JP6449220B2 - 毛包新生 - Google Patents
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Description
本出願は、2010年6月18日に出願された米国仮出願第61/344,258号の優先権を主張し、これらの全内容は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は、一部において、米国政府から支援を受けてなされた。したがって、政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、十分に形成されたヒト毛包を誘導することができる、皮膚代替物に関する。また、本発明は、ヒト毛包の新生を誘導するための方法および組成物にも関する。一部の実施態様において、本発明は、全層または部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、および完全なまたは部分的な脱毛の治療に使用することができる。
本明細書に使用する、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単数形は、文脈に明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」という用語、またはこれらの変形が、詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかに使用される限度において、かかる用語は、「含む(comprising)」という用語と同様に、包括的であることが意図される。
驚くべきことに、良性付属器腫瘍から採取された細胞が発毛促進性であることが分かった。具体的には、アップレギュレートされたmTORC1/TSC1/TSC2シグナリングネットワークを示す間葉系細胞は、毛包を誘導することができる。かかる毛包は、Chuongらの文献:「幹細胞生物工学の時代における毛包の定義(Defining hair follicles in the age of stem cell bioengineering)」,J.Invest.Dermatol.,127:2098−100(2007)によって提案された基準に従って完成される。毛包は、毛包基部に位置する毛包および毛乳頭の遠心端から現われる上皮フィラメントを有した正常な形態を有する。毛包は、毛包基部で増殖する細胞を有し、外毛根鞘および内毛根鞘、角皮および皮質の同心層を有する。毛包は、外毛根鞘の正常な分化を示し、毛幹および皮脂腺を有する。髪は、正常な周期を経て、上皮幹細胞構成要素を含む。
哺乳動物の皮膚は、表皮と呼ばれる外側層と、真皮と呼ばれる中間層の2つの第一の層を含む。表皮は、有糸分裂によって表皮の深い層に形成され、次いで、表面まで移動する、ケラチン細胞を主として含み、ケラチン細胞は結局屑する。真皮は、毛包、皮脂腺、汗腺、アポクリン腺、神経、リンパ管、および血管を含んだ種々の構造体を含む。
本発明の皮膚代替物は、(1)改変間葉系細胞、または(2)改変間葉系細胞および上皮細胞のいずれかを含む。皮膚代替物が改変間葉系細胞を含み、上皮細胞を含まない実施態様において、間葉系細胞は、患者の上皮細胞と相互作用して、毛包を生ずる。皮膚代替物が改変間葉系細胞と上皮細胞とを含む実施態様において、改変間葉系細胞および上皮細胞は、皮膚代替物に供され、患者の上皮細胞と相互作用してか、または相互作用しないで、毛包を生ずる。
一般に、間葉系細胞(すなわち、誘導型多能性細胞)の供給源が、本発明に有用である。したがって、本発明は、毛包形成誘導能または潜在能を有する特定の供給源の細胞の使用に限定されない。実際、本発明は、毛包を誘導することができる種々の細胞系および供給源の使用を考慮する。間葉系細胞は、通常、ビメンチンを発現させる中胚葉結合組織細胞と考えられるが、これらの属性を有するビメンチン発現細胞は、誘導された神経冠でもあり得る。細胞の供給源には、毛乳頭の誘導型多能性細胞、および毛包の結合組織鞘が含まれる。間葉系細胞は、次に示す1以上の供給源から単離することができる:自家細胞のための患者の皮膚または粘膜;同種異型細胞のためのドナーの皮膚または粘膜;正常な皮膚;付属器腫瘍を有する皮膚;および、他の組織(例えば、脂肪、骨髄等)。間葉系細胞の一例には、線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、爪線維芽細胞(爪単位の線維芽細胞)、歯髄細胞、歯周靱帯細胞、神経冠細胞、付属器腫瘍細胞、人工多能性幹細胞、ならびに骨髄、臍帯血、臍帯、脂肪、および他の器官からの間葉系幹細胞が含まれる。
一般に、扁平上皮に階層化することができる上皮細胞または細胞系の供給源が、本発明に有用である。したがって、本発明は、扁平上皮に分化することができる、特定の供給源の細胞の使用に限定されない。実際、本発明は、重層扁平上皮に分化することができる、種々の細胞系および供給源の使用を考慮する。細胞の供給源には、初期および不死化ケラチン細胞、ケラチン細胞様細胞、ならびに、ヒトおよび死後硬直ドナーから得られるケラチン細胞様細胞への分化能を有する細胞(Augerらの文献:In Vitro Cell.Dev.Biol.−−Animal 36:96−103;および、米国特許第5,968,546号および同第5,693,332号)、新生児包皮(Asbillらの文献:Pharm.Research 17(9):1092−97(2000);Meanaらの文献:Burns 24:621−30(1998);米国特許第4,485,096号;同第6,039,760号;および、同第5,536,656号)、およびNM1細胞等の不死化ケラチン細胞系(Badenの文献:In Vitro Cell.Dev.Biol.23(3):205−213(1987))、HaCaT細胞(Boucampらの文献:J.cell.Boil.106:761−771(1988));ならびに、NIKS細胞(細胞系BC−1−Ep/SL;米国特許第5,989,837号;ATCC CRL−12191)が含まれる。
間葉系細胞および上皮細胞は、適切な方法を用いて、皮膚または粘膜の試料または皮膚腫瘍から単離することができる。例えば、間葉系細胞は、組織外植片から細胞の移動によって単離してもよい。かかる方法の一例は、実施例3でさらに詳細に説明する。または、細胞を、皮膚または粘膜の試料または皮膚腫瘍から解離して、間葉系細胞および上皮細胞を単離することができる。かかる方法の一例は、実施例3でさらに詳細に説明する。さらに、上皮細胞は、多能性幹細胞を誘導して、上皮細胞に分化することによって単離することができる。かかる方法の一例は、実施例7でさらに詳細に説明する。
本発明の皮膚代替物に使用する改変間葉系細胞は、TSC1/TSC2およびmTORシグナリングネットワークに対して自然に発生する改変を有するか、または、これを設計して、TSC1/TSC2およびmTORシグナリングネットワークの改変を形成する。したがって、「改変された」という用語は、野生型の細胞と比較して、このネットワークへの自然に発生し、および設計された変化を包含する。
