epidermis) gelistirme. Keratinositler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 COZ ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreleri dermal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Epidermal katmanlasmasi ve olgunlasmasini (yaklasik bir hafta) tesvik etmek için dermal replasmani kültür besiyerine batirilmis halde tutarken epitel yüzeyi havaya (hava-sivi teknigi) maruz birakma.

- Yapay insan cildi ürününü kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, cilt replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için cilt replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli cilt replasmani üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir laminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. Bu prosesin amaci, optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir.

Yapay insan cildi ürününün degerlendirilmesi (Sekil 2): 1) Yapay insan cildi ürününün mikroskopik analizi (histolojik kalite kontrolü).

Yapay cilt ürünü degerlendirmesi, yapilarinin normal natif insan cildine çok benzer oldugunu ortaya koymustur, bununla birlikte kültürde gelisme süresi bu yapay ürünlerin yapisini dogrudan etkilemistir. Özellikle dört hafta süreyle kültürde tutulan numunelerin analizi asagidakileri ortaya koymustur: in vitro degerlendirme (Sekil 2A): Hazirlandiktan sonra haftada bir degerlendirilen cilt ürünlerinin, yogun bir çogalan fibroblast popülasyonu olan bir kalin stromal tabakasi olmustur. Bu stromal replasmanin yüzeyinde tek bir epitel hücre tabakasi ortaya çikmistir.

Kültürde gelistirmenin ikinci haftasinda, stromada çok sayida hücre ve ilk epitel katmanlasmasi gözlemlenmistir ve bir veya iki sira keratinosit yüzeyinde olusmustur.

Bu andan itibaren keratinosit çogalmasi devam etmektedir ve üçüncü haftada epitelde yeni bir hücre sirasi gözlemlenmistir.

Dördüncü haftada toplam 3-4 hücre sirasi olusmustur ancak farkli epitel tabakasinin ayirt edilmesi mümkün olmamistir. Papil, kutanöz apendaj veya i/I'i/odegerlendirme (Sekil 28): Kültürde tutulan yapay cilt ürünlerinde gözlemlenenden farkli olarak, bir hayvan modeline implante edilen yapay cildin asagida açiklandigi gibi çok yeterli doku yapilandirma ve farklilasma seviyeleri olmustur. Ürünün fareye implante edilmesinden sonraki onuncu günde, hücre bakimindan çok zengin olan ve düzensiz ekstrasellüler lifler ve malzemelerle bir dermis varligi gözlemlenebilmistir. Dermiste lökosit infiltratlarinin olmasi ve arteriyolleri, venülleri ve kapillerleri içeren önemli bir vasküler dokunun neoformasyonu vurgulanmak zorundadir. Epitel seviyede üç ila bes arasi hücre tabakasi gözlemlenmektedir, stratum spinosum ve stratum granulosum açikça görülmemistir, bununla birlikte bazal ve yeni baslayan stratum corneum açikça görülmüstür. Benzer sekilde, papil veya kutanöz apendaj olmamakla birlikte bir homojen dermoepidermal çizgi görülmektedir.

. Atimik hayvanlara implantasyondan yirmi gün sonra dermis fibroblast ve Iökosit konsantrasyonunda bir azalma ve dermis fibril içeriginin önemli bir artisi görülmüstür. Dört ila alti arasi epidermal keratinosit tabakasinin varligi da gözlemlenmistir, bu sefer dört farkli tabaka ayirt edilmistir: bazal, spinosum, granulosum ve corneum, stratum spinosum dördü arasinda en az bariz olanidir.

Benzer sekilde, evrimin onuncu gününde, papil veya kutanöz apendaj olmamakla birlikte bir homojen dermoepidermal çizgi görülmektedir.

. Otuzuncu günün örneginde önceki günlerden daha büyük bir dermis fibril içerigi gözlemlenmistir, büyük miktarda epitel tabaka görülmüstür, net bir epitel tabaka farklilasmasiyla (bazal, spinosum, granulosum ve corneum) alti ila dokuz arasi keratinosit tabakasi olusmustur. Papil veya kutanöz apendaj da görülmemistir.

. In Viva evrimin kirkinci gününde, dermal stratumda daha büyük bir lif içerigi gözlemlenmistir ve epitel keratinosit tabaka sayisi (alti ila dokuz arasi) tesis edilmistir. Dermoepidermal bileskesinde papil veya kutanöz apendaj bariz olmamistir. 2) Yapay insan cildi ürününün immünohistokimyasal analizi (Sekil 2C).

Normal insan cildi kontrollerinin sitokeratinlerinin (pansitokeratin, sitokeratin 1 ve sitokeratin 10), filaggrinin ve involukrinin ekpresyonunun analizi ve laboratuvarda elde edilen cilt ürünleri, her bir numune tipi için bu proteinlerin ekspresyonunun özel bir desenini belirlemeye imkân vererek yapay insan cildinin, normal insan cildiyle ayni yüzey proteinlerini eksprese edebildigini göstermistir.

Ornek 2. Wharton jölesi kök hücreleri kullanilarak bir yapa! insan cildi ürünü hazirlama A.-Cilt ve insan göbek bagi numunelerinin elde edilmesi.

Lokal ve Iokorejyonel anestezi kapsaminda donörlerden elde edilen tam kalinlikta cilt numuneleri kullanilmaktadir. Numune steril olarak elde edildikten sonra subkutan yag dokusu, dermis tabakasi açiga çikana kadar makaslar yardimiyla uzaklastirilacaktir.

Ardindan çikarilan dokular, olasi bir numune kontaminasyonunu önlemek için antibiyotiklerle (500 U/ml penisilin G ve 500 pg/ml streptomisin) ve antimikotik ajanlarla (1.25 pg/ml amfoterisin B) takviye edilmis Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyerinden (DMEM) üretilen bir steril nakil besiyerine derhal aktarilacaktir.

Kullanilan göbek baglari, normal süreli gebeliklerin sezaryenle dogumlarindan elde edilmektedir. Her dogumdan sonra göbek baginin 10-15 cm uzunlugunda bir fragmani elde edilerek, cilt için kullanilana benzer bir nakil besiyerinde derhal Iaboratuvara tasinmaktadir.

B.- Wharton jölesi kök hücre kültürleri kullanilarak primer fibroblast üretilmesi.

Nakil döneminden sonra tüm numuneler, numunelere yapismis olabilecek tüm kan, fibrin, yag veya yabanci malzeme kalintilarini uzaklastirmak için penisilin, streptomisin ve amfoterisin B (sirasiyla 500 U/ml, 500 ug/ml ve 1.25 pg/ml) içeren bir steril PBS çözeltisinde iki kez yikanmak zorundadir. Ardindan her numune tipi bagimsiz olarak isleme koyulmaktadir: . Cilt durumunda, dermis öncelikle PBS'de 2 mg/ml dispaz II içeren bir steril çözeltide 37°C'de inkübe edilerek epidermisten ayrilmaktadir. Epitelin dermise baglandigi bazal membran bu sekilde dagilmaktadir, dolayisiyla ardindan bir yandan epitel, diger yandan dermis mekanik olarak ayrilacaktir.

Cildin dermisinin ekstrasellüler matriksini parçalamak ve söz konusu matrikste bulunan stromal fibroblastlari ayirmak için numuneler, 6 saat süreyle fetal bovin serumsuz DMEM kültür besiyerinde Clostridium histolyticum tip I kollajenazin 2 mg/ml steril çözeltisinde 37°C'de inkübe edilmek zorundadir. Bu çözelti, dermis kollajenini parçalayabilmekte ve stromal Fibroblastlari serbest birakabilmektedir. Primer fibroblast kültürlerini elde etmek için dermisin parçalanmis stromal hücrelerini içeren parçalama çözeltisi 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmek zorundadir ve fibroblastlara karsilik gelen hücre peleti 15 cm2 yüzey alani olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Antibiyotikler ve antimikotik ajanlarla (100 U/mI penisilin G, 100 pg/ml streptomisin ve takviye edilmis glukoz bakimindan zengin DMEM kültür besiyeri olarak kullanilmaktadir. Bu bazik kültür besiyeri, fibroblast besiyeri olarak adlandirilmaktadir.

