CN103622762A - 一种组织工程软骨的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织工程软骨的构建方法，所述方法包括步骤：（1）将膜片加至具有三维结构的耳廓形状支架上；（2）在膜片上加软骨细胞悬液；（3）在步骤（2）产生的软骨细胞悬液上加膜片；（4）重复步骤（2）和（3），得到复合物；（5）体外培养复合物得到组织工程软骨。

Description

一种组织工程软骨的构建方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，尤其涉及一种应用预制具有三维结构的耳廓形状支架构建组织工程软骨。

背景技术

软骨是一种无血管的组织，因其自我修复能力低下，所以软骨损伤或畸形一直以来都是临床治疗的一大难题。组织工程技术为软骨缺损修复提供了一种全新的治疗手段。软骨构建中除了解决细胞、材料这两个关键问题以外，如何构建具有三维精细结构的软骨组织是一难点。机体软骨的缺损形态多种多样，如关节软骨的运动损伤性缺损，尤其是临床上非常常见的先天性小耳畸形，这就要求组织工程软骨也能预制成不同的形状。目前临床修复先天性小耳畸形的主要手段是利用肋软骨进行雕琢形成人耳样结构修补损伤位置，其往往是拆东墙补西墙，且容易造成气胸或软骨缺损引起的呼吸反常等缺点。传统方法是先将材料预制成特定的三维形状，然后接种细胞，从而实现特定形状组织的构建。而膜片本身不具备三维结构，如何应用膜片实现具有三维结构组织的构建成为研究的重点。

因此，本领域迫切需要提供一种新的可实现特定形状组织构建的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种新的构建组织工程软骨的方法。

本发明提供了一种组织工程软骨的构建方法，所述方法包括步骤：

（1）将膜片加至具有三维结构的形状支架上；

（2）在膜片上加软骨细胞悬液；

（3）在步骤（2）产生的软骨细胞悬液上加膜片；

（4）重复步骤（2）和（3），得到复合物；

（5）体外培养复合物得到组织工程软骨。

在另一优选例中，所述具有三维结构的形状支架的材质选自钛合金、金属材料、或高分子合成材料。

在另一优选例中，所述支架的特点是要有一定力学强度，可塑型，不变形，不对细胞产生毒副作用。

在另一优选例中，所述具有三维结构的形状选自耳廓形状、鼻翼或下颌。

在另一优选例中，所述耳廓形状可以是正常耳廓形状，也可以是畸形耳廓形状。

在另一优选例中，所述膜片选自软管脱细胞基质膜片或Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90；更佳地，重量比为70∶30-30∶70；最佳地，为70∶30-50∶50。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的横切面为直径7-12mm的圆形。

在另一优选例中，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的厚度为10-30μm。

在另一优选例中，所述软骨细胞悬液中的软骨细胞浓度为50-150×10⁶/ml，每次所加软骨细胞悬液为1-10μl。

在另一优选例中，步骤（4）中重复步骤（2）和（3）5-15次。

在另一优选例中，步骤（4）得到的复合物上覆盖培养液后再进行体外培养。

在另一优选例中，所述软骨细胞来自全身软骨组织。

在另一优选例中，所述全身软管组织是耳廓、肋骨、或关节等。

据此，本发明提供了一种新的可实现特定形状组织构建的方法。

附图说明

图1是钛合金人耳廓支架大体观（A），软骨脱细胞膜片大体观（B），Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜大体观（C）以及软骨细胞镜下观（D）。

图2显示了钛合金人耳廓支架大体观（A），软骨脱细胞膜片复合软骨细胞构建人耳软骨即刻大体观（B）以及Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜复合软骨细胞构建人耳软骨即刻大体观（C）。

图3软骨脱细胞膜片（Acellular cartilage sheets,ACS）和Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜复合软骨细胞构建人耳软骨体外培养2周大体观（A），植入体内6周后大体观（B,C）以及体内6周HE染色（D）。

图4组织工程构建人耳软骨与钛合金支架激光扫描的结构吻合度比较。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，发现利用膜片湿润后柔软的特性，先预制特定耳廓三维结构的刚性材质支架，以该支架为模板，将膜片与细胞复合，构建立体结构与预制模板一致的三维软骨组织。同时发现，可以使用一定比例的Gelatin（明胶）/PCL（polycaprolactone，聚己酸丙酯）纳米纤维材料作为组织工程支架材料，并且通过“三明治法”将Gelatin/PCL纳米纤维材料（膜片形式）和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在培养皿中层层叠加所得到的复合物，经过体外培养可以有效构建组织工程软骨。