TSC1/TSC2の機能は、mTORC1の機能を増加させ、および/またはmTORC2の機能を低下させることができる、当業者に公知の方法によって低下させることができる。これは、TSC1またはTSC2を直接ダウンレギュレートすることによって、および/または、TSC1/TSC2機能を刺激するか、もしくは増加したTSC1/TSC2機能の模擬体(例えば、CYLD、LKB1、FLCN、MEN1、NF1、PTEN、PRAS40、4E−BP1、GSK3、もしくはDeptor)として作用する、刺激タンパク質のダウンレギュレートによって、実行することができる。
TSC1/TSC2機能を阻害するか、または低下したTSC1/TSC2機能の模擬体として作用するタンパク質の機能は、mTORC1の機能を増加させ、および/またはmTORC2の機能を低下させることができる、当業者に公知の方法によって、増加させることができる(例えば、Ortiz−Urda,S.らの文献:「遺伝子操作された線維芽細胞の注入は、再生ヒト表皮水疱症皮膚組織を矯正する(Injection of Genetically Engineered Fibroblasts Corrects Regenerated Human Epidermolysis Bullosa Skin Tissue)」,The Journal of Clinical Investigation 111(2):251−255(2003)を参照のこと)。例えば、阻害タンパク質の機能は、強いプロモーターでノックして、阻害タンパク質をコードする遺伝子の発現を促進することによって、増加させることができる。かかる方法の詳細な説明は、実施例4に提供する。
上に論じるように、TSC1/TSC2およびmTORシグナリングネットワークの改変は、自然に発生し得る。これらの自然に発生する改変は、良性付属器腫瘍に存在し得る。したがって、良性付属器腫瘍は、本発明による改変間葉系細胞の十分な供給源を提供すると考えられる。
本発明の組成物には、皮膚代替物と注射用製剤が共に含まれる。
本発明の皮膚代替物は、先行技術の皮膚代替物とは異なる細胞型を含むが、先行技術の公知の方法(図1B)によって調製してもよい。例えば、Greenberg Sらの文献:「設計されたヒト皮膚のインビボ移植(In vivo transplantation of engineered human skin)」,Methods Mol Biol.,289:425−30(2005)は、インビトロで皮膚代替物を作製する方法を開示する。さらに、Shevchenko RVらの文献:「皮膚再建に使用可能の組織によって設計された皮膚バイオ構築物の総説(A review of tissue−engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction)」,J R Soc Interface,7(43):229−58(2010)は、皮膚代替物の調製に使用することができる種々のアプローチの総説を提供する。また、例示的な方法は実施例9にも提供する。
本発明には、注射用製剤または移植用製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者に公知の方法によって調製することができる。例示的な方法は、実施例9に提供する。一実施態様において、間葉系細胞は、無菌食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)、ハンクスの平衡塩類溶液(Hank’s balanced salt solution)、プラズマライト(Plasmalyte)A、またはRPMI等の注入に適切なバッファーに含まれる。一実施態様において、間葉系細胞は、マイクロスフィアに導入される。別の実施態様において、間葉系細胞は、マトリックスまたは基質を備える。マトリックスは、メチルセルロース、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン、フィブリン、フィブロネクチン、またはアガロース等の天然高分子であり得る。マトリックスは、マトリゲル(Matrigel)(商標)、または合成高分子等の複合混合物であり得る。別の実施態様において、間葉系細胞は、注入または移植前にマトリックスまたは基質を有するか、またはこれらのない上皮細胞と組み合わせる。
本発明は、本発明の皮膚代替物を投与する少なくとも2つの方法を提供する。本発明の皮膚代替物は、患者に移植することができ(図1C)、また、この皮膚代替物は、患者に注入することができる。このため、本発明は、患者のヒト毛包を誘導することができる細胞を患者に移植するための方法を提供する。
本発明の組成物は、全層または部分層の皮膚欠損、皮膚の失活、創傷、潰瘍、化学火傷または熱傷、傷跡、および、先天的にもしくは後天的に、完全なもしくは部分的な髪、皮脂腺、もしくはエクリン腺の異常を有する患者を治療するのに有用である。皮膚損傷は、表皮、部分層、および全層の3つのカテゴリーに分類される。表皮のみが影響を受け、これが傷跡を残さずに、迅速に再生するので、表皮の損傷は、特殊な外科治療を必要としない。部分層の創傷は、表皮および真皮に影響を与える。かかる創傷は、一般に、創傷の縁からの上皮化によって治癒し、傷端、毛包、または汗腺の基底のケラチン細胞は、移動して、損傷領域を被覆する。全層の損傷は、上皮再生要素の完全な破壊が特徴である。この型の損傷は、傷端のみの上皮化と共に、拘縮によって治癒する。部分層の損傷および全層の損傷は、皮膚移植を必要とすることが多い。
さらに別の実施態様において、この方法は、患者に本発明の皮膚代替物を移植することを含む。本発明の皮膚代替物は、当業者に公知の適切な方法によって投与することができる。
移植片部位は、当業者に公知の方法によって調製することができる。例示的な方法は、実施例12に提供する。移植片部位は、損傷した皮膚(例えば、部分層もしくは全層の化学火傷、熱傷、皮膚の裸出、または皮膚の失活)、皮膚の部分的かもしくは完全な欠損による創面(例えば、皮膚が裸出したか、潰瘍化した部位)、手術傷(例えば、良性または悪性皮膚腫瘍の切除後の)、または先天的な皮膚(例えば、先天性皮膚形成不全症)もしくは後天性の皮膚(例えば、任意の原因による傷跡のある皮膚)、毛包、皮脂腺、および/またはエクリン腺の減少、異常、もしくは欠損を有する皮膚であり得る。一部の実施態様において、移植片部位は、水、抗菌性洗浄剤、またはアルコール溶液(アルコール綿球等)によって洗浄される。別の実施態様において、所望のパターンの髪は、外科用マーカーによって移植片部位上で抜かれる。別の実施態様において、局所麻酔薬が患者に投与される。更なる麻酔を必要とする事例では、ガス、静脈内、または神経ブロック麻酔薬を患者に投与することができる。
種々の臨床的方法を、患者に皮膚代替物を適用するのに用いることができる。皮膚代替物は、治療する欠陥のサイズ、痛みレベル、および全身麻酔の必要性により、外来患者診療室、または手術室で適用することができる。例示的な方法は、実施例11および12に説明する。皮膚代替物の適用前に、施術者は、皮膚代替物の有効期限を再検討し、pHを確認し、視覚的に観察し、臭いをかいで、細菌汚染物質または粒子状物質等の汚染物質がないことを確認することができる。皮膚代替物は、使用直前まで、制御温度68°F〜73°F(20℃〜23℃)で、ポリエチレンバッグに保存することができる。