. Göbek bagi durumunda numuneler umbilikal venden boyuna kesitlere ayrilmaktadir. Arterler ve umbilikal ven, Wharton jölesinin ayrilmasi için özenle uzaklastirilmaktadir. Daha sonra jöle, çok küçük doku fragmanlari haline gelene kadar fragmanlanmaktadir. Bu Wharton jölesi fragmanlari, daha sonra ayrilan hücrelerin 1050 dev/dk'da 7 dakika süreyle santrifüjlenmesiyle toplanmasi için yaklasik 4-6 saat süreyle karistirma altinda 37°C 30 ml tip I kollajenezde (Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe, Almanya) inkübe edilmektedir. Ardindan süpernatant özenle uzaklastirilmaktadir ve hücre peleti 5-10 ml önceden seyreltilmis tripsinde (Sigma-Aldrich) yeniden süspansiyon haline getirilmektedir. Tekrar bir çalkalama küvetinde 30 dakika süreyle 37°C'de inkübe edilmektedir. Bunun üzerine tripsinin etkileri %10 fetal bovin serumuyla takviye edilmis 10-20 ml kültür besiyeri eklenmesiyle nötrlestirilmektedir, izole edilmis hücrelerin elde edilmesi için 10 dakika süreyle 1000 dev/dk hizla tekrar santrifüjlenmektedir. Bu hücreler, bir 25 cm2 kültür sisesinde Amniomax kültür besiyerinde son kez süspansiyon haline getirilmektedir.

Her halükarda hücreler standart hücre kültür kosullarinda %5 karbondioksitle 37°C'de inkübe edilecektir. Kültür besiyeri her üç günde bir yenilenmektedir. C.- Primer cilt kültürlerinden ve Wharton jölesi kök hücre kültürlerinden elde edilen hücrelerin alt kültürlenmesi.

Hücre konflüansina ulasildiktan sonra farkli fibroblast kültürleri veya Wharton jölesi kök hücre kültürleri steril PBS ile yikanmak ve 10 dakika süreyle 37°C'de 0.5 g/I tripsin ve 0.2 g/l EDTA çözeltisinin 1-3 ml'si ile inkübe edilmek zorundadir.

Bu nedenle hücre yapisma mekanizmalari parçalara ayrilmaktadir ve kültür sisesi yüzeyine yapismamis ayri hücreler elde edilmektedir.

Hücreler kültür siselerinin yüzeyinden söküldükten sonra kullanilan tripsin 10 ml fibroblast kültür besiyeri katilarak etkisiz hale getirilmektedir. Bol serum protein varligi, tripsinin proteolitik etkisini etkisiz hale getirebilmektedir.

Sökülen hücrelerin bulundugu çözeltiler daha sonra bir hücre peleti ya da ilgi duyulan hücrelerle bir hücre kümesi elde etmek için 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmektedir, tripsin içeren süpernatant atilmaktadir. Hücre peleti 5 ml kültür ortaminda özenle yeniden süspansiyon haline getirilmekte ve bu hücreler yüzey alani , 25 veya 75 cm2 olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Normalde keratinosit kültürleri yeni kültür siselerinde yaklasik bes kereye kadar genisletilmektedir. D.- Doku mühendisligi yoluyla fibrin ve agaroz bazli yapay insan cildinin yapilmasi 1- Ekstrasellüler fibrin ve agaroz matriksleri kullanarak içine batirilmis fibroblastlarla dermis replasmanlari üretme. Bu dermal replasmanlar, besin maddelerinin geçmesine imkân vermek ancak hücrelerin geçmesine imkân vermemek için dogrudan 0.4 pm çapli gözenekli sistemlerde üretilecektir. 10 ml dermal replasman asagidaki sekilde hazirlanacaktir: o bagislardan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde o önceden kültürlenmis ve 750 pl DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 insan cilcli fibroblastini ekleme. o fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 pl traneksamik asit ekleme. o koagülasyon reaksiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml %1 CICaz ekleme. o PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yi hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu %0.1 olacaktir.

Canli dermal ürünlere imkân veren agaroz konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. 0 gözenekli hücre kültürü sistemlerinde olabildigince bölüntüleme. o en az 30 dakika süreyle dinlenirken polimerize olmaya birakma. 2- Dermal replasmandakî Wharton jölesi kök hücrelerinin alt kültürlenmesiyle dermal replasman yüzeyinde bir epitel tabaka gelistirilmesi. Keratinositler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. Bu besiyer, 3 kisim glukoz bakimindan zengin DMEM besiyerinden ve bir kisim Ham F-12 besiyerinden olusmaktadir, tüm bunlar %10 fetal bovin serumla, antibiyotik-antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 pg/ml streptomisin ve 0.25 pg/ml amfoterisin B), 24 ug/ml adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmistir: 0.4 ug/ml hidrokortizon, pg/ml insulin, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 1.3 ng/ml triiyodotironin ve 8 ng/ml kolera toksin. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 C02 ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreleri dermal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Yüzey tabakasi epitel katmanlasmasi ve olgunlasmasini (yaklasik bir hafta) tesvik etmek için dermal replasmani kültür besiyerine batirilmis halde tutarken epitel yüzeyi havaya (hava-sivi teknigi) maruz birakma.

- Yapay insan cildi ürününü kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, cilt replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için cilt replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli cilt replasmani üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir laminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. Bu prosesin amaci, optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir.

Wharton jölesi hücreleriyle yapay insan cildi ürününün degerlendirilmesi 1) Wharton jölesi kök hücrelerinin viyabilitesini belirleme (mikro analitik kalite kontrolü) (Sekil 3A).

Enerji dagitici x-ray mikro analiz teknikleri araciligiyla hücre viyabilitesinin belirlenmesi, intraselüler Na, Mg, P, Cl, K, S ve Ca iyon konsantrasyon profilinin belirlenmesine ve böylece daha sonra yapay dokularin yapilmasinda kullanilmasina en uygun olan alt kültürün bilinmesine imkân vermektedir. Bu amaçla asagidaki yöntembilimin gerçeklestirilmesi gerekmektedir. a) hücrelerin bir reçine tabakasiyla (pioloform) önceden kaplanmis altin suyla yikanmaktadir. b) hücrelerin sivi azotta dondurarak sabitlenmesi. c) dondurarak sabitlenmis numunelerin 20 saat süreyle düsük sicaklikta (- 100°C) vakumlu dondurarak kurutma teknigiyle kurutulmasi. Dondurarak kurutma bir Polaron E5300 donmali kurutucuda gerçeklestirilmektedir. d) dondurarak sabitlenmis ve kurutulmus numunelerin spesifik numune tutuculara monte edilmesi. e) hücrelerin bir Sputtering Polaron E-5000 cihazinda karbonla kaplanmasi. f) Enerji dagitici x-ray dedektörüyle (EDAX) ve retro-dagitimli elektron dedektörle donatilmis Philips XL-30 Tarama Elektron Mikroskobu kapsaminda gözlemleme. g) asagidaki sabitlerin kullanilmasiyla kalitatif mikro analitik analiz: 10 Kv voltaj, süresi: 200 saniye. Her çalisilan hücre için kalitatif spektrum bu sekilde elde edilmektedir. Söz konusu spektrumda, K orbitallerindeki Na, Mg, P, CI, K, Ca seviyeleri seçilmektedir, saniye basina sayim (CPS), arka plan (BKGD) ve karakteristik olmayan radyasyonlar ve pik/arka plan (P/B) endeksi sayilmaktadir. h) kantitatif mikro analitik analiz. Na, Mg, P, Cl, 5, K ve Ca elementlerinin kuru agirliga göre mmol/Kg olarak yogunluklari öncelikle Hall yönteminin (Hall ve ark.,1973; Staham and Pawley, 1978) modifiye edilmesiyle belirlenmektedir. Bu amaçla %20 dekstranda (300,000 Dalton) çözünen Na, Mg, P, Cl, K, S ve Ca tuzlari kullanilmaktadir, bir standart egri veya çizgi elde edilmektedir. Bu tuzlar, analiz edilecek numunelerle ayni sekilde islemden geçmektedir. Analiz edilen elementlerin her birinin konsantrasyonu nihai olarak standart egrilerden lineer regresyon yöntemi kullanilarak hesaplanmaktadir.

