CN103622764A - 一种组织工程软骨的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织工程软骨的构建方法，所述方法包括步骤：（1）在Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片上加软骨细胞悬液；（2）在步骤（1）产生的软骨细胞悬液上加Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片；（3）重复步骤（1）和（2），得到复合物；（4）体外培养复合物得到组织工程软骨。

Description

一种组织工程软骨的构建方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种应用可降解人工合成膜片材料构建组织工程软骨。
背景技术
软骨是一种无血管的组织，因其自我修复能力低下，所以软骨损伤或畸形一直以来都是临床治疗的一大难题。组织工程技术为软骨缺损修复提供了一种全新的治疗手段。可降解生物支架材料是组织工程的基本要素之一，目前构建软骨常用的支架材料有聚乳酸（polyglycolicacid，PGA）、I型胶原、软骨脱细胞基质等，其中软骨脱细胞基质因其良好的细胞相容性，无免疫原性等优点而成为近年研究的热点。软骨脱细胞基质具有成分天然、力学强度与正常软骨组织相似等优点，然而由于软骨是非常致密的结缔组织，因此存在脱细胞不全和新生细胞难以长入两大障碍。为了解决上述难题，人们尝试了多种方法，但效果都不理想。但大块软骨存在脱细胞不彻底以及细胞再次长入困难等问题，同时软骨脱细胞膜片还存在制备过程复杂，不易标准化等问题。
因此，本领域迫切需要提供一种新的构建组织工程软骨的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种新的构建组织工程软骨的方法。
本发明提供了一种组织工程软骨的构建方法，所述方法包括步骤：
（1）在Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片上加软骨细胞悬液；
（2）在步骤（1）产生的软骨细胞悬液上加Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片；
（3）重复步骤（1）和（2），得到复合物；
（4）体外培养复合物得到组织工程软骨。
在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90。
在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为70∶30-30∶70；更优选为70∶30-50∶50。
在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的横切面为直径7-12mm的圆形。
在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的厚度为10-30μm。
在另一优选例中，所述软骨细胞悬液中的软骨细胞浓度为50-150×106/ml。
在另一优选例中，每次所加软骨细胞悬液为1-10μl。
在另一优选例中，步骤（3）中重复步骤（1）和（2）5-15次。
在另一优选例中，步骤（3）得到的复合物上覆盖培养液后再进行体外培养。
在另一优选例中，所述软骨细胞来自全身软骨组织。
在另一优选例中，所述全身软管组织是耳廓、肋骨、或关节等。
据此，本发明提供了一种新的构建组织工程软骨的方法。
附图说明
图1是三明治法构建软骨组织操作示意图。
图2显示了三种比例的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜材料的大体观，电镜微观结构。
图3显示了经体外培养1w+体内培养12w的组织工程软骨大体观（A），细胞材料4h粘附率（B），体外培养1w+体内培养3w的组织工程软骨生物力学分析（C）情况。
图4显示了三种材料体内外构建组织工程软骨的组织学分析；拼图标尺为500μm，放大图片标尺为100μm。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现可以使用一定比例的Gelatin（明胶）/PCL（polycaprolactone，聚己酸丙酯）纳米纤维材料作为组织工程支架材料，并且通过“三明治法”将Gelatin/PCL纳米纤维材料（膜片形式）和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加所得到的复合物，经过体外培养可以有效构建组织工程软骨。
本发明提供的构建组织工程软骨的方法是将种子细胞接种于生物可降解材料上形成种子细胞-材料复合物，然后在体外培养条件下（例如在常规的含5%CO2的37℃培养箱中）进行体外培养可以得到可用于移植的组织工程化软骨。也可以进一步地，在体外培养后植入体内使进一步地生长。在本发明的一个实施例中，是在体外培养后植入哺乳动物皮下。
在本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，所使用的生物可降解材料是Gelatin/PCL电纺纳米纤维，较佳地是Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜，其中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90，优选70∶30-30∶70，更优选70∶30-50∶50。
如本文所用，“Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜”是一种电纺纳米纤维材料，由Gelatin和PCL构成，成膜状，厚度10-30μm，优选横切面为直径7-12mm的圆形。
本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，所使用的种子细胞是软骨细胞，可以使用本领域的常规方法获得，例如但不限于，酶消化法从软骨组织块中消化获得细胞。
本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，种子细胞-材料复合物的形成过程是将Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加。细胞悬液中软骨细胞的浓度为50-150×106/ml，优选为80-120×106/ml；每层细胞悬液1-10μl，优选为3-7μl；叠加层数为10-30层，优选为15-25层。
在本发明的一个实施例中，通过上述层层叠加的方式获得复合物后，静置0.5-2小时，将含有5-15%FBS的高糖DMEM培养液覆盖复合物，再进行体外培养。
在本发明的一个实施例中，体外培养0.5-1.5周后植入哺乳动物皮下2-4周。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的构建方法可以依据对于Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的形状或形态的处理获得特定大小、特定形状的软骨。
2、本发明证实了膜片技术构建软骨的可行性，理论上人工合成膜片只要具备良好的生物相容性、可降解性、通透性以及一定的力学强度，无论是用电纺丝技术制备还是其他技术制备的膜性材料，都适合于软骨组织构建。
3、人工合成的可降解材料制备可实现标准化生产，有利于组织工程技术的推广与应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