本発明の生毛細胞は、当業者に公知の適切な方法によって注入することができる。例示的な方法は、実施例11に説明する。一実施態様において、この方法は、低下したTSC1/TSC2機能、増加したmTORC1機能、および/または低下したmTORC2機能を有する、改変間葉系細胞を、患者に、皮下送達または皮内送達することを含む。別の実施態様において、この方法は、患者に上皮細胞を送達することをさらに含む。細胞は、懸濁剤、またはマイクロスフィアとして送達することができる。懸濁剤を注入する場合、それぞれの注入部位は、50〜2,000の細胞を送達することができる。マイクロスフィアを注入する場合、それぞれの注入部位は、1以上のマイクロスフィアを送達することができる。
移植片部位は、水、抗菌性洗浄剤、またはアルコール溶液(アルコール綿球等)によって洗浄することができる。別の実施態様において、所望のパターンの髪は、各注入部位を示すアウトライン法またはピクセル処理法(pixilated fashion)のいずれかで、外科用マーカーによって移植片部位上で抜かれる。また、紙テンプレートまたは他の材料のテンプレートも、注入パターンを示す注入部位に適用することができるか、または、注入物を、グリッドにロボット工学もしくは複数の注入口を備えたデバイスを使用することによって、正確な間隔で送達することができる。別の実施態様において、局所麻酔薬を患者に投与することができる。更なる麻酔を必要とする事例では、ガス、静脈内、神経ブロック麻酔薬を患者に投与することができる。
注入物は、皮下注射または皮内注射のための当業者に公知の技術によって投与することができる。1,000〜20,000細胞/mlの濃度を注入物に使用することができる。0.05〜0.1mlの容積を、14〜30ゲージ針を有する1〜3mlの注射器を使用して、各注射部位に注射することができる。かかる実施態様において、皮膚はぴんと張られ、また、針は、皮膚と5°〜30°の角度の傾斜で挿入される。その後、細胞は、緩やかな圧力を徐々に注入され、針は除去され、また、緩やかな圧力は、漏出を防ぎ、かつ吸収を促進するためにかけられる。
実施例1:TSC患者の皮膚代替物の調製および評価
線維性前額部斑、線維血管腫、および爪周囲線維腫を含むTSC皮膚過誤腫は、真皮および/または毛包周囲線維芽細胞様細胞、ならびに上皮における変化を含む。TSCと診断された患者を、施設内倫理委員会に承認されたプロトコール、全国心臓肺臓血液学会(NIH)の00−H−0051に登録した。TSC患者の線維血管腫、爪周囲線維腫、線維性斑、および正常と考えられる皮膚の試料を得て、二分化し、一方の部分をルーチン病理に使用し、また、他方を、凍結切片または細胞培養に使用した。
正常および腫瘍患者の試料間の組織学的相違(図3Aおよび3B)および免疫組織化学的相違を、比較用のベースラインによって特性評価した。簡潔には、試料のパラフィン切片を脱パラフィン化し、20分間、10mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH6.0)中で沸騰させることによって、抗原回復の処理をした。凍結切片を、−20℃で10分間、アセトンに固定した。ベクター(Vector)(登録商標)レッドまたはDAB基質(ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)社製、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を有する、特異的抗体およびベクタスタチン(VECTASTAIN)ABCキットを使用して、メーカーの手順に従って(DABペルオキシダーゼ褐色基質によるABC西洋わさびペルオキシダーゼ染色を使用した、Ki−67染色を除く)、切片の細胞マーカーを染色した。ポジティブ染色法の相対強度を、オリンパスBX40光学顕微鏡(オリンパス社製、メルヴィル、ニューヨーク州)、およびオープンラボ(Openlab)4.0ソフトウェア(インプロビジョン(Improvision)社製、レキシントン、マサチューセッツ州)を使用して、定量化した。
正常な皮膚中の毛包と比較して、線維性斑および線維血管腫中の毛包は、可変的に拡大し、延び、または、数が多いと考えられるが、爪周囲線維腫は、厚くなった表皮を有するが、毛包を有さなかった(図4A〜4D)。この観察は、ヘマトキシロンおよびエオシンによる組織切片染色に基づく。線維血管腫中の毛包は、可変的に肥大したか、延びたか、または未熟であった。爪周囲線維腫には、毛包構造体がなかった。
線維芽細胞を、生体試料を小さな断片に切断し、これらを、10%FBS、ペニシリン(100U/ml)、およびストレプトマイシン(100μg/ml)を添加した1mlのDMEM中の35mm培養皿に載置して、組織を被覆することによって、線維血管腫、爪周囲線維腫、前額部斑、および正常と考えられる皮膚生体試料から単離した。細胞が移動して、培養皿を被覆するまで、培地を週に2回交換した。その後、細胞を二次培養のために採取した。
広範囲に使用されているインビトロで構築した真皮−表皮複合体の系を、移植に適応させた。メラノサイトを伴うケラチン細胞を、4℃で一晩、ディスパーゼ(ベクトン・ディキンソン・ラボウエア(Becton Dickinson Labware)社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州)で処理することによって、身元不明の正常な新生児包皮から単離した。表皮シートを真皮シートから分離し、次いで、37℃で20分間、0.05%トリプシン−0.53mM EDTA(インビトロゲン(Invitrogen)社製、ゲーサーズバーグ、メリーランド州)によって消化させた。細胞を回収し、これをウシ下垂体抽出物、および組換え型上皮成長因子を添加した、ケラチン細胞無血清培地(インビトロゲン(Invitrogen)社製)中の組織培養皿に載置した。
本実施例は、毛包新生が可能な皮膚代替物を開示する。また、本実施例は、結節硬化複合体(TSC)における皮膚過誤腫の異種移植片モデルの開発についても開示する。患者の正常と考えられる皮膚の線維芽細胞ではなく、ヒトTSC皮膚過誤腫から増殖したTSC2ヌル線維芽細胞様細胞は、模倣TSC過誤腫の組織的変化を刺激し、正常なヒト包皮ケラチン細胞を誘導して、毛包を形成した。毛包は、周期的に間隔を置き、正確に配向し、皮脂腺、毛幹、内毛根鞘、および外毛根鞘を十分に備え、また、幹細胞の付随層および膨出領域のマーカーを発現させた。毛包下部(すなわち、毛球)周囲のTSC2ヌル細胞は、幹細胞マーカーネスチンを含む、表皮鞘および毛乳頭のマーカーを発現させた。腫瘍異種移植片は、増加したmTORC1機能、血管新生、および被覆する表皮細胞の増殖を含む、TSC皮膚過誤腫の機能を要約した。ラパマイシン(mTORC1阻害剤)による処置は、これらのパラメーターを標準化し、腫瘍細胞の数を減少させたが、毛包サイズまたは密度を変化させなかった。