Wharton jölesi kök hücrelerindeki iyon seviyelerinin belirlenmesinden sonra elde edilen sonuçlar, en yüksek K/Na indeks seviyelerinin dördüncü ve besinci alt kültürlere karsilik geldigi ve bu nedenle doku mühendisligi yoluyla insan cildinin üretilmesinde kullanilmak üzere en ideal seviyeler olarak görüldüklerini açikça göstermektedir. 2) Yapay insan cildi ürünlerinin mikroskopik analizi (histolojik kalite kontrolü) (Sekil BB).

Wharton jölesi hücreleriyle yapay insan cildi ürünlerinin degerlendirmesi, yapilarinin normal natif insan cildine çok benzer oldugunu ortaya koymustur, bununla birlikte kültürde gelisme süresi bu yapay dokularin yapisini dogrudan etkilemistir. Özellikle dört hafta süreyle kültürde tutulan numunelerin analizi, yapinin yüzeyinde 5'e varan epitel tabakanin progresif olusumunu ortaya koymustur, bununla birlikte interselüler bileskeler son fazlara kadar olusmamistir. Wharton jölesi kök hücreleriyle üretilen insan cildi ürünlerinin müteakip in V/'i/o degerlendirmesi, yapay stromada kalin bir epitel tabakanin gelistigini göstermistir ve pek çok dezmozom tipi interselüler bileske ve iyi yapilmis bir bazal membran olusmustur. Tüm bunlar, normal natif insan cildinden ayirt edilemeyen bir yapay cilt ürününe yol açarak olusturulan ürünün yararliligini ortaya koymustur. 3) Yapay insan cildi ürününün immünohistokimyasal analizi (Sekil 3C).

Normal insan ciIcII kontrollerine ait sitokeratinlerin (pansitokeratin, sitokeratin 1 ve sitokeratin 10), filaggrinin ve involukrinin ekpresyonunun analizi ve Wharton jölesi kök hücrelerinden laboratuvarda elde edilen cilt Ürünleri, her bir numune tipi için bu proteinlerin ekspresyonunun özel bir desenini belirlemeye imkân vererek yapay insan cildi ürünlerinin, normal insan cildiyle ayni yüzey proteinlerini eksprese edebildigini göstermistir. Örnek 3. Yapay kornea hazirlama.

Yapay kornea hazirlama protokolü: Asagida açiklanan protokol, insan ve hayvan korneal ürünlerine benzerdir ancak hayvan korneal ürünündeki endotel stratumun dâhil edilmesi hariç olmaktadir.

A. Primer korneal hücre kültürlerinin olusturulmasi. Uygun olan yerlerde primer korneal epitelin, stromal keratositin ve korneal endotel kültürlerin olusturulmasi Için asagidaki yöntem ve protokoller kullanilmistir: o Lokal veya genel anestezi altinda sklerokorneal Iimbustan biyopsi alinmasi ve steril fizyolojik salinde laboratuvara tasinmasi. 0 Göz bebegi, konjonktiva ve kan pihtisi kalintilarini uzaklastirmak için korneanin cerrahi olarak ovularak temizlenmesi. 0 Hayvan korneal ürününde endotel hücreler için besiyerde kültürlenen epitel hücreleri izole etmek için Descemet membraninin cerrahi olarak parçalara ayrilmasi. Bu besiyerin bilesimi asagidaki gibidir: 3 kisim DMEM besiyeri ve bir kisim Ham F-12 besiyeri, tüm bunlar %10 fetal bovine serumla, antibiyotikler-antimikotik ajanlar, 24 pg/ml adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmektedir. 0.4 pg/mI hidrokortizon, ug/ml insülin, 1.3 ng/ml triiyodotironin ve 8 ng/ml kolera toksin. o 2 mm santral korneanin parçalara ayrilmasi ve 6 saat süreyle 37°C'de antibiyotiklerle DMEM besiyerinde (Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyeri) kültürlenecek olan korneal stromanin (keratositler) yetiskin kök hücrelerini toplamak için 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjleme. o Sklerokorneal Iimbusun yaklasik 1 mm'lik küçük eksplantlar halinde bölünmesi ve bu eksplantlarin primer korneal epitel hücre kültürlerinin elde edilmesi için dogrudan kültür siselerinin yüzeyine kültürlenmesi.

Kullanilacak kültür besiyeri (epitel hücre besiyeri) 3 kisim DMEM besiyeri ve bir kisim Ham F-12 besiyerinden olusmaktadir ve tüm bunlar %10 fetal bovine serumla, antibiyotikler-antimikotik ajanlar, 24 ug/ml adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmektedir: 0.4 ug/ml hidrokortizon, 5 iJg/ml insulin, 1.3 ng/ml triiyodotironin, 8 ng/ml kolera toksin ve 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF).

Tüm kültürler, standart hücre kültürü protokollerini izleyerek nemli ortamda %5 C02 ile bir inkübatörde 37°C'de tutulmaktadir. Kültür besiyerleri, hücreler kültürde konflüansa ulasana kadar her 3 günde bir yenilenmektedir.

B. Laboratuvarda doku mühendisligi yoluyla korneal ürünlerin yapilmasi. 1- Önceden izole edilmis endotel hücrelerin alt kültürlenmesi ve bu amaçla besin maddelerinin geçisine imkân taniyan ancak hücrelerin geçisine izin vermeyen 0.4 i.im çapli gözenekli sistemlerin kullanilmasi. Seçilen hücreler dördüncü alt kültüre (maksimum endotel hücre viyabilitesi) ait olmak zorundadir. Bu ilk adim yalnizca üç katmanli hayvan korneal ürününü olusturmak için gerçeklestirilecektir. 2- 0.4 um çapli gözenekli sistemler üzerine ekstrasellüler fibrin ve agaroz matriksleri kullanilarak içine batirilmis olan keratositlerle korneal stroma replasmanlarinin üretilmesi (iki katmanli insan korneal ürünü durumunda bu, ilk adim olacaktir). 10 ml stroma replasmani hazirlamak için: . bagistan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde etme. . önceden kültürlenmis ve 750 ul DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 insan keratositini ekleme. . fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 ul traneksamik asit ekleme. . 500 mg/ml konsantrasyonda 10 pl fibronektin ekleme. Amaç, yüzey epitel hücrelerin stroma replasmanina yapismasini destekleyerek su anda gelistirilmis olan korneal ürünlerde var olan sökülme riskini ortadan kaldirmaktir. . koagülasyon reaksiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yî hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu %O.1 olacaktir. Canli dermal ürünlere imkân veren agaroz konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. gözenekli hücre kültürü sistemlerinde olabildigince bölüntüleme. en az 30 dakika süreyle dinlenirken polimerize olmaya birakma. 3- Korneal epitel hücrelerin stromal replasmanda alt kültürlenmesiyle korneal stroma replasmani yüzeyinde bir korneal epitel tabaka gelistirilmesi. Epitel hücreler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 4- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 COZ ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreler stromal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir.

- Korneal epitel katmanlasmasi ve olgunlasmasini (yaklasik bir hafta) tesvik etmek için stromal replasmani kültür besiyerine batirilmis halde tutarken epitel yüzeyi havaya (hava-sivi teknigi) maruz birakma. 6- Yapay insan kornea ürününü kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, korneal replasmanin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için korneal replasmanin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli korneal replasman üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir laminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. Bu prosesin amaci, optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir.

Korneal ürünlerin degerlendirilmesi (Sekil 4): 1) Korneal ürünlerin mikroskopik ve immünohistokimyasal analizi (histolojik kalite kontrolü) (Sekil 4A).

