CN109529121A - 一种脱细胞血管基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组织工程材料技术领域，具体涉及一种脱细胞血管基质及其制备方法，具体方法为：将血管组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得血管基质，本发明制备的脱细胞血管基质能够最大限度地保留血管细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且免疫原性低、毒性低，批次间差异性小，而且制备方法简单，成本较低，适宜产业化生产。

Description

一种脱细胞血管基质及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，具体涉及一种脱细胞血管基质及其制备方法。
背景技术
随着人民生活水平的提高，饮食习惯的改变以及人口老龄化，心血管疾病的发病率呈逐年上升趋势。心血管疾病是引起人类死亡率和致残率最高的疾病之一。推算心血管病现患人数2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺原性心脏病500万，心力衰竭450万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，高血压2.7亿。心血管病死亡占居民疾病死亡构成40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。
血管重建是治疗急性心血管疾病的有效手段，近20年来，血管移植在治疗血管源性疾病及器官移植的循环重建中发挥着重要作用。寻找合适的血管移植物是临床工作者迫切需要解决的问题。目前临床工作中所用的血管移植物主要有以下几种：自体血管、同种异体血管，人工血管(包括天然材料和合成型材料)等。自体血管移植是血管重建手术的金标准，常用的自体血管为大隐静脉和内乳动脉。但很多病人因为血管本身存在病变或者曾行剥脱手术而不能获得自体血管，除此之外，获取自体血管的手术增加了病人的创伤，同时也增加了并发症的发生几率。同种异体血管的来源仍有限，且由于异体细胞的残留，长期随访表明此种血管也存在血栓形成、钙化等问题。1954年人工血管的诞生奠定了现代血管外科的基础，但是人工血管由于血管腔面缺乏内皮细胞层，严重影响了其远期通畅率。20世纪80年代后期提出的组织工程学的概念有望解决小口径血管移植物缺乏的难题。血管组织工程研究的基本方法是：将体外培养扩增的，高浓度的血管壁细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)上，经过一段时间的培养，再将他们移植到体内，取代病损血管组织而发挥正常功能。但是构建组织工程血管的周期较长，大概需要6-8周的时间。而且血管细胞(内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等)与细胞外基质之间在体内或体外的相互作用尚未研究清楚。近年来脱细胞异种生物型血管是目前研究的热点。因为其来源丰富，价格低廉，但具有较强的免疫原性，直接移植会引发急性免疫排斥反应。大量研究证实，血管内皮细胞是发生免疫排斥反应的核心因素，去除异种血管的内皮细胞可以极大地降低血管移植物的免疫原性。而细胞外基质组分具有物种保守性，几乎不引起免疫排斥反应。
异种脱细胞血管基质是将利用脱细胞技术将组织上的细胞去除而保留其三维结构及细胞外基质组分。脱细胞异种生物血管有利于细胞粘附、增殖及分化，其功能及结构类似于天然血管，具有良好的顺应性，植入体内后通畅率优于合成血管材料。异种脱细胞血管与机体正常的血管结构和功能相似，可以根据环境的变化进行自我的调节和更新，能够自身合成细胞外基质(ECM)，并不断随着环境的变化进行自我重塑；此外这类血管还保存了天然的基底膜和弹力纤维，同时也为血管基质细胞提供了足够的生长空间，易于植入单层内皮细胞(endothelialcells，ECs)及平滑肌细胞(smoothmusclecells，SMC)，并最终形成生理状态的内膜，从而具有很低的血栓发生率；所构建的血管与自体血管有很高的组织相容性，由于其没有合成材料的参与，减少了炎症反应的发生，避免了排斥反应。并且全生物化异种移植血管的柔韧性和顺应性均优于含非生物材料的人工血管，有利于手术操作。
目前国内外常用到的脱细胞方法主要有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，然而在单独使用或者联合使用这些方法脱细胞的过程中容易出现细胞抗原性去除不彻底，细胞外基质的三维结构遭到破坏的问题，使得细胞营养供应以及代谢废物排出困难，影响血管修复效果，甚至导致血管修复失败。例如，中国专利文献CN1294254A公开了一种异种生物心血管移植物的组织脱细胞方法。该方法首先对异种生物心血管组织进行胰蛋白酶消化处理，然后通过低渗和等渗溶液的交替冲击破坏细胞膜结构，用中性表面活性剂提取细胞膜的脂质成分，再以核酸酶降解细胞中的各类DNA和/或RNA成分，最后以中性表面活性剂抽提残存的核膜等细胞膜成分。上述发明的血管基质制备中首先通过胰蛋白酶对血管组织进行消化处理，容易破坏细胞外基质支架材料的结构和组成成分，使得支架的部分降解，导致脱细胞血管基质材料力学性能变差、机械强度降低。
为此，中国专利文献CN103536967A公开了一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法，采用绿色表面活性剂吡喃葡萄糖苷进行脱细胞处理，虽然最大限度地保持了ECM支架的超微结构和组成成分，但是表面活性剂吡喃葡萄糖苷的残留容易导致机体的免疫反应，无法长期使用。而且在研发的过程中，还发现脱细胞血管基质的制备方法普遍存在稳定性差，制得的血管基质批次间差异性大，质量不可靠，难以产业化。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞血管基质机械性能差，免疫原性和毒性高，质量不稳定的缺陷，从而提供一种脱细胞血管基质及其制备方法。
本发明提供了一种脱细胞血管基质的制备方法，将血管组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得血管基质。
在低渗处理中，将血管组织加入低渗溶液中孵育，孵育温度为2-6℃，孵育时间为15-30h；
优选地，所述低渗溶液为超纯水。
在胰蛋白酶处理中，将血管组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5-3h；
优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶；