立証された発毛促進能を有する細胞にみられたTSC2発現の欠損を模倣するために、shRNAを使用して、培養した線維芽細胞および毛乳頭細胞中のTSC2発現をノックダウンした。さらに、バート−ホッグ−デューベ症候群患者が、TSC皮膚過誤腫に類似する皮膚過誤腫の形成をもたらすFLCN機能の欠損を有するため、shRNAも使用して、培養した線維芽細胞および毛乳頭細胞中のFLCN発現をノックダウンした。以下に論じるように、TSC2およびFLCNのノックダウンは、細胞の発毛促進性を増強した。
野生型間葉系細胞(すなわち、真皮線維芽細胞および毛乳頭細胞)を、shRNAを使用し、TSC2の発現をノックダウンすることによって、TSC2に改変して、TSC1/TSC2機能を低下させ、mTORC1機能を増加させた。さらに、野生型間葉系細胞を、shRNAを使用し、FLCNの発現を減少させることによって、FLCNに改変して、TSC1/TSC2機能の欠損を模倣した。TSC2を標的としたヘアピン配列を含む、pGIPZ−レンチウイルスshRNAmirベクターを有する市販のレンチウイルス粒子(オープンバイオシステム社製)を、TSC2発現のノックダウンに使用した。FLCNを標的としたヘアピン配列を含む、pGIPZ−レンチウイルスshRNAmirベクターを有する市販のレンチウイルス粒子(オープンバイオシステム社製)を、FLCN発現のノックダウンに使用した。新生児包皮線維芽細胞またはヒト毛乳頭細胞を、レンチウイルス粒子によって形質導入し、その後、形質導入48時間後に開始するプロマイシン選択(2μg/ml)をした。shRNAを安定的に発現させる細胞(GFP発現によって決定する)を、プールし、プロマイシン中に維持した。公知の哺乳動物遺伝子に対して相同性のない非標的shRNA対照(shNT、NT)を含む、pGIPZレンチウイルスを、負の対照としてノックダウン試験に使用した。
安定的にトランスフェクトされたTSC2ノックダウン包皮線維芽細胞でウェスタンブロット分析を行って、TSC2発現が、mTORC1を介するシグナリングの活性化がみられる程度に十分に減少するか否かについて判断した。図17は、血清飢餓条件下におけるリボソームタンパク質S6(pS6)の超リン酸化によって示すように、TSC2ノックダウンには、過剰に活性のあるmTORC1シグナリングが伴ったことを示す。すべてのS6は不変であり、チューブリン対照は、比較可能な量のタンパク質が、異なるレーンにロードしたことを確認した。同様の結果は、複製の形質導入で得られた(データは示さない)。したがって、TSC2発現は、mTORC1を介するシグナリングを活性化する方法で、良好にノックダウンされた。
毛包の形成を誘導する細胞(生毛細胞)は、アルカリホスファターゼを発現させる。アルカリホスファターゼは、毛乳頭細胞のマーカーであり、高いアルカリホスファターゼ活性を有する毛乳頭細胞は、インビボにおいて、高い毛包誘導能を有する。したがって、培養形質導入細胞において、アルカリホスファターゼ活性を測定して、TSC2またはFLCN発現のノックダウンによって、生毛細胞の数が増加するか否かについて判断した。図18に示すように、ヒト毛乳頭細胞は、初期継代培養時において高いアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、その後の継代培養に伴って急速に低下する。対照的に、非標的ベクター(shNT)ではなく、shTSC2を有する正常なヒト線維芽細胞を形質導入して、アルカリホスファターゼ活性が増加し、この増加は、数回の継代培養において維持された。全体として、アルカリホスファターゼ活性は、TSCの正常な線維芽細胞よりもTSC2ヌル細胞で高く、TSC2ノックダウン細胞において発毛促進活性を示した。TSC2がヒト毛乳頭細胞でノックダウンされる場合(図19)と、FLCNが真皮線維芽細胞にノックダウンされる場合(図20)、同様の結果が得られた。したがって、TSC2またはFLCNのノックダウンによる細胞は、アルカリホスファターゼ(発毛促進性毛乳頭細胞のマーカー)の細胞活性の増加を示した。
インビトロ毛包分析を用いて、懸滴細胞培養物における毛包組織および構造対形成に対するTSC2のノックダウンの影響を決定した。簡潔には、改変間葉系細胞(TSC2(shTSC2)または非テンプレート(NT)対照のノックダウンによる新生児包皮線維芽細胞(NFF))から作製した、30,000の細胞の懸滴培養物を、毛乳頭培地とケラチン細胞無血清培地の1:1混合物(10μl)中の新生児包皮ケラチン細胞(NFK)(各細胞集塊当たり30,000の細胞)と組み合わせた。細胞集塊を、懸滴して、4週間、インキュベーターでインキュベートした。懸滴培養物をヘマトキシロンおよびエオシンで分析し、抗パンサイトケラチン抗体によって免疫組織化学検査を行って、選択的にケラチン細胞を確認した。
形質導入した、および安定的にTSC2ノックダウンベクターを発現させる、新生児包皮線維芽細胞(NFF)または毛乳頭細胞を使用して、真皮−表皮複合体を発生させた。細胞を、10%FBS/DMEM中1mg/mLのラット尾部1型コラーゲンと混合し、ウエル当たり0.5×106の細胞密度で、6穴トランスウエルプレートに加えた。真皮構築物を、3日間、10%FBS/DMEM中で成長させた。shTSC2で形質導入されたNFFの5つの30,000細胞懸滴マイクロスフィアを、真皮構築物上に静置し、1×106のケラチン細胞で被覆した。真皮−表皮複合体を、4日間、0.1%FBSを含むDMEMとハムのF12(3:1)の混合物中で浸漬させてインキュベートし、その後、複合体を、気液界面に供し、皮膚等価物を、4日間または8日間、1%FBSを含むDMEMとハムのF12(1:1)の混合物中で成長させた後、10%ホルマリンに固定した。次いで、皮膚等価物を、ヘマトキシロンおよびエオシン(H&E)によって分析し、免疫組織化学検査を、抗パンサイトケラチン抗体によって行った。
マウス移植試験を行って、TSC2のノックダウンが、インビボにおいて毛包の形成を促進するか否かについて判断した。簡潔には、新生児包皮線維芽細胞および毛乳頭を形質導入し、上述するように、TSC2ノックダウンベクターまたは非標的ベクターのいずれかを選択した。細胞を、10%FBS/DMEM中1mg/mLのラット尾部1型コラーゲン(BDバイオサイエンシーズ社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州)と混合し、ウエル当たり0.5×106の細胞密度で、6穴トランスウエルプレート(コーニング社製、コーニング、ニューヨーク州)に加えた。真皮構築物を、10%FBS/DMEM中で3日間成長させ、1×106のケラチン細胞で被覆した。真皮−表皮複合体を、2日間、0.1%FBSを含むDMEMとハムのF12(3:1)の混合物中で浸漬させてインキュベートし、その後、複合体を気液界面に供し、移植前にさらに2日間、1%FBSを含むDMEMとハムのF12(1:1)の混合物中で成長させた。
shRNAのレンチウイルス形質導入を用いた、本実施例に示す結果は、TSC2またはFLCNの欠損によって、線維芽細胞の発毛促進能が増強するという概念実証を提供する。