Mikroskopik analiz, doku mühendisligi yoluyla üretilen korneal ürünlerin kontrol olarak kullanilan natif kornealara yapisal olarak benzer oldugunu ortaya koymustur. Özellikle pek çok interselüler bileske ve aralarinda keratositleri içeren pek çok fibrin Iifinden olusan bir stroma ile iyi olusturulmus bir korneal epitel görülebilmistir. Tüm bunlar, yukarida açiklanan protokole dayali olarak yapilan iki katmanli veya üç katmanli yapay korneal ürünlerin, ortotopik insan ve hayvan kornealariyla uyumlu oldugunu ileri sürmektedir.

Korneal ürünlerin epitel yapisi açisindan tüm epitel hücrelerin tipik olarak yüksek seviyelerde sitokeratinler eksprese etmis oldugu ve korneal epitel (CK3 ve CKl 2) hariç oldugu vurgulanmalidir, bu da bu hücrelerin in vitro olarak islevsel olabilecegini ileri sürmektedir. Benzer sekilde interselüler baglarla ilgili proteinlerin analizi, farkli dezmozom bilesenlerinin (plakoglobin, desmoglein 3 ve dezmoplakin), siki bileskelerin (ZO-l ve ZO-2) ve bosluk iletisimli bileskelerin (konneksin 37) epitel seviyede sirali ekspresyonunu ortaya koymustur, tüm bunlar normal natif korneayla benzerdir. 2) Reolojik kalite kontrolü (Sekil 48).

Yukarida açiklanan protokole dayali olarak yürütülen iki katmanli veya üç katmanli yapay korneal ürünlerin mekanik özelliklerinin analizi, daha büyük agaroz içerigiyle ve agaroz daha düsük konsantrasyonlarda kullanildiginda önemli ölçüde daha düsük bir akma noktasiyla kornealarda artan elastiktik katsayilariyla söz konusu dokularin viskoelastik davranisini göstermistir. Viskozimetri ve akma noktasi analizleri, fibrin ve agaroz ürünlerinin fiziksel özelliklerinin yalnizca übrin veya kollajen içerenlerden daha büyük oldugunu ortaya koymustur. Tüm bunlar, fibrin ve agaroz kornealarinin fiziksel özelliklerinin optimum oldugunu ve kontrol olarak kullanilan normal Insan kornealarininkine kismen benzer oldugunu ileri sürmektedir. 3) Optik kalite kontrolü (Sekil 4C).

Yapay korneal ürünlerin optik özellikleri, insan veya hayvan korneasinin islevlerini yerine getirmek zorunda olan bir doku için uygun olmustur. Özellikle spektral iletim analizleri, korneal ürünlerin, çok benzer saçilim seviyeleriyle normal insan korneasininkilere kiyasla çok uygun seffaflik seviyeleri gösterme egiliminde oldugunu göstermistir. Ayrica fibrin ve agaroz ürünlerinin absorpsiyon, dispersiyon ve sönüm katsayilari, fibrin dokulariyla elde edilenlerden daha büyük olmustur. Öte yandan iki katmanli veya üç katmanli yapay korneal ürünlerde kisa dalga boylarinin emilimi (ultraviyole aralik) kontrollere göre daha az olmustur, bu da bu tip ürünlerde ultraviyole isik süzgeçlerinin kullanilmasi ihtiyacini Ileri sürmektedir. Genel olarak korneal ürünlerin yari seffafligi, özellikle kalinligi 0.7 mm'yi geçmeyen ürünlerde kabul edilebilir olmustur. 4) Genetik kalite kontrolü (Sekil 4C ve 4D).

Gen ekspresyon analizi için total RNA, insan epitel ve stromal keratosit hücrelerinin primer korneal kültürlerinden ve insan iki katmanli yapay korneal ürünlerinden ekstrakte edilmistir, sonraki mikrodizi araciligiyla analiz edilmistir (Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0®). Bu analiz, insan yapay korneal ürünlerinde eksprese edilmis olan genlerin normal korneal fonksiyonla uyumlu oldugunu göstermistir, bununla birlikte doku gelisimiyle ilgili olan pek çok gen, normal korneaya göre asiri eksprese edilmistir. Özellikle yapay korneal ürünler, fonksiyonu interselüler bileskeleri (konneksinler, integrinler, dezmoplakin, plakoglobin vb.), epitel gelisimi (Sema3A, RUNXZ, TBX1), hücre farklilasmasini (PLXNA4A, FLG, DKK4, DCN), bazal membrani (lamininler, kollajen IV), ekstrasellüler matriksi (kollajenler, dekorin, biglikan, MMP, fibronektin) vb. tesis etmede merkezi olan çok sayida gen eksprese etmistir. Bu sonuçlar, yapilan korneal ürünlerin normal korneada meydana gelene benzer bir gelisim prosesinden geçebilecegini ve bu ürünlerin eksprese ettigi gen fonksiyonlarinin normla uyumlu oldugunu ileri sürmektedir. 4) in Viva degerlendirme (Sekil 4E).

Yapay korneal ürünlerin klinik davranisini degerlendirmek için parsiyel kalinlikta 6 iki katmanli insan korneasi laboratuvar tavsanlarina implante edilmistir ve evrimleri 6 ay süreyle takip edilmistir. Bu testin sonuçlari, tam inflamasyon veya enfeksiyon yokluguyla, iyi seffaflik seviyelerini koruyan, uygun biyouyumluluk seviyeleri göstermektedir. Tüm bunlar, doku mühendisligiyle üretilen korneal ürünlerin bir deneysel farmakolojik ve klinik bakis açisindan potansiyel olarak yararli olabilecegini ileri sürmektedir.

Ornek 4. Bir yapay insan üretra ürünü hazirlama.

Bir yapay insan üretra ürünü hazirlama protokolü.

A.-Insan üretra numunelerinin elde edilmesi.

Yapay üretralar üretmek için normal hastalarin veya donörlerin endoskopisi yoluyla elde edilen normal insan üretrasinin küçük biyopsileri kullanilmaktadir. Numune steril olarak elde edildikten sonra çikarilan dokular, olasi bir numune kontaminasyonunu önlemek için antibiyotiklerle (500 U/ml penisilin G ve 500 pg/ml streptomisin) ve antimikotik ajanlarla (1.25 pg/ml amfoterisin B) takviye edilmis Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyerinden (DMEM) üretilen bir steril nakil besiyerine derhal aktarilacaktir.

Alternatif olarak insan üretra numunelerinin alinmasinin elverisli olmadigi durumlarda oral mukoza numuneleri veya cilt numuneleri üretra replasmanlari üretmek Için kullanilabilmektedir.

B.- Primer stromal ve epitel hücre kültürlerinin üretilmesi.

Nakil döneminden sonra tüm numuneler, numunelere yapismis olabilecek tüm kan, fibrin, yag veya yabanci malzeme kalintilarini uzaklastirmak için penisilin, streptomisin ve amfoterisin B (sirasiyla 500 U/ml, 500 pg/ml ve 1.25 pg/ml) içeren bir steril PBS çözeltisinde iki kez yikanmak zorundadir. Öncelikle stromanin epitelden ayrilmasi için numuneler, PBS'de tripsin 0.5 g/I ve EDTA 0.2 g/I içeren bir steril çözeltiyle 37°C'de inkübe edilmektedir, hücrelerle süpernatant santrifüjlemeyle 30 dakika sonra toplanmistir. Bu proses, her seferinde yeni tripsin- ESTA çözeltisi katilarak 5 kereye kadar tekrarlanmaktadir. Tercihen fibroblastlarda epitel hücre büyümesini destekleyen epitel hücre kültürü besiyerinde kültürlenen önemli miktarda üretral epitel hücreleri bu sekilde elde edilmektedir. Bu besiyer, 3 kisim Glukoz bakimindan zengin DMEM besiyerinden ve bir kisim Ham F-12 besiyerinden olusmaktadir, tüm bunlar %10 fetal bovin serumla, antibiyotik-antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 ug/ml streptomisin ve 0.25 ug/ml amfoterisin B), 24 i.ig/ml adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmistir: 0.4 pg/ml hidrokortizon, 5 pg/ml insulin, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 1.3 ng/ml triiyodotironin ve 8 ng/ml kolera toksin. Üretral stromanin ekstrasellüler matriksini parçalamak ve söz konusu matrikste bulunan stromal fibroblastlari ayirmak için numuneler, 6 saat süreyle fetal bovin serumsuz DMEM kültür besiyerinde Clostridium histolyticum tip I kollajenazin 2 mg/ml steril çözeltisinde 37°C'de inkübe edilmek zorundadir. Bu çözelti, dermis kollajenini parçalayabilmekte ve stromal fibroblastlari serbest birakabilmektedir. Primer fibroblast kültürlerini elde etmek için dermisin parçalanmis stromal hücrelerini içeren parçalama çözeltisi 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmek zorundadir ve fibroblastlara karsilik gelen hücre peleti 15 cm2 yüzey alani olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Antibiyotikler ve antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 pg/ml streptomisin ve takviye edilmis glukoz bakimindan zengin DMEM kültür besiyeri olarak kullanilmaktadir. Bu bazik kültür besiyeri, fibroblast besiyeri olarak adlandirilmaktadir.