更优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶和0.01-0.05％(m/v)EDTA的PBS溶液。
所述PBS溶液的浓度为0.01M，pH为7.4。
在去污剂处理中，将血管组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；
优选地，所述去污剂溶液为含0.5-3％(v/v)Triton-X100和0.5-3％(m/v)SDS的PBS溶液。
优选地，在所述去污剂处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理中，将血管组织加入含10-40μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在25-37℃浸泡1-6小时。
在核酸酶处理中，将血管组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60U/ml的DNA酶和0.5-4U/ml的RNA酶，在35-40℃下水浴加热1-6h。
所述缓冲细胞液为含5-30mM氯化镁的Tris-Hcl溶液，所述Tris-Hcl溶液的浓度为30-60mM，pH为7-8。
在核酸酶处理之后还包括灭菌处理；
优选地，在灭菌处理中，将血管组织加入消毒液中浸泡1-6h，所述消毒液为含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4wt％次氯酸钠的PBS溶液，或
含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4vt％84消毒液的PBS溶液。
软骨组织在低渗处理之前还包括前清洗处理；在低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理之后还包括中间清洗处理；在核酸酶处理之后还包括后清洗处理；
优选地，在前清洗处理中，将血管组织加入生理盐水中浸泡，然后加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；
优选地，在中间清洗处理中，将血管组织加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；
优选地，在后清洗处理中，将血管组织加入无菌PBS中浸泡。
本发明还提供了一种所述的制备方法制得的脱细胞血管基质。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的脱细胞血管基质的制备方法，血管组织依次经过低渗处理，胰蛋白酶处理和去污剂处理，最后经过核酸酶处理，制得脱细胞血管基质。其中，通过低渗溶液的渗透作用使水分不断透过细胞膜，使细胞膜膨胀破裂，促进胰蛋白酶处理和去污剂处理中的脱细胞溶液透过细胞膜进入细胞，从而能够提高胰蛋白酶处理和去污剂处理的脱细胞效果，具体地，血管组织经过胰蛋白酶消化细胞膜表面和细胞内的免疫蛋白，有效降低免疫原性，保留胶原和糖胺多糖，然后经过去污剂去除血管组织中的细胞成分，破坏细胞膜磷脂和脂膜，彻底清除抗原和免疫复合物，最后通过核酸酶处理可以去除细胞核中的DNA和RNA；本发明不仅利用在先的低渗溶液处理来增强胰蛋白酶处理和去污剂处理的脱细胞效果，而且通过胰蛋白酶处理和去污剂的联合处理也能够提高脱细胞效果，降低去污剂的用量，有效改善因去污剂残留或者去污剂处理过度而导致的脱细胞血管基质的细胞毒性或者免疫原性增强，同时也能够改善胰蛋白酶处理过度而造成对胶原蛋白和弹性蛋白的过度消化导致脱细胞血管基质基质的三维结构紊乱和机械强度降低的情况发生。因而，本发明制备的脱细胞血管基质能够最大限度地保留血管细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且免疫原性低、毒性低，批次间差异性小，而且制备方法简单，成本较低，适宜产业化生产。
2.本发明提供的脱细胞血管基质的制备方法，将血管组织置于低渗溶液中孵育，孵育温度为2-6℃，孵育时间为15-30h，使低渗溶液中的水分在温和条件下缓慢进入血管细胞，避免低渗溶液破坏血管细胞外基质的结构的完整性，提高机械性能的稳定性，进一步的，采用超纯水为低渗溶液，能够进一步改善低渗溶液处理过程对脱细胞血管基质结构的完整性的影响，提高脱细胞血管基质机械性能，降低毒性。
3.本发明提供的脱细胞血管基质的制备方法，将血管组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5-3h，能够进一步提高血管细胞基质的结构的完整性，提高脱细胞血管基质机械性能和稳定性。而且本发明采用将血管组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h，分别以含0.5-3％(v/v)Triton-X100和0.5-3％(m/v)SDS的PBS溶液为去污剂，既保证了良好的去污和脱细胞效果，又能够保留完整的血管基质结构。
4.本发明提供的脱细胞血管基质的制备方法，通过先将血管组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60U/ml的DNA酶和0.5-4U/ml的RNA酶，在35-40℃下水浴加热1-6h，高浓度的核酸酶在缓冲溶液中逐渐分散，彻底消化掉血管组织中的核酸，有效降低脱细胞血管基质的免疫原性，减少批次之间毒性的差异，提高产品质量的稳定性，且采用水浴加热的方式，使核酸酶在温和条件下进入血管组织，消化DNA和RNA，减少对脱细胞血管基质的破坏，提高脱细胞血管基质机械性能和稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实验例4中显微镜下的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织的HE染色图，其中A为血管组织(500μm)，B为血管组织(200μm)，C为脱细胞血管基质(500μm)，D为为脱细胞血管基质(200μm)；A与B中有大量蓝染，C与D中无蓝染；
图2是实验例5中显微镜下的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织的DAPI染色图，其中A为血管组织，B为脱细胞血管基质；A中有较强蓝色荧光，B中无蓝色荧光；
图3是实验例6中显微镜下的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织的改良Masson三色染图，其中A为血管组织，B为脱细胞血管基质；A中有较强蓝色和蓝褐色，其中，蓝色为胶原纤维，蓝褐色为细胞核；B中只有红色；