間葉系細胞は、次に示す1以上の供給源から単離することができる:自家細胞のための患者の皮膚または粘膜;同種異型細胞のためのドナーの皮膚または粘膜;正常な皮膚または粘膜;付属器腫瘍を有する皮膚;および、他の組織(例えば、脂肪、骨髄)。試料サイズが十分に大きい場合(すなわち、1cm3以上)、線維芽細胞は、酵素消化によって単離することができる。
細胞は、細胞移動方法を用いる皮膚試料または皮膚腫瘍から単離することができる。外植片から細胞移動によって間葉系細胞を単離するために、皮膚試料を小さな断片に切断し、これを、1mLまたは5mLの10%FBS/DMEMまたは間葉系幹細胞増殖培地(MSCGM;ロンザグループ(Lonza Group)社製、スイス)を収容した、35mmまたは100mmの無菌皿に移す。プレートを、37℃で、5%CO2インキュベーターにインキュベートする。十分な数の間葉系細胞がみられるまで、培地を週2回度交換する。組織片から移動する細胞を、倒立顕微鏡を使用して、規則的にモニターする。間葉系細胞が、外植片(培養開始およそ2〜3週後)間の皿表面の大部分を占める場合、間葉系細胞を二次培養する。細胞を、二次培養のために採取し、小さな組織片を、多くの細胞を単離するために、新しい皿に移し、細胞が組織からこれ以上移動しなくなるまで、外植片の移動を10回より多く繰り返す。各移動からの細胞を、初期継代培養で液体窒素中に保存する。
皮膚試料または皮膚腫瘍からの細胞解離を、間葉系細胞を単離するのに使用することができる。本方法によれば、皮膚試料(1×1cm)を、4℃で、60mm皿で、3mlのディスパーゼによって一晩処理する。または、試料を、室温で30分間、0.25%トリプシンによって処理してもよい。真皮を表皮シートから分離し、小さな断片に切断する。試料を、10mLの酵素溶液(1mMピルビン酸ナトリウム、2.75mg/mL細菌コラゲナーゼ、1.25mg/mLヒアルロニダーゼ、および0.1mg/mL DNアーゼIを添加したリヒターの改良MEMインシュリン培地(RPMI)を含む、HEPES)が入った50mL遠心分離管中で、室温で3時間、インキュベートする。インキュベーション後、組織を、10回を上下にピペッティングすることによって、機械的に解離する。細胞懸濁液を、無菌ナイロンメッシュによってろ過して、組織断片を除去し、室温で10分間、400×gで遠心分離する。上清を廃棄し、細胞ペレットを、10mlの培地(間葉系幹細胞増殖培地、または10%FBS添加DMEM等)中に再懸濁させ、75cm2培養皿に移す。細胞を、37℃で、5%CO2インキュベーターで培養し、培地を24時間後に交換して、非接着性物質を除去する。
毛乳頭細胞は、顕微解剖によってヒト頭皮試料から単離し、その後、37℃で30分間、穏やかな撹拌によって、コラゲナーゼによって処理することができる。毛乳頭細胞の富化は、トルイジンブルー染色を使用するか、または、細胞核内の桿のための細胞の検査によって、確認することができる。細胞は、2〜3日ごとに交換した、チャンの培地とケラチン細胞調整培地の1:1混合物で増殖させることができる。
ヒト間葉系細胞を、皮膚由来前駆体として、同様の方法を用いて単離する(Biernaskie,J.A.らの文献:「皮膚由来前駆体(SKP)の単離、およびこれらのシュワン細胞子孫の分化と富化(Isolation of skin−derived precursors(SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny)」,Nature protocols 1(6):2803−2812(2006))。簡潔には、ヒト皮膚試料または皮膚腫瘍を、HBSS中で洗浄し、3〜5mm2の大きさの小さな断片に切断し、25mlのブレンドザイム(Blendzyme)溶液(ロッシュ(Roche)社製)を充填した10cmプラスチック組織培養皿で、4℃で24〜48時間、消化する。表皮を、微細なピンセットを使用して、内在する真皮から剥離し、単離した真皮組織を、カミソリ刀を使用して1〜2mm2の断片に細かく切断する。ヒト真皮のこれらの小さな断片を、5〜10mlの新しいブレンドザイム溶液を収容した15ml円錐管に収集する。また、DNアーゼI(1つの400μlアリコート)を懸濁液に加えて、細胞凝集を低減させることもできる。組織の最も効果的な消化のために、試料を、37℃で1〜2時間、穏やかに撹拌することができる。消化終了時に、10%FBS添加20ml洗浄用培地を加えて、ブレンドザイムを不活性化させる。1,200r.p.m.で、6〜8分間、組織試料を遠心分離して、細胞および皮膚断片をすべてペレット化する。酵素および培地を含む上清を廃棄する。新しい洗浄用培地(3〜5ml)を加え、10mlのディスポーザブルプラスチックピペットを使用して、ペレットを解離する。懸濁液を、1,200r.p.mで20秒間、遠心分離して、大きな皮膚断片をペレット化する。上清を、50ml収集管に収集し、冷凍する。組織ペレットを、組織片が厚くなり、細胞がこれ以上する遊離しなくなるまで、粉砕手段を繰り返すための新しい培地中で解離する。解離した細胞懸濁液を、70μm細胞ストレーナを通して50ml円錐管に入れ、1,200r.p.m.で7分間、遠心分離する。細胞ペレットを、2%B27添加物(インビトロゲン社製)添加洗浄用培地中に再懸濁させる。再懸濁液の容積は、ペレットのサイズに依存して、5ml〜20mlの媒体であり、細胞収率の定量化を簡潔にするために調整することができる。解離した真皮細胞を、75cm2フラスコで、30mlの増殖培地(0.1%ペニシリン/ストレプトマイシン、40μg/mlフンギゾン、40ng/ml FGF2、20ng/ml EGF、2%B27添加物を含むDMEM/F12(3:1))、および25cm2フラスコで10mlに希釈する。細胞を、球状のコロニーを形成させるために、継代培養なしで、7〜14日間培養し、培地を4〜5日ごとに交換する。
A.遺伝子ノックダウン
ノックダウン遺伝子発現、例えば、TSC1、TSC2、CYLD、LKB1、FLCN、MEN1、NF1、PTEN、PRAS40、4E−BP1、GSK3もしくはDeptor、カスタムクローン化ヘアピンRNA(shRNA)のレンチウイルス粒子、またはpLKO.1−puro−CMV−tGFPベクター(シグマ社製)における非標的shRNA対照を、メーカーの説明書に従って、使用することができる。パイロット試験において、細胞を6穴プレート(2×105細胞/ウエル)に載置し、24時間、10%FBS/DMEMに培養する。培地を、8μg/mlのヘキサジメトリンを添加した、示される遺伝子または対照shRNAレンチウイルス粒子(0、1、2、5、10もしくは20MOI)に対するshRNAを含む、2mlの新しい10%FBS/DMEMと交換し、一晩インキュベートする。ウイルス粒子を含む培地を除去し、細胞を、10〜14日間、プロマイシンによる選択24時間前に、新しい完全培地中で培養する(滴定は、0.5〜10μg/mlのプロマイシンによって96穴プレート中で1×104細胞を処理することによって、使用前に行うことができる)。プロマイシンを含む培地を3日ごとに交換する。プロマイシン耐性細胞コロニーを収集し、更なる分析のために培養する。遺伝子発現を、qRT−PCRまたはウェスタンブロットによって測定する。遺伝子ノックダウン後の細胞を評価するために、形質導入された細胞を、プロマイシン選択後にプールする。形質導入された細胞における標的タンパク質のレベルを、ウェスタンブロットによって測定し、1、10、20、30および40継代培養の対照shRNA細胞と比較する。