Her halükarda hücreler standart hücre kültür kosullarinda %5 karbondioksitle 37°C'de inkübe edilecektir. Kültür besiyeri her Üç günde bir yenilenmektedir.

C.- Doku mühendisligi yoluyla fibrin ve agaroz bazli yapay insan üretra ürünlerinin yapilmasi 1- Ekstrasellüler fibrin ve agaroz matriksleri kullanarak içine batirilmis fibroblastlarla stromal replasmanlari üretme. Bu stromal replasmanlar dogrudan hücre kültürü Petri tabaklarinda üretilecektir. 10 ml stromal replasman asagidaki sekilde hazirlanacaktir: o bagistan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde etme. o önceden kültürlenmis ve 750 ul DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 insan cildi fibroblastini ekleme. o fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 pl traneksamik asit ekleme. o koagülasyon realGiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml %1 CICaz ekleme. o PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yi hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu %O.1 olacaktir.

Canli dermal ürünlere imkân veren agaroz konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. 0 hücre kültürü Petri tabaklarinda olabildigince bölüntüleme. o en az 30 dakika süreyle dinlenirken polimerize olmaya birakma. 2- Epitel hücrelerin stromal replasmanda alt kültürlenmesiyle dermal replasman yüzeyinde bir korneal epitel tabaka (epidermis) gelistirilmesi. Epitel hücreler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 C02 ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreleri dermal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Yapay üretra insan ürününü kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, üretral replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için stromal replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli stromal replasman üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir.

- Doku dehidrate edildiginde, üretra replasmani ölçüye göre kesilerek yukari yuvarlanmaktadir, ardindan monofîlament cerrahi iple dikilmektedir. Böylece natif insan üretrasina çok benzeyen bir boru biçimli üretra replasmani elde edilmektedir. Dokunun dehidrate edilmesinin uygun tutarlilik ve elastiklik seviyelerine yol açtigi, zorluk yasanmadan yukari yuvarlamaya ve dikis atmaya Yapay insan üretra ürününün degerlendirilmesi (Sekil 5): 1) Yapay insan üretra ürününün mikroskopik analizi (histolojik kalite kontrolü) (Sekil 5A).

Yapay üretra Ürün degerlendirmesi, yapilarinin normal natif insan üretrasina çok benzer oldugunu ortaya koymustur. Özellikle dört hafta süreyle kültürde tutulmus numunelerin analizi, yapay stromanin yüzeyinde bir katmanli skuamöz epitel olusumuna ve stromal hücrelerin aktif olarak çogaldigi bir yogun lif açisindan zengin stroma üretimini ortaya koymustur. Tüm bunlar, yapay üretranin yapisinin, normal natif üretraninkiyle ayni oldugunu ileri sürmektedir.

Oral mukoza hücrelerinin kullanildigi durumlarda, üretral hücrelerden elde edilenlere çok benzer olan stromal replasmanlar elde edilmistir. 2) Yapay insan üretra ürününün immünohistokimyasal analizi (Sekil SB).

Normal üretra kontrollerinin ve laboratuvarda elde edilmis yapay üretra ürünlerinin sitokeratin ekspresyon analizi, yapay üretral epitel tarafindan integrinlerin ekspresyonunu göstermistir, bu da bu epitelin tamamen fonksiyonel oldugunu Insan üretrasini yenisiyle degistirmek için kullanilabilecegini ileri sürmektedir.

Ornek 5. Bir yapay idrar kesesi ürünü hazirlama.

Bir yapay insan idrar kesesi ürünü hazirlama protokolü: A.-Insan idrar kesesi numunelerinin elde edilmesi.

Yapay Idrar kesesi replasmanlari üretmek için normal hastalarin veya donörlerin endoskopisi yoluyla elde edilen normal insan idrar kesesinin küçük biyopsileri kullanilmaktadir. Numune steril olarak elde edildikten sonra çikarilan dokular, olasi bir numune kontaminasyonunu önlemek için antibiyotiklerle (500 U/ml penisilin G ve 500 pg/ml streptomisin) ve antimikotik ajanlarla (1.25 pg/ml amfoterisin B) takviye edilmis Dulbecco'nun Modifiye Edilmis Eagle Besiyerinden (DMEM) üretilen bir steril nakil besiyerine derhal aktarilacaktir.

Alternatif olarak insan idrar kesesi numunelerinin alinmasinin elverisli olmadigi durumlarda oral mukoza numuneleri veya cilt numuneleri idrar kesesi replasmanlari üretmek için kullanilabilmektedir.

B.- Primer stromal ve epitel hücre kültürlerinin üretilmesi.

Nakil döneminden sonra tüm numuneler, numunelere yapismis olabilecek tüm kan, fibrin, yag veya yabanci malzeme kalintilarini uzaklastirmak için penisilin, streptomisin ve amfoterisin B (sirasiyla 500 U/ml, 500 pg/ml ve 1.25 ug/ml) içeren bir steril PBS çözeltisinde iki kez yikanmak zorundadir. Öncelikle stromanin epitelden ayrilmasi için numuneler, PBS'de 0.5 g/I tripsin ve 0.2 g/l EDTA içeren bir steril çözeltiyle 37°C'de inkübe edilmektedir, hücrelerle süpernatant santrifüjlemeyle 30 dakika sonra toplanmistir. Bu proses, her seferinde yeni tripsin- ESTA çözeltisi katilarak 5 kereye kadar tekrarlanmaktadir. Tercihen fibroblastlarda epitel hücre büyümesini destekleyen epitel hücre kültür besiyerinde kültürlenen önemli miktarda idrar kesesi epitel hücreler bu sekilde elde edilmektedir. Bu besiyer, 3 kisim glukoz bakimindan zengin DMEM besiyerinden ve bir kisim Ham F-12 besiyerinden olusmaktadir, tüm bunlar %10 fetal bovin serumla, antibiyotik-antimikotik ajanlarla adenin ve farkli büyüme faktörleriyle takviye edilmistir: 0.4 ug/ml hidrokortizon, 5 ug/ml insulin, 10 ng/ml epidermal büyüme faktörü (EGF), 1.3 ng/ml triiyodotironin ve 8 ng/ml kolera toksin.

Idrar kesesi stromasinin ekstrasellüler matriksini parçalamak ve söz konusu matrikste bulunan stromal fibroblastlari ayirmak için numuneler, 6 saat süreyle fetal bovin serumsuz DMEM kültür besiyerinde Clostridium histolyticum tip I kollajenazin 2 mg/ml steril çözeltisinde 37°C'de inkübe edilmek zorundadir. Bu çözelti, stromal kollajeni parçalayabilmekte ve içine batirilmis olan fibroblastlari serbest birakabilmektedir. Primer fibroblast kültürlerini elde etmek için parçalanmis stromal hücrelerini Içeren parçalama çözeltisi 10 dakika süreyle 1000 dev/dk'da santrifüjlenmek zorundadir ve fibroblastlara karsilik gelen hücre peleti 15 cm2 yüzey alani olan kültür siselerinde kültürlenmektedir.