图4是6中显微镜下的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织的EVG染图，其中A为血管组织，B为脱细胞血管基质；A中有较强红色和黑色，B中只有红色。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述新鲜的血管组织均取自成年健康猪颈动脉，将颈动脉清洗后轻柔剥除外层的疏松结缔组织，制得血管组织。
实施例1
本实施例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入生理盐水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到已灭菌的10L超纯水中，在4℃下孵育20h。
(3)胰蛋白酶处理：将低渗处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶和0.03％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(4)去污剂处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液体积为10L。
(5)α-1,3-半乳糖苷酶处理：将血管组织加入含25μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在30℃浸泡3小时。
(6)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化镁且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热3h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(7)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.1vt％乙酸和0.1vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。
(8)后清洗处理：加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(7)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
实施例2
本实施例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取1kg新鲜的血管组织加入生理盐水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在2℃下孵育25h。
(3)胰蛋白酶处理：将低渗处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.50％(m/v)胰蛋白酶和0.01％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(4)去污剂处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织放入含1.5％(v/v)Triton-X100和0.5％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理30h，其中，含1.5％(v/v)Triton-X100和0.5％(m/v)SDS的PBS溶液的体积为10L。
(5)核酸酶处理：将血管组织放入10L的含有30mM氯化镁且pH为8的30mM的Tris-Hcl溶液中，加入60U/ml的DNA酶和0.5U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热6h。
(6)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.05vt％乙酸和0.4vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡4h，进行灭菌处理。
(7)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(6)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
实施例3
本实施例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取500g新鲜的血管组织加入生理盐水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在5℃下孵育15h。
(3)胰蛋白酶处理：将低渗处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热3h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.10％(m/v)胰蛋白酶和0.05％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(4)去污剂处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和3％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和3％(m/v)SDS的PBS溶液的体积为10L。
(5)核酸酶处理：将血管组织放入含有5mM氯化镁且pH为7.0的60mM的Tris-Hcl溶液中，加入30U/ml的DNA酶和4U/ml的RNA酶，在35℃下水浴加热1h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(6)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.4vt％乙酸和0.05vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡2h，进行灭菌处理。
(7)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(6)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
实施例4
本实施例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入生理盐水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在4℃下、转速200rpm/min的条件下振荡20h。