本发明提供的构建组织工程软骨的方法是压制得到具有三维结构的耳廓形状支架，然后将种子细胞接种于在该支架上的生物可降解材料上，形成种子细胞-材料-支架复合物，然后在体外培养条件下（例如在常规的含5%CO₂的37℃培养箱中）进行体外培养可以得到可用于移植的组织工程化软骨。也可以进一步地，在体外培养后植入体内使进一步地生长。在本发明的一个实施例中，是在体外培养后植入哺乳动物皮下。

在本发明提供的上述组织工程软管的构建方法中，是以钛合金为材料压制出具有三维结构的耳廓形状支架。在一实施例中，CT扫描正常成人耳朵，根据扫描数据通过三维打印技术制备微缩版耳廓模具，以钛合金为材料压制出具有三维结构的耳廓形状支架。

在本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，所使用的生物可降解材料优选膜片，所述膜片选自软管脱细胞基质膜片或Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片。

如本文所用，“膜片”是指天然或合成的厚度在5-50μm的膜状材料。

本发明所述软管脱细胞基质膜片可以使用常规方法获得，例如但不限于，将动物耳廓软骨，用角膜环钻切成圆柱状，冰冻切片机切成厚度8-12μm的圆形薄片，置入十二烷基磺酸钠(SDS)溶液，震荡，切片用水漂洗数次，冻干备用。

本发明所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜中，Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90，优选70∶30-30∶70，更优选70∶30-50∶50。

如本文所用，“Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜”是一种电纺纳米纤维材料，由Gelatin和PCL构成，成膜状，厚度10-30μm，优选横切面为直径7-12mm的圆形。

本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，所使用的种子细胞可以是成熟的软骨细胞，也可以是具有成软骨分化能力的干细胞。软骨细胞可以使用本领域的常规方法获得，例如但不限于，酶消化法从软骨组织块中消化获得细胞。

本发明提供的上述组织工程软骨的构建方法中，种子细胞-材料-支架复合物的形成过程是将钛合金耳廓支架凸面朝上至于培养皿中，将膜片和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在钛合金耳廓支架上层层叠加，均匀覆盖支架。细胞悬液中软骨细胞的浓度为50-150×10⁶/ml，优选为80-120×10⁶/ml；每层细胞悬液1-10μl，优选为3-7μl，每层细胞悬液量以湿润每张膜片为准；叠加层数为10-30层，优选为15-25层。

在本发明的一个实施例中，通过上述层层叠加的方式获得复合物后，静置0.5-2小时，将含有5-15%FBS的高糖DMEM培养液覆盖复合物，再进行体外培养。

在本发明的一个实施例中，体外培养1-3周后植入哺乳动物皮下4-8周。

本发明提供的方法适用于构建不同三维形状的软骨，不仅限于耳廓，并且支架形态决定构建组织形态。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明利用膜片湿润后柔软的特性，先预制特定三维结构的钛合金耳廓支架，以钛合金支架为模板，三明治法将膜片与细胞复合，经过体外和体内的培养，最终构建出立体结构与预制模板一致的三维软骨组织。结果显示该构建方式得到的人耳廓软骨三维形态维持良好，所形成的软骨组织成熟均一。

2、本发明建立了一个全新的构建特定形状三维精细结构软骨的方法：利用膜片材料柔软的特性，先预制特殊形态的三维支架模版（这一模版可以使用不同的材质），然后以模板为支架贴付一定层数的膜片类生物可降解材料，层与层之间接种具有成软骨能力的细胞（软骨细胞、间充质干细胞等），最终可在体外和体内构建特定形状的软骨组织。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例

材料和方法：

一、耳廓形状钛合金支架的制备

CT扫描正常成人耳朵，根据扫描数据通过三维打印技术制备微缩版（2：1）耳廓模具，以钛合金为材料压制出具有三维结构的耳廓形状支架（图1A），75%酒精消毒备用。

二、软骨脱细胞基质膜片制备

取新鲜成年猪耳廓软骨，用角膜环钻切成直径9mm的圆柱状，冰冻切片机切成厚度10μm的圆形薄片，置入1%SDS（上海生工）溶液，于摇床震荡过夜。切片用蒸馏水漂洗数次，用冷冻干燥机（Virtis，美国）冻干备用（图1B）。

三、Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜的准备

本实验所用的Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜材料中Gelatin：PCL比例为50：50，购自东华大学生物研究所。将该材料裁减成近椭圆形，大小比金属耳廓支架略大，材料经真空冷冻干燥24小时处理后备用（图1C）。