ヒト間葉系細胞を、標準手順を用いて、構造的に活性のあるプロモーターの制御下で、mTORネットワークを活性化するか、または毛包関連遺伝子(例えば、Ras、Raf、Mek、Erk、Rsk1、PI3K、Akt1、Akt2、Akt3、Rheb、mTOR、Raptor、Rictor、mLST8、S6K1、リボソームタンパク質S6、SKAR、SREBP1、eIF4e、IKKbeta、Myc、Runx1、またはp27)の安定した発現のために、トランスフェクトすることができる(Ortiz−Urda,S.らの文献:「遺伝子操作線維芽細胞の注入は、再生ヒト表皮水疱症皮膚組織を矯正する(Injection of Genetically Engineered Fibroblasts Corrects Regenerated Human Epidermolysis Bullosa Skin Tissue)」,The Journal of Clinical Investigation 111(2):251−255(2003))。簡潔には、CMV IEプロモーターを使用して、遺伝子を、BglII断片として、285bpのΦC31attB配列を、プラスミドpcDNAattBを作製するバックボーンベクターpcDNA3.1/zeoのBglII部位に挿入することによって、ストレプトマイセスファージΦC31インテグラーゼ支援安定化組込みプラスミドに導入することができる。IRESおよびブラストシジン(blastocidin)の抵抗配列を、pcDNAattBのEcoRV/XbaI部位に挿入され、プラスミドpcDNAattB−IBを形成する、鈍化SnaBI−NheI断片として、pWZL芽細胞ベクターから除去することができる。次いで、示される遺伝子のうちの1つを増幅し、EcoRI、HindIII/EcoRI、およびEcoRI(鈍化)/BamHI断片として、lacZ遺伝子によって、pcDNAattB−IBのEcoRI、HindIII/EcoRI、およびHindIII(鈍化)/BamHI部位にそれぞれクローン化する。この手順は、関心のある遺伝子attBおよびplacZ−attBを含む伝達性プラスミドを作製する。その後、構築されたベクターを、ΦC31インテグラーゼコードプラスミドによってヒト間葉系細胞に同時トランスフェクトする。簡潔には、ヒト間葉系細胞を、改良ポリブレン衝撃を用いて、pIntおよび関心のある遺伝子attBおよびplacZ−attBによってトランスフェクトする。初期ヒト間葉系細胞を、70〜80%の集密状態まで、35mmプレートに培養し、次いで、改良ポリブレン衝撃によってトランスフェクトする。ポリブレントランスフェクションにおいて、760mlの増殖培地を、トランスフェクトされるプラスミドと混合し、この混合物を激しく撹拌する。HBSS中3.8mlの1mg/mlの臭化ヘキサジメトリン(アルドリッチケミカル(Aldrich Chemical)社製、ミルウォーキー、ウイスコンシン州)を加え、再度撹拌する。この混合物を6時間、細胞に被覆する。培地を吸引した後、増殖培地混合物中で28%DMSO(シグマケミカル社製、セントルイス、ミズーリ州)を細胞に適用する。細胞を90秒間インキュベートした後、DMSOを吸引し、10%仔ウシ血清を含むPBSと交換する。プレートを2回洗浄し、細胞を、37℃で一晩、新しい増殖培地にインキュベートする。選択のために、トランスフェクション3日後の細胞に、培地中でブラスチシジン(4μg/ml)を10日間供する。遺伝子導入効率を、免疫蛍光顕微鏡検査法およびイムノブロットアッセイによって確認する。10日間の選択後、間葉系細胞コロニーをトリプシン処理し、限界希釈法でサブクローン化して、高い増殖性クローンを得る。
mTORネットワーク活性化または毛包関連タンパク質を、記載する方法を用いてヒト間葉系細胞に送達することができる(Weill,C.O.らの文献:「細胞内タンパク質送達のための実用的アプローチ(A Practical Approach for Intracellular Protein Delivery)」,Cytotechnology 56(1),41−48(2008))。細胞を、タンパク質送達時に、およそ70〜80%の集密度に到達させるために、載置する。24穴プレートの1ウエルに、0.5〜8μgの精製タンパク質を、滅菌条件下で、1.5mlのマイクロ遠心管中の100μlのHepesバッファー(20mM、pH7.4)で希釈する。それぞれの遠心管で、1〜8μlのタンパク質送達試薬プルシン(PULSin)(商標)(イルキルシュ(Illkirch)社製、フランス)を、タンパク質溶液に加える。ボルテックスによる簡単な均質化後、タンパク質/試薬混合物を、室温で15分間、インキュベートして、複合体を形成させる。細胞を1mlのPBSによって洗浄し、900μlの無血清培地を、それぞれのウエルに加える。それぞれのウエルへの複合体の添加後、プレートを、穏やかに混合し、さらに37℃でインキュベートする。4時間後、インキュベートした培地を除去し、1mlの新しい完全培地(血清を含む)と交換する。タンパク質送達を、免疫細胞化学検査によって、即時にまたは後で分析する。
A.細胞マーカーに基づく分離
実施例3Bにおける一方のプロトコールに説明するように、皮膚組織を調製する。細胞を、0.25%トリプシンおよび5mM EDTA(シグマ社製)を含む溶液を使用して、7日後に採取し、細胞マーカーCD−10に基づく髪誘導細胞のために富化する。FITC標識抗CD−10抗体(イーバイオサイエンス(eBioscience)社製)を、4℃で30分間、線維芽細胞とインキュベートする。0.1%BSA添加PBSによって細胞を洗浄後、BDバイオサイエンス社製のFACSAriaセルソーターを使用して、細胞を選別する。
BMP2、4、5もしくは6、Wnt−3a、Wnt−10b、FGF2、KGF、または他のもの等の成長因子を、成長培地に加えて、毛乳頭細胞を含む髪誘導細胞を維持し富化することができる。毛乳頭細胞を、増加したWNTタンパク質、またはWNTによって促進されたシグナル伝達の効果を模倣する薬剤の存在下で培養する。本方法は、上に論じる、WNTシグナリングが髪形態形成時に活性があるという発見に基づく(Kishimoto,J.らの文献:「Wntシグナリングは、毛乳頭の髪誘導活性を維持する(Wnt Signaling Maintains the Hair−Inducing Activity of the Dermal Papilla,)」,Genes & Development 14(10):1181−1185(2000);Shimizu,H.らの文献:「ベータ−カテニン経路を介するWntシグナリングは、維持するのに十分であるが、回復しない、毛乳頭細胞の成長期の特性(Wnt Signaling Through the Beta−Catenin Pathway is Sufficient to Maintain,but Not Restore,Anagen−Phase Characteristics of Dermal Papilla Cells)」,The Journal of Investigative Dermatology 122(2):239−245(2004))。