(3)胰蛋白酶处理：将低渗处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下、转速200rpm/min的条件下振荡0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶和0.03％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(4)去污剂处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液的体积为10L。
(5)α-1,3-半乳糖苷酶处理：将血管组织加入含25μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在30℃浸泡3小时。
(6)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化镁且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热3h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(7)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.1vt％乙酸和0.1vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。
(8)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(7)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
实施例5
本实施例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入超纯水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在4℃下孵育20h。
(3)胰蛋白酶处理：将低渗处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶和0.03％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(4)去污剂处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液体积为10L。
(5)α-1,3-半乳糖苷酶处理：α-1,3-半乳糖苷酶处理：将血管组织加入含25μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在30℃浸泡3小时。
(6)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化镁且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热3h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(7)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.1vt％乙酸的PBS中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。
(8)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(7)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
对比例1
本对比例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入超纯水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在4℃下孵育20h。
(3)去污剂处理：将低渗处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液体积为10L。
(4)α-1,3-半乳糖苷酶处理：将血管组织加入含25μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在30℃浸泡3小时。
(5)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化镁且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热3h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(6)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.1vt％乙酸和0.1vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。
(7)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(6)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
对比例2
本对比例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入超纯水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)低渗处理：将反复冻融处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的超纯水中，在4℃下孵育20h。
(3)去污剂处理：将低渗处理后的血管组织放入含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含0.5％(v/v)Triton-X100和1％(m/v)SDS的PBS溶液体积为10L。
(4)α-1,3-半乳糖苷酶处理：将血管组织加入含25μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在30℃浸泡3小时。
(5)胰蛋白酶处理：将去污剂处理后的血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶和0.03％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(6)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化镁且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热3h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