四、耳廓软骨细胞培养

取新生猪耳廓软骨组织，切成1×1×1mm大小，加入0.1%胶原酶消化过夜，用75μm孔径的滤网滤过后，加入高糖DMEM(Hyclone,美国)含10%胎牛血清（FBS）(Hyclone,美国)的培养液，置于含5%CO₂的37℃培养箱培养，培养至80%-90%融合后传代（图1D）。

五、三明治法构建软骨

用0.25%胰蛋白酶消化收集培养的软骨细胞，用含10%FBS的DMEM培养液重悬至浓度100×10⁶/ml，将钛合金耳廓支架凸面朝上至于培养皿中（图2A），将膜片和软骨细胞按“膜片-细胞悬液-膜片-细胞悬液”的方式在钛合金耳廓支架上层层叠加，均匀覆盖支架（图2B,C），细胞悬液量以湿润每张膜片为标准，共叠加15层膜片。静置1小时后加入含10%FBS的高糖DMEM培养液覆盖复合物，置于含5%CO₂的37℃培养箱培养。隔天换液，体外培养2周后植入裸鼠皮下，体内6周后取材。

六、构建软骨的组织学检测

HE染色：将切片脱蜡至水后，苏木素染色8分钟，冲洗后盐酸酒精分化数秒，自来水洗返蓝30分钟,伊红染色2分钟后乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

II型胶原免疫组织化学染色：切片脱蜡至水后，加入3%过氧化氢乙醇溶液室温下放置10分钟，（磷酸缓冲液）PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37℃消化30分钟；PBS漂洗3次，山羊血清封闭30分钟，吸去血清后加入1：200稀释的一抗（abcam，美国）,4℃过夜后加入二抗，37℃温箱1小时，后用3,3'-二氨基联苯胺显色。

Safranin’O染色：将切片脱蜡至水后Safranin’O液染5分钟；乙醇脱水；二甲苯透明后中性树脂封片。

甲苯胺蓝染色：将切片脱蜡至水后甲苯胺蓝染液5分钟，乙醇脱水，二甲苯透明后封片观察。

七、三维立体激光扫描

为了检测所构建的耳廓软骨外形与钛合金耳廓支架的吻合度，利用三维立体激光扫描系统（Konica Minolta,Tokyo,Japan）分别对钛合金耳廓支架和以软骨脱细胞膜片或Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜构建的耳廓软骨进行立体扫描成像，扫描得到的数据经系统处理后可以得出构建所得的耳廓软骨与钛合金耳廓支架的吻合度情况。

结果

1.三明治法构建耳廓形态软骨

应用CT扫描、三维打印和模压技术，可以制备出特定人耳廓形状的钛合金支架（图2A），以此支架为模板应，应用软骨脱细胞膜片或人工合成可降解Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜，以三明治法接种软骨细胞后，可以得到与钛合金支架立体结构吻合的细胞-材料复合物（图2B,C），在钛合金支架的依托下体外培养或移植裸鼠皮下，细胞-材料复合物均维持良好的三维结构（图3）,经三维立体激光扫描成像检测，以软骨脱细胞膜片和Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜构建的耳廓软骨与钛合金耳廓支架和吻合度分别达到了84.1%和85.6%（图4）。

2.构建软骨的组织学检测

经过体外或体内培养的组织切片显示为软骨组织，软骨陷窝清晰可见，分泌细胞外基质能力旺盛。组织中仍然可见未完全降解的脱细胞膜片或Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜材料但膜片和细胞交界模糊，多处可见细胞长入膜片内部形成陷窝，连通了不同层膜片之间的细胞群体（图3D）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种组织工程软骨的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）将膜片加至具有三维结构的形状支架上；

（2）在膜片上加软骨细胞悬液；

（3）在步骤（2）产生的软骨细胞悬液上加膜片；

（4）重复步骤（2）和（3），得到复合物；

（5）体外培养复合物得到组织工程软骨。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有三维结构的形状支架的材质选自钛合金、金属材料、或高分子合成材料。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜片选自软管脱细胞基质膜片或Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片中Gelatin和PCL的重量比为90∶10-10∶90；优选重量比为70∶30-30∶70；更优选为70∶30-50∶50。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的横切面为直径7-12mm的圆形。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜片的厚度为10-30μm。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞悬液中的软骨细胞浓度为50-150×10⁶/ml，每次所加软骨细胞悬液为1-10μl。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中重复步骤（2）和（3）5-15次。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）得到的复合物上覆盖培养液后再进行体外培养。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞来自全身软骨组织。

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