Antibiyotikler ve antimikotik ajanlarla (100 U/ml penisilin G, 100 ug/ml streptomisin ve takviye edilmis glukoz bakimindan zengin DMEM kültür besiyeri olarak kullanilmaktadir. Bu bazik kültür besiyeri, fibroblast besiyeri olarak adlandirilmaktadir.

Her halükarda hücreler standart hücre kültür kosullarinda %5 karbondioksitle 37°C'de inkübe edilecektir. Kültür besiyeri her üç günde bir yenilenmektedir.

C.- Doku mühendisligi yoluyla f'ibrin ve agaroz bazli yapay insan idrar kesesi ürünlerinin yapilmasi 1- Ekstrasellüler fibrin ve agaroz matriksleri kullanarak içine batirilmis fibroblastlarla stromal replasmanlari üretme. Bu stromal replasmanlar dogrudan hücre kültürü Petri tabaklarinda üretilecektir. 10 ml stromal replasman asagidaki sekilde hazirlanacaktir: o bagistan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde etme. o önceden kültürlenmis ve 750 ul DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 Insan idrar kesesi fibroblasti o fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 ul traneksamik asit ekleme. o koagülasyon reaksiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml %1 CICaz ekleme. o PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yi hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu %0.1 olacaktir.

Canli dermal ürünlere imkân veren agaroz konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. 0 hücre kültürü Petri tabaklarinda olabildigince bölüntüleme. o en az 30 dakika süreyle dinlenirken polimerize olmaya birakma. 2- Epitel hücrelerin bu replasmanda alt kültürlenmesiyle stromal replasman yüzeyinde bir epitel tabaka (ürotelyum) gelistirme. Epitel hücreler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 COZ ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreleri dermal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Yapay idrar kesesi insan ürününü kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, idrar kesesi replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için stromal replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir. Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli stromal replasman üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir Iaminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. Bu prosesin amaci, optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir.

- Doku dehidrate edildiginde, idrar kesesi replasmani ölçüye göre kesilerek monofilament cerrahi ip kullanilarak istenen form kazandirilacak sekilde dikilmektedir. Dokunun dehidrate edilmesinin uygun tutarlilik ve elastiklik seviyelerine yol açtigi, zorluk yasanmadan dikis atmaya imkân verdigi vurgulanmalidir.

Yapay insan idrar kesesi ürününün degerlendirilmesi (Sekil 6): 1) Yapay insan idrar kesesi ürününün mikroskopik ve immünohistokimyasal analizi (histolojik kalite kontrolü) (Sekil 6A veGB).

Yapay Idrar kesesi ürün degerlendirmesi, yapilarinin normal natif insan Idrar kesesine çok benzer oldugunu ortaya koymustur. Özellikle dört hafta süreyle kültürde tutulmus numunelerin analizi, yapay stromanin yüzeyinde bir kübik veya skuamöz basit epitel olusumuna ve stromal hücrelerin aktif olarak çogaldigi bir yogun lif açisindan zengin stroma üretimini ortaya koymustur (Sekil 6A).

Immünohistokimyasal analiz, bu dokularin, normal kontrol insan idrar kesesi dokularina benzer sekilde, sitokeratin 13 ve pansitokeratin ve embriyonik dokular veya olgunlasan dokular açisindan tipik olan sitokeratin 7 ve 8 eksprese etmis oldugunu ortaya koymustur (Sekil 68). Tüm bunlar, yapay idrar kesesi yapisinin, normal natif idrar kasesininkiyle ayni oldugunu ileri sürmektedir.

Oral mukoza hücrelerinin kullanilmis oldugu durumlarda, idrar kesesi hücrelerinden elde edilenlere çok benzer olan stromal replasmanlar elde edilmistir. Örnek 6. Fibrin. adami ve kollaien bivomalzemeler araciligivla vaDav ürünler hazirlanmasi.

Yapay insan oral mukoza ürünlerinin hazirlanma protokolü: A. Primer epitel ve stromal hücre kültürlerinin üretilmesi.

Epitel hücrelerin (oral mukozal epitel hücreler) ve stromal hücrelerin (fibroblastlar) primer kültürlerini tesis etmek için insan donörlerden veya laboratuvar hayvanlarindan temin edilen normal oral mukozanin biyopsileri asagidaki yöntemler ve protokoller kullanilarak kullanilmaktadir: . oral mukozanin bir biyopsisini elde etme ve steril fizyolojik salinde Iaboratuvara . standart enzimatik dijesyon teknikleri (epitel izolasyon için tripsin veya dispaz ve stroma izolasyonu için kollajenaz) veya standart doku eksplant teknikleri kullanilarak epitel ve stromal hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi . hücre konflüansina ulasilana kadar epitel veya stromal hücreler için spesifik olan besiyerinde kültürleme Tüm kültürler, standart hücre kültürü protokollerini izleyerek nemli ortamda %5 C02 ile bir inkübatörde 37°C'de tutulmaktadir. Kültür besiyerleri, hücreler kültürde konflüansa ulasana kadar her 3 günde bir yenilenmektedir.

B. Laboratuvarda doku mühendisligi yoluyla fibrin, agaroz ve kollajen doku replasmanlarinin yapilmasi. 1- Içine batirilan stromal hücrelerle doku stroma replasmanlarinin üretilmesi. 20 ml stromal replasman hazirlamak için: a.- 6.4 mg/ml sivi kollajen konsantratinin 8.81 ml hacmini alarak 10 ml sivi tip I kollajenin hazirlanmasi. 1.1 ml 10X PBS eklenmesi ve yaklasik 90 i.iL NaOH eklenmesiyle pH degerinin 7.4±O.2'ye ayarlanmasi. pH degerinin artirilmasi için genellikle 0.1 ila 1 M arasinda bir konsantrasyonu olan NaOH kullanilmaktadir, bununla birlikte diger ürünler de kullanilabilmektedir. Nazikçe karistirmayla birbirine karistirma ve erken jellesmeyi önlemek için buzda tutma. b.- Asagidaki sekilde 10 ml bir fibrin ve agaroz karisimi hazirlama: - bagistan (otolog köken ihtimali) 7.6 ml insan kani plazmasi elde - önceden kültürlenmis ve 750 iJI DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 stromal hücreyi ekleme. - fibrin jelin fibrinolizini önlemek için 150 pl traneksamik asit - koagülasyon reaksiyonunu baslatmak ve bir fibrin lif agi olusturmak için 1 ml %1 ClCaz ekleme.

- PBS'de çözünen 0.5 ml %2 agaroz tip VII'yi hizla ekleme ve erime noktasina ulasana kadar isitma ve karistirarak nazikçe birbirine karistirma. Karisimdaki nihai agaroz konsantrasyonu konsantrasyon araligi %0.025 ila %03 arasinda degismektedir ve hastanin kullanim amacina göre belirlenmek zorundadir. c - Her iki çözeltinin (kollajen çözeltisi ve fibrin-agaroz çözeltisi) üretilecek ürüne bagli olarak degisken oranlarda karistirilmasi. Tüm durumlarda her iki çözeltinin olabildigince hizli karistirilmasi ve kollajen çözeltisinin karistirma anina kadar soguk tutulmasi. - Ürün A'nin üretilmesi için (2.8 g/L kollajen, 1.25 g/L fibrin ve 0.5 g/L agaroz) 10 ml kollajen çözeltisinin ve 10 ml fibrin-agaroz çözeltisinin eklenmesi. - Ürün B'nin üretilmesi için (3,8 g/L kollajen, 0,6 g/L fibrin ve 0,25 g/L agaroz) 15 ml kollajen çözeltisinin ve 5 ml ûbrin-agaroz çözeltisinin eklenmesi. - Ürün C'nin üretilmesi için (1.9 g/L kollajen, 1.9 g/L fibrin ve 0.75 g/L agaroz) 5 ml kollajen çözeltisinin ve 15 ml fibrin-agaroz çözeltisinin eklenmesi. d.- steril gözenekli hücre kültürü sistemlerinde veya Petri tabaklarinda en kisa zamanda bölüntüleme. e.- bir Inkübatörde 37°C'de en az 30 dakika süreyle beklerken polimerize olmaya birakma. 2- Oral mukozal epitel hücrelerin stromal replasmanda alt kültürlenmesiyle stromal replasman yüzeyinde bir epitel tabaka gelistirme. Epitel hücreler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 C02 ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreler stromal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Epitel katmanlasmasi ve olgunlasmasini (yaklasik bir hafta) tesvik etmek için stromal replasmani kültür besiyerine batirilmis halde tutarken epitel yüzeyi havaya (hava-sivi teknigi) maruz birakma.