ヒトDP細胞の毛包誘導潜在能は、次に示す培地のうちの1つで維持することができる。
表皮細胞を次に示す供給源から単離することができる:患者皮膚または粘膜(自家)、ドナー皮膚または粘膜(同種異型)、表皮細胞系、幹細胞由来の表皮細胞、および初期または継代培養された表皮細胞。
A.細胞接着
新生児または成人のヒト皮膚の幹細胞集団を、以前に報告された方法に従って、迅速な接着によって富化することができる。簡潔には、100mm細菌プラスチック皿を、100μg/mlのIV型コラーゲンでコーティングし、0.5mg/mlの熱変性BSAと37℃で1時間、インキュベートし、無血清培地中で洗浄する。ケラチン細胞を、1〜5×103細胞/mlの密度で、無血清培地中に再懸濁させる。10mlの細胞懸濁液を、IV型コラーゲンをコーティングした皿に加え、この皿を、5台の顕微鏡のあるインキュベーターに戻す。接着した細胞を迅速に採取し、0.4mg/mlヒドロコルチゾン(シグマ社製)、5mg/mlトランスフェリン(シグマ社製)、5mg/mlインシュリン(シグマ社製)、100IU/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、10%FCS、10ng/ml上皮成長因子(EGF)(シグマ社製)、および10ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)(ギブコ(Gibco))を添加した、FAD(DMEM/F12 3:1、v/v、ギブコ)中の更なる培養物において、1×105細胞で再度載置する。皿を、37℃、100%の湿度、および5%CO2でインキュベーターに載置し、培地を2〜3日ごとに交換する。細胞外マトリックスでコーティングした培養皿に多く接着する、表皮幹細胞は、毛包に形成する高い潜在能を有する。
膨出細胞は、磁性ビーズ系によって単離することができる。2つの磁性ビーズ系を組み合わせて、中間毛包懸濁液から膨出ORS細胞を単離する。最初に、毛包細胞を、4℃で20分間、PE結合抗ヒトCD24、CD34、CD71、およびCD146抗体(BNC)のカクテルによって染色する。洗浄後、毛包細胞を、4℃で25分間、抗PEマイクロビーズ(ミルテニイバイオテック(Miltenyi Biotec)社製)とインキュベートする。その後、PE陽性非膨出細胞を、小型MACS MSカラム(ミルテニイバイオテック社製)を使用して、磁力分離によって除去する。除去手順を3〜5回繰り返して、最大の消耗を確認する。次に、中間毛包細胞を、4℃で20分間、精製した抗ヒトCD200マウスmAbとインキュベートし、洗浄し、4℃で30分間、傾かせて、ダイナビーズ(Dynabeads)M−450ヒツジ抗マウスIgG磁性ビーズ(ダイナルバイオテック(Dynal Biotech)社製)とインキュベートする。その後、正の選別を、MPC−L磁性粒子コンセントレーター(ダイナルバイオテック社製)によって行い、CD200陽性細胞を得る。CD59陽性細胞を、正の選別対照として同様に回収してもよい。膨出細胞を富化する表皮細胞の調製によって、高い毛包形成能を有することが期待される。
A.皮膚代替物
三次元インビトロ構築物を、本明細書に記載するように、確立された改良法を用いて、移植のために調製する。簡潔には、間葉系細胞を、10%FBS/DMEM中の1mg/ml I型コラーゲン(下記のように、ラットまたはウシ)と混合し、1cm2当たり1.5×105細胞の密度で、6穴トランスウエルプレート(コーニング社製、コーニング、ニューヨーク州)に加える。真皮等価物を、上部の1×106のケラチン細胞を等分する4日前に、10%FBS/DMEM中で培養する。構築物を、0.1%FBSを含む、DMEMとハムのF12(3:1)(ギブコ(GIBCO)/インビトロゲン社製、グランドアイランド、ニューヨーク州)の混合物中で2日間、浸漬させて培養し、その後、ケラチン細胞を気液界面に供し、移植前にさらに2日間、1%FBSを含む、DMEMとハムのF12(3:1)の混合物中で培養する。
注入のための細胞凝集物を、懸滴法を用いて形成することができる(Qiao J.らの文献:「培養ヒト頭皮毛乳頭細胞によって誘導された毛包新生(Hair follicle neogenesis induced by cultured human scalp dermal papilla cells)」、Regen Med 4(5):667−76(2009))。簡潔には、ヒト間葉系細胞とケラチン細胞の混合物(10:1、5:1、1:1、1:5、または1:10)を、0.24%メチルセルロースを含むチャンの培地中に懸濁させる。100mmペトリ皿の底部において、細胞を、20μlの液滴(液滴はそれぞれ、4×104細胞を含む)に適用する。液滴が上下逆さまに懸滴するように、ペトリ皿を逆さまにする。懸濁した液滴を、37℃、5%CO2で、インキュベーターでインキュベートする。凝集物の形成を18〜20時間以内に終了する。形成において、凝集物を、150μlチャンの培地を収容した96穴丸底アッセイプレートのウエルに別々に移す。ウエルを、0.24%メチルセルロース培地で予め覆って、髪の原型(proto−hair)の付着を防ぐ。培地を2〜3日毎に交換する。
注入のための生物分解性マイクロスフィアを、従来の油/水エマルション、および溶媒蒸発/抽出法を用いて、75:25 PLGA(分子量=100,000Da、バーミンガムポリマーズ(Birmingham Polymers)社製、バーミンガム、アラバマ州)から製造する。簡潔には、600mgPLGAを、12mlの塩化メチレン中に溶解し、0.5%(w/v)ポリビニルアルコール(分子量=30,000〜70,000Da、シグマ社製)の400ml水溶液に加え、室温で一晩、激しく撹拌する。マイクロスフィアを遠心分離によって回収し、蒸留水によって3回洗浄し、50〜200μm径のサイズに濾す。マイクロスフィアを凍結乾燥し、6時間、紫外線光によって殺菌する。ヒト間葉系細胞(2.5×107細胞)、およびケラチン細胞(6×106の細胞)を、ケラチン細胞のための10ng/mlのEGFを含む30mlの無血清KGM、または間葉系細胞のための10%(v/v)FBSを含むDMEM/F12を収容した、スピナーフラスコ(ベルコガラス(Bellco Glass)社製、ヴァインランド、ニュージャージー州)中に、PLGAマイクロスフィア(1μgマイクロスフィア/105細胞)と共に載置し、50rpmで2週間、培養する。培地を1日おきに交換する。細胞凝集物を沈降させ、16mlの培養上清を回収し、遠心分離し、15mlの上清を除去し、また、15mlの新しい培地を、1mlの残存上清中の遠心分離した細胞に加える。新しい培地中の細胞をスピナーフラスコに移す。または、アルギン酸ナトリウム中で細胞を懸濁させ、その後、Lin C.M.らの文献:「マイクロカプセル化ヒト髪毛乳頭細胞:毛乳頭の代わりになるか?(Microencapsulated human hair dermal papilla cells: a substitute for dermal papilla?)」,Arch Dermatol Res.300(9):531−5(2008)に記載する、高電圧電気液滴発生器を使用して、球状液滴を形成することによって、細胞集塊を形成してもよい。