(7)灭菌处理：将核酸酶处理后的血管组织加入含有0.1vt％乙酸和0.1vt％的84消毒液的PBS中，在室温下浸泡3h，进行灭菌处理。
(8)后清洗处理：然后加入无菌PBS中浸泡，封装，储存于-20℃的冰箱中保存待用。
其中步骤(2)-(6)中，每步结束后还包括中间清洗处理，中间清洗处理为使用超纯水将血管组织清洗然后置于超声波清洗仪中清洗。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
对比例3
本对比例中脱细胞血管基质的制备方法，包括如下步骤：
(1)前清洗处理：取800g新鲜的血管组织加入超纯水中，浸泡，然后将血管组织取出加入超纯水中，经超声波清洗仪超声清洗，再用超纯水持续冲洗。
(2)胰蛋白酶处理：将血管组织放入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5h。其中，胰蛋白酶溶液为含0.25％(m/v)胰蛋白酶和0.03％(m/v)EDTA的PBS溶液，胰蛋白酶溶液的体积为10L。
(3)低渗处理：将胰蛋白酶处理后的血管组织加入到10L的已灭菌的pH为7且浓度为0.01M的Tris-HCl溶液中，在4℃下孵育20h。
(4)等渗中性去污剂处理：将低渗处理后的血管组织放入含1％(v/v)Triton-X100的0.05M的Tris-HCl溶液中，室温下振荡处理24h，其中，含1％(v/v)Triton-X100的Tris-Hcl溶液体积为10L。
(5)核酸酶处理：将血管组织放入含有15mM氯化钠且pH为7.5的50mM的Tris-Hcl溶液中，加入40U/ml的DNA酶和2U/ml的RNA酶，在37℃下水浴加热24h。其中，Tris-Hcl溶液的体积为10L。
采用该制备方法重复进行5轮次，制备得到5个不同批次的脱细胞血管基质。
实验例1 DNA残留量测定
脱细胞血管基质的DNA残留量能够反映其的脱细胞效果，通过降低DNA残留量也能够降低脱细胞血管基质的免疫原性。
分别取实施例1-5和对比例1-3中制得的脱细胞血管基质以及未脱细胞的血管组织25mg，分别作为试验组、对照组和空白对照组，分别切成小块，按照《中国药典》2015版第三部3407外源性DNA残留量测定法中的荧光染色法测定不同批次的脱细胞血管基质中DNA残留量，结果见下表所示。
表1实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞血管基质中DNA残留量结果
实验例2体外细胞毒性
取实施例1-5和对比例1-3中制得的脱细胞血管基质以及未脱细胞的血管组织，分别作为试验组、对照组和空白对照组，采用MTT法分别测定各组血管组织或血管基质的细胞毒性，采用无血清DMEM培养基作为浸提介质，按照GB/T1688.12-2008标准制备得12组脱细胞血管基质浸提液，按照GB/T14233.2标准，取1周龄新西兰大白兔股骨骨髓，采用密度离心法体外分离培养BMSCs细胞培养，然后于96孔板中接种处于对数生长期的细胞，细胞接种浓度为7×104个/ml。设置空白组，剩余每孔加入100μl细胞悬液。在37℃，含5％CO2的培养箱中培养过夜后，测试组分别加入100μl的浸提液，对照组加入100μl培养液，每组设8个平行孔。培养48h后，加入20μlMTT(5mg/mlPBS)溶液，放入培养箱中继续培养4h后，小心吸出上层清夜，加入150μl二甲亚砜，震荡10min至孔底紫色结晶完全溶解。用酶联免疫酶标仪测定每个孔吸光度OD值，计算各组脱细胞血管基质处理后的BMSCs细胞的相对增殖率。
表2实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞血管基质细胞毒性结果
实验例3
将实施例1-5和对比例1-3制得的脱细胞血管基质以及未脱细胞的血管组织，分别作为试验组、对照组和空白对照组，分别制成板状，采用拉伸强度测定仪测定各组脱细胞血管基质的拉伸强度，记录下拉断时的最大拉力，最大拉力处于血管基质的截面积，即为拉伸强度，见表3所示。
表3实施例1-6和对比例1-3中不同批次的脱细胞血管基质的拉伸强度结果
从表1-3中可知，与对比例1-3相比，实施例1-6中的脱细胞血管基质的拉伸强度、细胞相对增殖率明显增加，DNA残留量、DNA残留量的变异系数、细胞相对增殖率的变异系数和拉伸强度的变异系数均有显著降低，其中脱细胞血管基质的DNA残留量为41.15-94.03ng/mg，细胞相对增殖率为51.53-106.49％，细胞毒性等级不大于2级拉伸强度为2.13-2.70MPa，说明本发明的脱细胞血管基质细胞脱除效果可靠，免疫原性低、毒性低，血管细胞基质本身的三维结构保留完整性高；而且本发明的脱细胞血管基质的DNA残留量的批间变异系数不大于4.39％，细胞相对增殖率的批间变异系数不大于6.54％，拉伸强度的批间变异系数不大于6.51％，较对比例1-3均有明显降低，说明本发明的脱细胞血管基质质量更加稳定可靠，均一性明显提高；而且，与实施例4-6相比，实施例1-3中制得的脱细胞血管基质的DNA残留量、拉伸强度的变异系有显著降低，细胞相对增殖率和拉伸强度有明显提升，表明通过对低渗、胰蛋白酶处理条件，核酸酶浓度以及消毒液的优化，有利于进一步提高制得的脱细胞血管基质质量的稳定性。
实验例4HE染色
将实施例1制得的脱细胞血管基质以及实施例1中未经脱细胞处理的天然血管组织分别进行苏木精-伊红染色(HE染色)，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。然后将石蜡切片于二甲苯中脱蜡各10min，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各5min，自来水冲洗1-2min。然后用苏木素染液染3-5min，自来水冲洗1-2min。1％盐酸酒精分化数秒。1％氨水溶液返蓝数秒，然后水洗1-2min。入伊红染液染1-3min。然后无水乙醇脱水两次各1min，二甲苯透明数分钟。中性树胶封片，镜检，结果如图1所示。
结果显示，实施例1制得的脱细胞血管基质无细胞成分存在，细胞脱除干净，细胞外基质的结构与天然血管组织一致，说明制得的脱细胞血管基质的细胞外基质结构保持完整。
实验例5 DAPI染色
采用DAPI染剂对实施例1制得的脱细胞血管基质以及实施例1中未经脱细胞处理的血管组织中的DNA进行染色，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。将石蜡切片于二甲苯中脱蜡，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各5min，自来水冲洗1-2min。加DAPI工作液，室温避光孵育10min，PBS漂洗三次，每次5min。封片后荧光显微镜下观察，结果如图2所示。
