JP5154434B2 - 非無機化(non‐mineralized)結合組織の工学のためのビブリオ・ディアボリカス(Vibriodiabolicus)種により分泌される多糖の使用 - Google Patents
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Description
[(-3)-DGlcNacβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGalNacα(1-)]n
からなる原初直鎖反復オシド配列により特徴づけられる。
[(-3)-DGlcNacβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGalNacα(1-)]
を含む直鎖状反復オシド配列により特徴づけられる多糖が、以下の特性を有していることを示した。すなわち:線維芽細胞株の選択を誘導し、細胞外マトリックスにおける線維芽細胞の動態化および増殖を刺激し、コラーゲンの線維化を加速し、そして細胞外マトリックスの再構成を促進する。
[(-3)-DGlcNacβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGalNacα(1-)]
により特徴づけられる、多糖の使用、またはこの多糖の塩の使用である。
[(-3)-DGlcNacβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGalNacα(1-)]
を含む直鎖状反復オシド配列により特徴づけられる多糖、またはこの多糖の塩を含むコラーゲンマトリックスである。
<1.1 ビブリオ・ディアボリカス(HE800株)の培養からのエキソ多糖HE800の調製>
HE800を調製する方法は以下の文献に記載されている:国際公開特許番号98/38327号、Raguenes et al., Int J Syst Bact, 1997, 47, 989-995 and Rougeaux et al., Carbohyd. Res., 1999, 322, 40-45。
30 g/lグルコースで富栄養化した2216E培地[Oppenheimer, J. Mar. Res. 11, 10-18, (1952)]上でHE800株を培養する。30°Cで、およびpH 7.4で、1リットルの2216E-グルコース培地を含む2リットル培養槽中で生産を実行する。48時間の培養後、マストは低粘度(60 rpmで40センチポアズのオーダー)を有する。
20,000 gで 2時間の遠心により細菌をマストから分離し、その後多糖を上清より純粋エタノールで沈殿させ、その後Talmontら[Food Hydrocolloids 5, 171-172 (1991)]またはVincentら[Appl. Environ. Microbiol., 60, 4134-4141 (1994)]により記載された方法により、エタノールの割合を増加させつつ複数回のエタノール/水洗浄を実行する。取得される多糖を30°Cで乾燥させ、周囲温度で保存する。そのようにして、培養1リットルあたり2.5 gの精製多糖が取得された。
真皮起源の線維芽細胞、および歯肉起源の線維芽細胞について実験を実行した。これら2種類の間葉細胞は、HE800に関して非常に類似した挙動をとり;従って、歯肉線維芽細胞で取得される結果を真皮線維芽細胞により推定することができる。
以下を含むDulbecco MEM Glutamax Iからなる「完全」培地中で培養を実行する:100 U/mlペニシリン、 100 μg/mlストレプトマイシン、および2 μg/ml ファンギゾン(Gibco BRL Cergy Pontoise, France)、ウシ胎児血清(FCS)で補完される、または補完されない(欠損培地(deficient medium))。
使用される真皮生検を、医師により取得されてから3時間以内に培養中に設置する。使用される試料を、臨床的に正常な子供の陰茎包皮より、割礼後取得する。病的状態でない若い患者(年齢30歳より若い)より歯肉生検を取得する。歯列矯正の理由から抽出される、小臼歯に付着した粘性物質より生検を取得する。さらに、これらの粘性物質は医師により臨床的に正常であると言明される。これらの生検は、抽出中に分離され、本発明の改変を必要としない組織残余物である。
真皮および歯肉試料を、通常より高い濃度の抗生物質(6×ペニシリン、4×ストレプトマイシン、2×ファンギゾン)を含むDMEM培地中で2回洗浄し、その後それらを非常に小さい外植片(〜2 mm2)に細かく切断する。無菌パスツールピペットを使用して、または外科用メスのチップで、25 cm2培養フラスコ中で、プラスチックの実質的側面にこれらの外植片を設置する。その後ディッシュを立たせ、外植片がプラスチックに接着し、乾燥するように、15分間この位置のままにしておく。
<1.3.1 HE800膜の調製および線維芽細胞の培養>
2 mg/ml HE800溶液200 μlを培養ウェル(24ウェルディッシュ、2 cm2)の底に沈着させることにより界面活性化(Surfacting)を実行する。37°Cに設定されるホットプレート上の培養フードの下に少なくとも5時間培養ディッシュを設置する。蒸発後、HE800膜がディッシュの底に形成する。ウェルあたり10,000個の細胞の割合で歯肉線維芽細胞を播種し、7日間培養する。毎日細胞をカウントし、一部のウェルを形態研究および平滑筋α-アクチンの免疫検出のために固定する。
使用されるコラーゲンはラットの尾(Institut Jacques Boy, Reims)より取得される酸可溶性コラーゲンタイプI(2 mg/ml)である。コラーゲン(総計40 μg)およびHE800 (総計5、50、または200 μg)の混合物200 μlを沈着させることにより培養ディッシュの界面活性化を実行する。