- Yapay dokuyu kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, doku replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için stromal replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli stromal replasman üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir laminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. Bu prosesin amaci, optimum tutarlilik ve elastiklik seviyelerine ulasmak için ürünün nem seviyelerini önemli ölçüde azaltmaktadir. 6- Doku dehidrate edildiginde, ölçüye göre kesilerek monofilament cerrahi ip kullanilarak istenen formun kazandirilmasi. Dokunun dehidrate edilmesinin uygun tutarlilik ve elastiklik seviyelerine yol açtigi, zorluk yasanmadan dikis atmaya imkân verdigi vurgulanmalidir.

C. Laboratuvarda doku mühendisligi yoluyla kollajen doku replasmanlarinin yapilmasi. 1- Içine batirilan stromal hücrelerle doku stroma replasmanlarinin üretilmesi. 20 ml stromal replasman hazirlamak için: PBS eklenmesi ve pH degerinin yaklasik 180 pL NaOH katilarak 7.4±O.2'ye ayarlanmasi. pH degerinin artirilmasi için genellikle 0.1 ila 1 M arasinda bir konsantrasyonu olan NaOH kullanilmaktadir, bununla birlikte diger ürünler de kullanilabilmektedir. Nazikçe karistirmayla birbirine karistirma ve erken jellesmeyi önlemek için buzda tutma. o önceden kültürlenmis ve 750 ul DMEM kültür besiyerinde yeniden süspansiyon haline getirilmis 150,000 stromal hücreyi ekleme. o steril gözenekli hücre kültür eklentilerinde veya Petri tabaklarinda en kisa zamanda bölüntüleme. o bir inkübatörde 37°C'de en az 30 dakika süreyle beklerken polimerize olmaya birakma. 2- Oral mukozaI epitel hücrelerin stromal replasmanda alt kültürlenmesiyle stromal replasman yüzeyinde bir epitel tabaka gelistirme. Epitel hücreler için spesifik olan kültür besiyeriyle kaplama. 3- Standart hücre kültürü protokollerini izleyerek onu nemli ortamda %5 COZ ile bir inkübatörde 37°C'de tutma. Kültür besiyerleri, epitel hücreler stromal replasmanin yüzeyinde konflüansa ulasana (yaklasik bir hafta) kadar her 3 günde bir yenilenmektedir. 4- Epitel katmanlasmasi ve olgunlasmasini (yaklasik bir hafta) tesvik etmek için stromal replasmani kültür besiyerine batirilmis halde tutarken epitel yüzeyi havaya (hava-sivi teknigi) maruz birakma.

- Yapay dokuyu kültür yüzeyinden uzaklastirma ve bir düz steril cam yüzeyine yerlestirilmis 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidina biriktirerek kismen dehidrate etme. %70 alkolle sterilize edilen gözenekli tülün veya naylon kumasin bir parçasi, doku replasmaninin epitel tabakasinin filtre kagidina yapismasini önlemek için stromal replasmaninin yüzeyine yerlestirilmektedir.

Ardindan bir Ikinci 3-5 mm kalinliktaki steril filtre kagidi, kumasla kapli stromal replasman Üzerine yerlestirilmektedir. Bir düz steril cam parçasi yüzeyine yerlestirilmektedir ve yaklasik 250 g agirligindaki bir nesne sonraki üzerine yerlestirilmektedir (Sekil 1). Tüm proses, 10 dakika süreyle oda sicakliginda bir laminer akis davlumbazinda yürütülmek zorundadir. 6- Doku dehidrate edildiginde, ölçüye göre kesilerek monofilament cerrahi ip kullanilarak istenen formun kazandirilmasi.

Yapay insan oral mukoza ürününün degerlendirilmesi (Sekil 7): Yukaridaki protokole göre elde edilen ürünler degerlendirilmistir. Hazirlanan ürünlerin her biri için fibrin, agaroz ve kollajen konsantrasyonlari asagida belirtilmektedir: A.- fibrin (1,25 g/L), agaroz (0,5 g/L) ve kollajen (2,8 g/L).

B.- fibrin (0,6 g/L), agaroz (0,25 g/L) ve kollajen (3,8 g/L).

C.- fibrin (1,9 g/L), agaroz (0,75 g/L) ve kollajen (1,9 g/L).

D.- fibrin (0 g/L), agaroz (0 g/L) ve kollajen (5,6 g/L). 1) Yapay dokularin mikroskopik analizi (histolojik kalite kontrolü) (Sekil Mikroskopik analiz, doku mühendisligi yoluyla üretilen yapay dokularin kontrol olarak kullanilan natif dokulara yapisal olarak benzer oldugunu ortaya koymustur. Özellikle aralarinda stromal hücrelerin bulundugu, uygun hücre çogalma seviyelerini gösteren pek çok Iiften olusan bir stroma görülebilmektedir. Önceden açiklanan diger modellerle (özellikle fibrin modelleri ve agaroz modelli fibrin) karsilastirildiginda, fibrin, agaroz ve kollajen dokularin stroma seviyesinde daha büyük fibril yogunlugu vardir. Tüm bunlar, yukarida açiklanan protokollere dayanarak yapilan doku ürünlerinin normal natif insan dokulariyla uyumlu oldugunu ileri sürmektedir. 2) Reolojik kalite kontrolü (Sekil 78).

Yukarida açiklanan protokollere dayanarak yapilan doku ürünlerinin biyokimyasal özelliklerinin bir reometre araciligiyla analiz edilmesi. Sonuçlar Sekil 7C'de gösterilmektedir ve en iyi dokunun ürün A oldugunu ve ardindan ürün C'nin geldigini; ürün B'nin D'ye (yalnizca kollajen) çok benzer oldugunu ortaya koymaktadir. Bu nedenle analiz, viskoelastik davranista bir iyilesme ve kollajen konsantrasyonu yapay kollajen dokularinin gösterdiginden daha yüksege çiktikça bir artan esik stresini göstermistir.

Bu örneklerde gösterilen veriler, fibrin, agaroz ve kollajen dokularin fiziksel özelliklerinin optimum ve kontrol olarak kullanilan normal insan dokularininkine benzer oldugunu göstermektedir, bu da klinik kullanimlarina göre açiklanan yapay dokular açisindan bir Iyilestirmeyi beraberinde getirmektedir.

Ornek 8: Yapilandirma teknikleri uygulandiktan sonra fibrin-agaroz biyomalzemelerini iyilestirme.

Nanoyapilandirma tekniklerinin uygulanmasi, bu prosese maruz kalan biyomalzemelerin yapisini ve davranisini büyük ölçüde modifiye edebilmektedir. %0.1 fibrin ve agaroz biyomalzemede nanoyapilandirmanin temel etkileri (patent basvurusunun nihai tercih edilen konsantrasyonu) asagidaki gibidir: . Dokunun biyomekanik özelliklerinin önemli bir Iyilestirmesi. Bu artis, nanoyapilandirilmis dokunun manipüle edilmesine imkân vermektedir ve biyomalzemenin reolojik özelliklerinin önemli ve beklenmedik bir iyilesmesine yol açmaktadir. Sekil 8'de gösterildigi gibi esik gerilim, nanoyapilandirilmamis dokulara (sirasiyla 16.2 ve 4.23 Pascals) göre nanoyapilandirilmis dokularda 3.8 kat daha büyük olmustur. Bu sirada nanoyapilandirmaya maruz kalan numunelerin viskoz katsayisi (G") nanoyapilandirilmamis dokulara (sirasiyla 19.3 ve 3.67 Pa) göre 5.26 kat daha büyük olmustur (Sekil 9). Bu veriler, nanoyapilandirilmis biyomalzemelerin direncinin, nanoyapilandirilmamis dokulara göre daha büyük oldugunu göstermektedir.