结果显示，天然的血管组织中有较强的荧光，说明未经脱细胞处理的血管组织有细胞核成分，而脱细胞血管基质中无荧光，说明制得的脱细胞血管基质无细胞核成分。
实验例6改良Masson三色染
对实施例1制得的脱细胞血管基质以及实施例1中未经脱细胞处理的血管组织进行改良Masson三色染，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。
将石蜡切片浸入bouin固定液，37度温箱内2h媒染，流水冲洗至切片上的黄色消失；天青石蓝2-3min，稍水洗；Mayer苏木素8min，稍水洗；酸性乙醇分化液分化数秒；流水冲洗10min(反蓝)；丽春红品红8min，稍水洗；磷钼酸浸泡10min；倾去上液，切片不用水洗，直接滴入苯胺蓝染液浸泡5min；弱酸溶液处理2min；95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水两次，每次5-10s；透明、封片。封片后荧光显微镜下观察，结果如图3所示。
结果显示，说明未经脱细胞处理的血管组织有细胞核成分和纤维结构，而经脱细胞处理制得的脱细胞血管基质，纤维结构保存完整，无细胞核成分。
实验例7EVG染色
对实施例1制得的脱细胞血管基质以及实施例1中未经脱细胞处理的血管组织进行EVG染色，具体实验方法如下：取实施例1制得的脱细胞血管基质和未经脱细胞处理的血管组织，分别为实验组和对照组，各组均采用4％的多聚甲醛固定24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包、切片，切片厚度为5μm，得到石蜡切片。将石蜡切片于二甲苯中脱蜡，依次入无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇各5min，自来水冲洗1-2min。用配好的EVG染液苏木精染液(10％的三氯化铁染液，碘液按5:2:2的比例混合)室温染30min，至颜色呈深黑色。自来水冲洗，2％三氯化铁溶液分化10-20s，显微镜观察弹性纤维呈黑色，背景呈灰色。自来水洗，蒸馏水稍洗；VanGieson's液，即饱和苦味酸染液和酸性品红染液按9:1的比例配制，复染3-5min。结果如图4所示。
EVG染色结果为弹性纤维和核为黑色，胶原纤维为红色，图4未脱细胞血管(A)与脱细胞血管基质(B)染色结果显示，与未脱细胞结果相比，脱细胞血管基质弹性纤维与胶原纤维保留较好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种脱细胞血管基质的制备方法，其特征在于，将血管组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得血管基质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在低渗处理中，将血管组织加入低渗溶液中孵育，孵育温度为2-6℃，孵育时间为15-30h；
优选地，所述低渗溶液为超纯水。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在胰蛋白酶处理中，将血管组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5-3h；
优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶；
更优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶和0.01-0.05％(m/v)EDTA的PBS溶液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液的浓度为0.01M，pH为7.4。
5.根据权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于，在去污剂处理中，将血管组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；
优选地，所述去污剂溶液为含0.5-3％(v/v)Triton-X100和0.5-3％(m/v)SDS的PBS溶液；
优选地，在所述去污剂处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理中，将血管组织加入含10-40μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在25-37℃浸泡1-6小时。
6.根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，在核酸酶处理中，将血管组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60U/ml的DNA酶和0.5-4U/ml的RNA酶，在35-40℃下水浴加热1-6h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲细胞液为含5-30mM氯化镁的Tris-Hcl溶液，所述Tris-Hcl溶液的浓度为30-60mM，pH为7-8。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在核酸酶处理之后还包括灭菌处理；
优选地，在灭菌处理中，将血管组织加入消毒液中浸泡1-6h，所述消毒液为含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4wt％次氯酸钠的PBS溶液，或
含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4vt％84消毒液的PBS溶液。
9.根据权利要求1-8所述的制备方法，其特征在于，软骨组织在低渗处理之前还包括前清洗处理；在低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理之后还包括中间清洗处理；在核酸酶处理之后还包括后清洗处理；
优选地，在前清洗处理中，将血管组织加入生理盐水中浸泡，然后加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；
优选地，在中间清洗处理中，将血管组织加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；
优选地，在后清洗处理中，将血管组织加入无菌PBS中浸泡。
10.一种权利要求1-9中任一所述的制备方法制得的脱细胞血管基质。
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