コラーゲン膜および合成膜を無水エタノールにより-20°Cで固定し、その後シリウスレッド(Junquera染色、コラーゲン特異的)で染色するために再水和する。それゆえ、シリウスレッド中で全てのコラーゲンが透過光下で染色されるが、正確に線維化されたコラーゲンのみが偏光を逸らせることができる。
コラーゲン膜を形成するために使用されたものと同じコラーゲンIで格子を作製する。コラーゲン(3 mg/格子)の酸溶液を中和した後、細胞を含み、重合を実行しているゲルを直径5 cmのペトリディッシュに注ぐ。細胞を添加する前に、格子あたり150 μg, 300 μgまたは600 μg(それぞれ、コラーゲン総量の5%, 10%および20%)の割合でHE800をコラーゲンに添加する。
格子を調製するための全ての工程は氷中で実行される。
- 1時間後、格子を縁から分離させるためにディッシュをゆっくりと振盪する。
- 培地を毎週交換する。
種々の培養時間(11日および40日)において、格子を再生し、パラホルムアルデヒド中に固定し、その後パラフィン組み込みのために調製する。その後厚さ7 μmの切片をミクロトーム上で切断する。これらの切片の特異的な染色により、再構成結合組織の構造および細胞性を観察および研究することが可能となる。パラメーターの一部を引き続き画像解析により研究し、そして定量化する。シリウスレッドで染色後、コラーゲン線維化の質を観察し;ヘマルン-エオシン(hemalun-eosin)で切片を染色した後、画像解析により同等結合組織の細胞性を評価することができるであろう。
ヘマルン-エオシン染色により、細胞を囲むマトリックスから細胞を識別することが可能となる。これは、細胞質および細胞外構造(エオシン好性)を程度の差はあるがエオシンが強く赤色に染色する一方、ヘマルンが細胞核を濃い藍色に染色するためである。そのようにして作り出されるコントラストにより、半自動画像解析装置に接続されるCDDカメラを備える顕微鏡下で各細胞を識別することが可能となる。その後、顕微鏡拡大により明確化される視野の中にある細胞を、11日および40日に格子中でカウントする。切片ごとに約10の視野を解析した。そして、2群の細胞をその地理的状況により識別することができる:第一に、格子(コラーゲンマトリックス)の内部にある細胞、および第二に、格子の縁にある細胞。同等結合組織の細胞性を測定するために、各格子は円柱状であると考えられ、格子の縁は、格子の全容量の2%に相当する厚さ10 μmの王冠状のもの(2細胞層の直径に同等である)として定義される。
固定細胞を70%エタノール中(20分)で再透過処理し、その後PBS中(10分)で再水和する。内因性ペルオキシダーゼを、メタノール(30%)、H2O2 (0.3%)溶液で阻害する。この操作の後、PBS(2分)で洗浄し、その後非特異的抗原性部位をPBS/1%スキムミルク溶液(1時間)でブロッキングする。その後培養物を抗ヒトα-アクチン一次抗体(マウスIgG)とインキュベート(1/30; 50分)し、その後PBS (3 × 10分)で洗浄する。その後細胞を、暗下で60分間、ビオチン化抗マウスIgG抗体(1/200)とインキュベートし、その後ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(1/200)とインキュベートした。
<2.1 HE800膜上で培養される歯肉線維芽細胞の増殖>
ディッシュの底に多糖膜を形成するために、培養表面をHE800で処理した。培養の最初の時期(2日目および4日目)の間、HE800被覆ディッシュ中に播種される細胞の数は、対照ディッシュ中の細胞数よりもはるかに少ないことが観察される(表1)。一方、実験の最後の時期、これらの結果が逆となることが注目される(表1および2)。提示される曲線は、HE800膜上で培養される細胞は、対数増殖期に入る前の、プラスチック上で培養される細胞により示されるよりも長い遅延段階を維持することを示す。さらに、対照培養における細胞の数が実験の最終時期にプラトーに達するにも関わらず(表3を参照)、HE800膜上の培養物は増殖し続ける。培養中または細胞の固定後に行われる観察により、種々の培養条件下で示される細胞の挙動に関する仮説を提唱することが可能となる。
- 対照では、これらの微小線維を発現しない細胞に多くの陽性細胞が隣接している。
- HE800存在下の培養物では、中央環状形状で存在する細胞は平滑筋α-アクチンを発現せず;一方、このアクチンを発現する細胞をディッシュの縁で見出すことができる。
<2.2.1 最初の観察>
コラーゲンおよびエキソ多糖HE800の両方を含む膜を調製するために、培養ディッシュに注ぐ前に、HE800およびコラーゲンIの溶液を前もって混合する。驚くべきことに、細菌エキソ多糖をコラーゲン溶液に添加することにより、密集した、白色凝集が現れることが注目された。この凝集を、組織学的スライド上に広げ、その後コラーゲン特異的染料であるシリウスレッドで染色することができた。これらの組織学的スライドは、スライド上に広げられる物質が効率的にシリウスレッドで染色されることを示す。さらに、偏光を種々の方向に散逸させる物質が観察されることは、線維状形態にあるコラーゲンの存在を明確に示す。
堆積される種々の膜は、以下よりなる:
(1) コラーゲン(40 μg)
(2) コラーゲン(40 μg) + HE800 (50 μg)
(3) コラーゲン(40 μg) + HE800 (200 μg)。