生体力学特性、創傷治癒、および長期毛包再生成のための本発明の皮膚代替物の評価
本発明の皮膚代替物を、生体力学特性、創傷治癒、および長期毛包再生成に関して試験することができる。
A.複合体の配置
6〜8週齢の老齢の雌Cr:NIH(S)−nu/nuマウス(FCRDC、フレデリック、メリーランド州)に、O2とイソフルランの混合物(2〜4%)を使用して、麻酔をかけた。マウス背部の移植領域を慎重に評価し、皮膚を、ポビジンおよび70%エタノールによって洗浄後、彎鋏を使用して除去した。構築物を、正確な解剖配向で移植片面に配置し、無菌ヘトロラタムガーゼで被覆し、包帯で固定した。マウスを再び目覚めさせた後、無菌ケージに移した。包帯を週2回交換し、4週後に除去した。マウスを移植4〜18週後に屠殺する。
細胞を、Ortiz−Urdaらの文献(上述する)に記載するものと同様の方法を用いて、ヒト皮膚に直接注入する。マウス皮膚へのヒト間葉系細胞の注入において、6〜8週齢の老齢の雌Cr:NIH(S)−nu/nuマウスに、30ゲージ針を使用して、100μl PBS中に再懸濁させた106の細胞を皮内に注入する。注入を、最初に皮膚を貫通し、その後、表面後方に針を戻し、細胞を可能な限り皮相に注入することによって、行う。これによって、注入領域の中心に境界明瞭な丘疹が形成する。注入8〜16週後に、生体組織検査および分析をマウス皮膚で行う。
麻酔後、およそ0.5〜1.0mmの幅および長さの小さな切開を、27ゲージ針を使用して作製する。単一培養した凝集物(髪の原型)を、各切開内の浅い位置に挿入する。挿入後、切開を治癒ために残す。
全層または部分層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、および完全または部分的な脱毛を示す、患者に、標準術前評価を行って、手術危険度を決定する。皮膚代替物の適用部位には、軟骨、腱、または神経ではなく、真皮、筋膜、筋肉、肉芽組織、骨膜、軟骨膜、腱周囲、および神経周膜等の十分な血液供給がある。創傷は、壊死組織がないことを要する。創傷は、1平方センチメートル当たり100,000未満の菌数の細菌によって比較的汚染されていないことを要する。十分な創傷面は、創面切除、包帯交換、および全身的または局所的抗生物質を必要とする。局所的にまたは全身に投与される、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス物質を、皮膚代替物の投与前後の一定期間(例えば、1週間)、使用して、感染の危険性を低減させることができる。創傷の真空支援閉鎖を用いて、移植前に、創傷面の特性を改良することができ、また、移植後にこれを用いることができる。
Claims (16)
- 改変されたヒト間葉系細胞を含む組成物であって、前記改変されたヒト間葉系細胞が、野生型のヒト間葉系細胞と比較して、TSC1、TSC2、およびFLCNのうちの少なくとも1つが少なくとも90%低下し、ここで、組成物がヒト上皮細胞を含まないが、ヒト毛包を誘導することができる、上記組成物。
- Ras、Raf、Mek、Erk、Rsk1、PI3K、Akt1、Akt2、Akt3、Rheb、mTOR、Raptor、Rictor、mLST8、S6K1、リボソームタンパク質S6、SKAR、SREBP1、eIF4e、IKKbeta、Myc、Runx1、CD133、CD10、ネスチン、アルカリホスファターゼ、およびp27のうちの少なくとも1つが、アップレギュレートされ、および/または
CYLD、MEN1、NF1、PTEN、PRAS40、4E−BP1、GSK3、およびDeptorのうちの少なくとも1つが、ダウンレギュレートされる、
請求項1記載の組成物。 - 前記改変されたヒト間葉系細胞が、バート−ホッグ−デューベ症候群、ブルック−スピーグラー症候群、カウデン症候群、多発性内分泌腺腫1型、神経線維腫症、または複合型結節硬化症に関連する腫瘍由来である、請求項1記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が、線維血管腫、線維毛包腫、線維性斑、前額部斑、毛包母斑、インフンディブローマ、イスシミコーマ、毛包周囲線維腫、脂腺母斑、器官母斑、汗管腫、粒起革様斑、毛盤腫、毛髪上皮腫、毛芽細胞腫、毛根鞘腫、毛包腺腫、炎症性硬結、または爪周囲線維腫由来である、請求項1記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が、TSC1、TSC2、またはFLCNに対するsiRNA、shRNA、またはmiRNAを含む、野生型のヒト間葉系細胞である、請求項1記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が、マトリックスを備える、請求項1記載の組成物。
- 前記マトリックスが、コラーゲンマトリックス、または基質マトリックスである、請求項6記載の組成物。
- 前記マトリックスが、I型コラーゲンマトリックスである、請求項7記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が、真皮線維芽細胞、毛乳頭細胞、表皮鞘細胞、または間葉系幹細胞である、請求項1記載の組成物。
- ヒト毛包を誘導することができる細胞の、それを必要とする患者への移植に使用するための皮膚移植用製剤または皮内注射用製剤を製造するための請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記患者が、部分層の皮膚欠損、全層の皮膚欠損、創傷、火傷、傷跡、または脱毛の患者である、請求項10記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が患者由来である、請求項10または11記載の組成物。
- 前記組成物がエクリン腺を誘導する、請求項10〜12のいずれか1項記載の組成物。
- 前記組成物が皮脂腺を誘導する、請求項10〜13のいずれか1項記載の組成物。
- 前記改変されたヒト間葉系細胞が、マイクロスフィア中に存在する、請求項1〜14のいずれか1項記載の組成物。
- 前記マイクロスフィアが、毛乳頭培地とケラチン細胞無血清培地の1:1混合物中に、新生児包皮線維芽細胞と新生児包皮ケラチン細胞(それぞれ最大約30,000の細胞)の混合物を含む細胞集塊を含み、前記細胞集塊は、最大約4週間、インキュベートされる、請求項15記載の組成物。
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