材料和方法
一、Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜的准备
本实施例所用Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜材料中Gelatin:PCL比例包括30:70，50:50，70:30三种，购自东华大学生物研究所。用角膜环钻将该材料处理成直径为9mm的圆形膜片，经真空冷冻干燥机24小时处理后备用（无菌）。
二、耳廓软骨细胞培养
取新生猪耳廓软骨组织，切成1×1×1mm大小，加入0.1%胶原酶消化过夜，用75μm孔径的滤网滤过后，加入高糖DMEM(Hyclone,美国)含10%胎牛血清（FBS）(Hyclone,美国)的培养液，置于含5%CO2的37℃培养箱培养，培养至80%-90%融合后传代。
三、三明治法构建软骨
用0.25%胰蛋白酶消化收集培养的软骨细胞，用含10%FBS的DMEM培养液重悬至浓度100×106/ml，将Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加，细胞悬液每层5μl，共叠加20层膜片（图1）。静置1小时后加入含10%FBS的高糖DMEM培养液覆盖复合物，置于含5%CO2的37℃培养箱培养。隔天换液，体外培养1周后植入裸鼠皮下，体内3周后取材。
四、细胞粘附率检测
将软骨细胞按照2×104/ml/孔（24孔板）的数量接种于三种比例的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片。细胞-材料复合物在含5%CO2的37℃培养箱培养4h后被转移至另一24孔板，用0.25%的胰酶消化原24孔板内贴壁细胞，与原24孔板内培养液一同计数，全自动细胞计数仪计数后得出流失细胞数。
细胞粘附率=（接种细胞数-流失细胞数）/接种细胞数×100%。
五、构建软骨的组织学检测
HE染色：将切片脱蜡至水后苏木素染色8分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟,伊红染色2分钟后乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。
Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：切片脱蜡至水后，加入3%过氧化氢乙醇溶液室温下放置10分钟，（磷酸缓冲液）PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37℃消化30分钟；PBS漂洗3次，山羊血清封闭30分钟，吸去血清后加入1：200稀释的一抗（abcam，美国）,4℃过夜后加入二抗，37℃温箱1小时，后用3,3’-二氨基联苯胺显色。
Safranin’O染色：将切片脱蜡至水后Safranin’O液染5分钟；乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。
六、构建软骨的生物力学检测
通过应力-应变力学测试来测定组织抗压强度和压模量。概述如下：组织放在特殊设计的一个容器中，首先加1g压力，并将此时作为零应变。然后持续施加2.5%应变的压力一直达到80%应变为止。在每一步中，均记录压力-变形情况直到达到平衡。抗压强度(平衡压力与标本横截面积的比值)表征组织承受最大应力的一个功能；通过应力-应变曲线中线性关系良好部分的斜率可以计算出压模量，它同样可作为组织生物力学的一个功能。
结果
1.Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜及其组织相容性
静电纺丝法制备的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜颜色纯白，厚度约20μm，具有良好的抗拉伸强度，用9mm角膜环钻处理后成圆片状，形状规则，未出现皱缩现象（图2A）。电镜扫描显示：纳米纤维均匀、光滑、连续，其平均直径（纤维横切面的直径）在379±146nm左右，接近于正常胶原纤维50-500nm的直径，能很好地仿生了天然细胞外基质胶原的纤维细度（图2B），纤维中由于包含明胶成分，故具有良好的组织相容性，细胞粘附率检测结果提示，PCL含量为30%与50%的材料细胞粘附率较高，且两者不存在统计学差异(图3B)。
2.构建软骨的大体观及力学强度
体内培养3周后取材显示三组膜片均形成软骨样组织(图3A)，Gelatin/PCL70:30和50:50组形成软骨弹性好，力学强度分析显示他们的杨氏膜量显著高于Gelatin/PCL30:70组（图3C）
3.构建软骨的组织学检测
经体外培养1周后移植入裸鼠皮下3周取材，组织学结果显示，不同比例的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜构建软骨的质量明显不同。Gelatin/PCL70:30和50:50组形成软骨质量好，材料膜片之间的软骨细胞大量增殖，软骨陷窝结构清晰，Safranin O和Collagen Ⅱ免疫组织化学染色结果提示分泌细胞外基质能力旺盛。Gelatin/PCL70:30组软骨质量较差，组织不均一，软骨陷窝较少，Safranin O和Collagen Ⅱ免疫组织化学染色结果提示分泌细胞外基质较少。（图4）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种组织工程软骨的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）在Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片上加软骨细胞悬液；
（2）在步骤（1）产生的软骨细胞悬液上加Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片；
（3）重复步骤（1）和（2），得到复合物；
（4）体外培养复合物得到组织工程软骨。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为70∶30-30∶70；优选为70∶30-50∶50。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的横切面为直径7-12mm的圆形。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的厚度为10-30μm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞悬液中的软骨细胞浓度为50-150×106/ml。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每次所加软骨细胞悬液为1-10μl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中重复步骤（1）和（2）5-15次。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）得到的复合物上覆盖培养液后再进行体外培养。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞来自全身软骨组织。
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