結合組織で観察される細胞/マトリックス相互作用を可能な限り近く再現するために、コラーゲンマトリックス(三次元培養モデル)中で細胞を培養する。これらの格子または同等結合組織はコラーゲンI単独(対照)、または種々の割合(格子中に含まれるコラーゲンの量、すなわち300 μg, 150 μgおよび75 μgに対して、EPSの量:それぞれ20%, 10%および5%)にあるコラーゲンIおよびHE800からなる。
研究される最初のパラメーターは格子が収縮する速度である:対照格子の収縮曲線と、HE800を含む格子の収縮曲線は類似している。この類似性に関わらず、培養の早期の間、対照格子よりも遅い収縮速度をHE800格子が有することが注目される。11日目の後、格子の収縮はほぼ完了する。
各格子中に存在する細胞の数は、2回の培養において、細胞180,000個と250,000個の間で変動する。縁にある細胞の数は、全細胞数の2%から12%に相当する。これらのデータは、この培養モデルに関する文献に記載されていることと矛盾しない。表4、5、および6の結果は、格子全体およびその種々の領域に存在する、単位体積(mm3)あたりの細胞の数を示す。
- 培養11日目、縁部王冠の細胞濃度は、格子の内部の濃度よりも4倍高く、対照同等結合組織とHE800を含む同等結合組織の間で少量の変動のみを示す(表6)。
- 培養40日目、縁部の細胞性において大幅な減退が観察される。この減退は対照格子について40%のみである一方、HE800を含む格子について減退は100%から250%に達する。対照格子の細胞濃度は、内部よりも縁部のほうが3倍高く(表4および6);一方、この濃度はHE800格子に匹敵する。
<2.4.3.1 光子顕微鏡>
シリウスレッド染色(Junquera染色)により、コラーゲンを特異的に染色することが可能となり;例えば皮膚において、そのコラーゲンは赤色のゆるい線維状構造の形態に見える。
11日間培養された同等結合組織において電子顕微鏡を実行した。対照または種々の濃度にあるHE800存在下で形成される格子のいずれにおいても、細胞が良好な微細構造状態を有することが見られた
Claims (22)
- 非無機化結合組織の工学のための、外因性コラーゲン及び多糖又はその塩を含むマトリックスの使用であって、多糖がビブリオ・ディアボリカス(Vibrio diabolicus)種により分泌され、500,000g/molと2,000,000g/molの間の重量平均モル質量を有し、以下の4オシド残基:
[(-3)-DGlcNacβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGlcAβ(1-4)DGalNacα(1-)]
を含む直鎖状反復オシド配列により特徴づけられることを特徴とし、マトリックスにおいて、コラーゲンが多糖に共有結合で架橋されていない、使用。 - 多糖が700,000g/molと900,000g/molの間の重量平均モル質量を有することを特徴とする、請求項1に記載の使用。
- コラーゲンが、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプII、コラーゲンタイプIII、コラーゲンタイプV、コラーゲンタイプXI、及びそれらの混合物からなる群から選択される線維質コラーゲンであることを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
- コラーゲンがコラーゲンタイプIであることを特徴とする、請求項3に記載の使用。
- 1種類またはそれ以上の架橋剤を使用した架橋によって多糖が不溶化されたことを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
- 間葉細胞によるマトリックスのコロニー形成を促進する少なくとも1種類の増殖因子をマトリックスがさらに含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
- 少なくとも1種類の増殖因子が、TGF-β、PDGF、FGF、VEGF、BMPおよびCTGFからなる群より選択されることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
- マトリックスがさらに間葉細胞を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
- 間葉細胞が、髄質、あるいは循環血液、線維芽細胞、または軟骨細胞に由来する細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の使用。
- 間葉細胞が真皮線維芽細胞であることを特徴とする、請求項9に記載の使用。
- マトリックスがさらにケラチノサイトを含む、請求項10に記載の使用。
- 間葉細胞が軟骨細胞であることを特徴とする、請求項8または9に記載の使用。
- 請求項8から12のいずれか一項に規定されたマトリックスを含む、非無機化結合組織代替物。
- 腱代替物であることを特徴とする、請求項13に記載の非無機化結合組織代替物。
- 請求項10に規定されたマトリックスを含む、真皮代替物。
- 請求項11に規定されたマトリックスを含む、皮膚代替物。
- 請求項12に規定されたマトリックスを含む、軟骨代替物。
- 請求項1から7のいずれか一項に規定されたマトリックスを含む、医療用具またはインプラント。
- 包帯であることを特徴とする、請求項18に記載の医療用具。
- 請求項1から7のいずれか一項に規定されたマトリックス上で間葉細胞を培養することを特徴とする、間葉細胞のin vitro培養のための方法。
- 間葉細胞が線維芽細胞である、請求項20に記載の方法。
- 非無機化結合組織代替物、または組織工学用のインプラントの生産のための、請求項1から12のいずれか一項に規定されたマトリックスの使用。
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