Benzer sekilde nanoyapilandirilmis dokularin elastiklik katsayisi (G') natif nanoyapilandirilmamis biyomalzemelere (sirasiyla 152 ve 27.4 Pa) göre 5.55 kat daha büyük (Sekil 10) olmustur, bu da bu dokularin önemli ölçüde daha yüksek elastiklik seviyeleri oldugu anlamina gelmektedir.

Tüm bu olgular çok önemlidir ve açikçasi biyomalzemedeki su konsantrasyonuna bagli olmayip, nanoyapilandirma prosesi sonucunda biyomalzemede üretilen iç reaksiyonlara bagli olmaktadir.

. Nanoyapilandirilmis dokunun, cerrahi manipülasyonuna, alici yatagina dikilmesine ve test hayvanlarina implante edilmesine imkân veren manipülasyonunun büyük ölçüde iyilestirilmesi. Nanoyapilandirilmamis dokularin islenebilmesinin önemli ölçüde daha zor oldugu, kopma egiliminde olduklari ve klinik sütür ve implantasyonu önemli ölçüde komplike hale getirdiklerinin vurgulanmasi önemlidir. Bu iyilesme çok önemlidir ve basitçe biyomalzemede su konsantrasyonunun azalmasi olarak açiklanamaz; farkli fibrin ve agaroz Iifleri baglayan üç boyutlu yapilarin olusmasiyla baglanabilmektedir; biyomalzemenin özellikleri beklenmedik sekilde modifiye edilmektedir. 0 Nanoyapilandirmaya maruz kalan dokularin seffafliginin önemli ölçüde iyilestirilmesi. Görülebilir isik tayfinin iletim yüzdesi olarak (yaklasik 400-700 nm) ölçülen %0.1 nanoyapilandirilmis olmayan fibrin-agaroz biyomalzemelerinin seffafligi, göz önünde bulundurulan dalga boyuna (yani %92) bagli olarak %90- prosesine maruz kalan biyomalzemelerde daha iyi bir seffaflik (görülebilir isigin daha büyük iletimi) olmaktadir. Önceki durumlara benzer sekilde bu olgu, biyomalzemenin iç yapisindaki karmasik kimyasal ve fiziksel reaksiyonlar prosesinin sonucudur ve nanoyapilandirilmis dokularin, nanoyapilandirilmamis olan dokulara göre daha yogun oldugu ve daha düsük bir su muhteviyatinin oldugu göz önünde bulunduruldugunda seffaflikta bir iyilesme tamamen tahmin edilebilir olmamaktadir.

Klinik sonuç laboratuvar hayvanlarina bir kez implante edilmistir.

Nanoyapilandirmaya tabi tutulan biyomalzemelerin implante edilmesinin, nanoyapilandirilmamis biyomalzemelere göre klinik bakis açisindan daha etkili oldugu gösterilmistir. Önceden tahmin edilemeyen bu olgu, bir yandan biyomalzemenin uygun biyomekanik özellikleri nedeniyle daha büyük implant verimliligiyle ve diger yandan nanoyapilandirmaya tabi tutulan biyomalzemelerin mm2 basina daha büyük lif yogunluguna sahip olmasiyla ve dolayisiyla alici organizma tarafindan daha yavas bir yeniden modellemeye tabi olmakla ilgili olmak zorundadir.

Claims (19)

ISTEMLER

1. Asagidakileri içeren, bir yapay dokunun hazirlanmasina yönelik bir in vitro yöntem: a) fibrinojen içeren bir bilesimin izole hücrelerin bir numunesine eklenmesi, b) bir antifibrinolitik ajanin (a) adimindan elde edilen ürüne eklenmesi, c) en az bir koagülasyon faktörünün, bir kalsiyum kaynaginin, trombinin veya yukaridakilerin herhangi bir kombinasyonunu (b) adimindan elde edilen ürüne eklenmesi, d) bir polisakkarit bilesiminin (c) adimindan elde edilen ürüne eklenmesi, e) izole edilmis hücrelerin (d) adimindan elde edilen ürün içerisinde veya üzerinde kültürlenmesi ve f) (e) adimindan elde edilen ürünün nanoyapilandirmasinin indüklenmesi, burada söz konusu nanoyapilandirma indüklemesi, (e) adimindan elde edilen ürünün dehidrasyonunu ve/veya mekanik sikistirmasini içerir, (d) adimindaki polisakkarit agarozdur.

. Istem 1'e göre yöntem olup, özelligi (a) adimindaki hücrelerin fibroblastlar veya keratositler olmasidir.

. Istem 1-2'den herhangi birine göre yöntem olup, özelligi ayrica (b) ve (c) adimlari arasinda bir proteinin eklendigi bir adimi (adim b2) içermesidir.

. Istem 3'e göre yöntem olup, özelligi (b2) adiminda eklenen proteinin fibronektin olmasidir.

. Istem 1-4'ten herhangi birine göre yöntem olup, özelligi ((1) ve (e) adimlari arasinda, bir protein içeren bir bilesimin (d) adimindan elde edilen ürüne eklenmesini içeren bir adim (d2) ihtiva etmesidir.

. Istem 5'e göre yöntem olup, özelligi (d2) adiminda eklenen proteinin kollajen olmasidir.

7. Istem 1-6'dan herhangi birine göre yöntem olup, özelligi (e) adimindaki hücrelerin göbek bagi kök hücrelerini içermesidir.

8. Istem 1-7'den herhangi birine göre yöntem olup, özelligi (e) adiminin hücrelerin epitel hücreleri içermesidir.

9. Istem 1'e göre yöntem olup, özelligi (e) adimindan elde edilen ürünün dehidrasyonunun, süzme, buharlastirma, emme, kapiller basinç, osmoz veya elektro-osmozu içeren listeden seçilen bir yöntemi ihtiva etmesidir.

10.Istem 9'a göre yöntem olup, özelligi (e) adimindan elde edilen ürünün kapiller basinçla dehidrasyonunun, emici bir malzemenin (e) adimindan elde edilen ürüne uygulanmasini içermesidir.

11.Istem 1-10'dan herhangi birine göre yöntem olup, özelligi (f) adimindaki mekanik sikistirmanin, statik bir yükün uygulanmasi, bir hidroligin uygulanmasi, bir kamin uygulanmasi, bir veya birden fazla merdanenin uygulanmasi, bir balonun uygulanmasi, ekstrüzyon veya santrifüjlemeyi içeren listeden seçilen bir yöntemi ihtiva etmesidir.

12.Istem 11'e göre yöntem olup, özelligi (f) adimindaki statik yükün uygulanmasinin, (e) adimindan elde edilen ürün Üzerine bir agirlik yerlestirilmesini içermesidir.

13.Istem 1-12'den herhangi birine göre yöntem olup, özelligi (e) adimi ve (f) adimi arasinda, (e) adimindan elde edilen ürünün havaya maruz birakildigi bir ek adimin yer almasidir.

14.Istem 1-13'ten herhangi birine göre yöntemle elde edilebilen bir yapay doku.

15.Istem 14'e göre yapay dokunun farmakolojik ve/veya kimyasal bir ürünün degerlendirilmesi için kullanimi.

16.Tipta kullanima yönelik, Istem 14'e göre yapay doku.

17.Bir hastalikli veya hasarli doku veya organin fonksiyonel aktivitesinin kismen veya tamamen artirilmasinda, restore edilmesinde veya degistirilmesinde kullanima yönelik, Istem 14'e göre yapay doku.

18.Istem 17'ye göre kullanima yönelik yapay doku olup, özelligi hasar gören doku veya organin cilt, mesane, üretra, kornea, mukoza, konjonktiva, karin duvari, konjonktiva, kulak zari, farinks, larinks, bagirsak, karin zari, ligament, tendon, kemik, beyin zari veya vajinayi içeren listeden seçilmesidir.

19.Istem 14'e göre yapay dokuyu içeren bir farmasötik bilesim.