CN106119202A - 一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料及其制备方法 - Google Patents

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吕永钢
邹杨
张小梅
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Abstract

本发明公开了一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料及其制备方法。首先慢病毒过表达基因和沉默基因的方法构建表达不同丰度赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)的肿瘤细胞，再经皮下植入裸小鼠形成具有不同刚度肿瘤组织，取出肿瘤组织进行脱细胞处理，最后经冷冻干燥得到具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料。该发明可在保留肿瘤微环境胞外基质成分和三维结构的情况下形成具有不同刚度的基质，有利于考察基质刚度对肿瘤耐药性、上皮间质转化、肿瘤血管新生等的影响，为研发新的防治方法提供理论依据，而且易于制作。

Description

一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种肿瘤工程支架材料及其制备方法，特别是一种具有不同刚度的脱细胞肿瘤组织三维支架材料及其制备方法。
背景技术
实体瘤的发生发展常伴随着胞外基质的异常沉积、交联和基质刚度增加。基质力学可通过影响肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转换、肿瘤干细胞特性和耐药性等调控肿瘤的发生、恶性转变和转移(张小梅,吕永钢,徐志玲,杨力.基质力学对肿瘤发生发展及肿瘤细胞生物学行为影响的研究进展.生物化学与生物物理进展.2014；41(6):532-541.)。研究基质力学对肿瘤发生发展的影响不仅有助于认识肿瘤发展，也可为研发新的防治方法提供理论依据。为进一步深入认识胞外基质异常沉积对实体瘤发生发展及肿瘤微环境力学特性的调控作用，越来越多的学者在二维和三维环境中考察基质力学对肿瘤细胞生物学行为的影响。由于细胞在二维基质上难以形成三维组织样结构，在二维所处的微环境难以反映细胞所处的真实三维微环境。研究三维基质力学对肿瘤细胞生物学行为影响时，构建一种具有不同刚度的三维支架材料就显得尤为重要。
现有研究主要通过改变物质密度(如胶原和血纤蛋白胶)(Provenzano PP,InmanDR,Eliceiri KW,Keely PJ.Matrix density-induced mechanoregulation of breastcell phenotype,signaling and gene expression through a FAK-ERKlinkage.Oncogene.2009；28:4326-4343；Liu J,Tan Y,Zhang H,Zhang Y,Xu P,ChenJ,Poh YC,Tang K,Wang N,Huang B.Soft fibrin gels promote selection and growthof tumorigenic cells.Nat Mater.2012；11:734-741.)和改变分子间交联度(如藻酸盐)(Chaudhuri O,Koshy ST,Branco da Cunha C,Shin JW,Verbeke CS,Allison KH,MooneyDJ.Extracellular matrix stiffness and composition jointly regulate theinduction of malignant phenotypes in mammary epithelium.Nat Mater.2014,13:970-978.)调控肿瘤三维支架材料的刚度。也有研究利用交联剂增加胶原纤维之间的交联度，以改变胶原纤维束的刚度，从而改变胶原凝胶的刚度(Liang Y,Jeong J,DeVolder RJ,Cha C,Wang F,Tong YW,Kong H.A cell-instructive hydrogel to regulatemalignancy of 3d tumor spheroids with matrix rigidity.Biomaterials.2011；32:9308-9315.)。还有研究利用靠近硬基底上水凝胶固有的边界效应获得力学梯度(Rao SS,Bentil S,DeJesus J,Larison J,Hissong A,Dupaix R,Sarkar A,Winter JO.Inherentinterfacial mechanical gradients in 3d hydrogels influence tumor cellbehaviors.PLoS One.2012；7:e35852.)。尽管这些三维支架材料可模拟肿瘤发展过程中胞外基质的力学特性变化，但是基质成分、基质孔径、纤维结构、局部材料形变、粘附位点数量和细胞因子渗透和扩散等参数与肿瘤在体环境已有很大差异，但恰恰是肿瘤微环境的这些特性对肿瘤细胞的增殖和迁移等具有重要影响。因此，设计一种具有不同基质刚度同时又具有天然肿瘤胞外基质其他物理和化学特性的三维肿瘤工程支架材料是研究基质力学对肿瘤影响的最佳模型。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在三维条件下构建具有不同刚度的肿瘤工程支架材料，目的是在保持肿瘤胞外基质成分和三维支架微结构的情况下构建具有不同刚度的肿瘤工程支架材料。
为解决上述技术问题，本发明的具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料由脱细胞实体瘤构成；其特征在于，皮下注射表达不同丰度赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)肿瘤细胞形成实体瘤，利用肿瘤细胞表达不同水平的LOX交联胞外基质形成具有不同刚度的实体瘤，通过脱细胞保持肿瘤胞外基质成分和三维结构。
本发明中，构建表达不同丰度LOX的肿瘤细胞可采用常规的慢病毒过表达基因和沉默基因的方法。构建过表达LOX的肿瘤细胞的方法简述为，通过聚合酶链反应扩增目的基因LOX后插入表达载体中，构建重组载体。使用聚合酶链式反应、双酶切和DNA测序的方法对重组载体进行鉴定。重组载体与慢病毒包装质粒共同感染293T细胞使其在细胞中进行病毒包装。获得的慢病毒颗粒用于转染肿瘤细胞，筛选出稳定转染的细胞株，利用蛋白免疫印迹法验证LOX的过表达效率。沉默LOX基因可采用shRNA技术，简述为：设计靶向LOX的发夹结构shRNA，插入表达载体形成重组载体，验证并进行慢病毒包装。shRNA慢病毒转染肿瘤细胞，通过载体上抗性基因筛选稳定转染的细胞株，检测LOX的表达水平。
根据肿瘤工程需要选择肿瘤细胞类型，检测肿瘤细胞LOX表达量，根据LOX表达量选择慢病毒过表达或/和shRNA沉默技术改变肿瘤细胞LOX表达量，获得表达不同水平LOX的肿瘤细胞。例如，若所选择肿瘤细胞表达较高丰度的LOX，则一方面利用慢病毒过表达LOX形成更高表达LOX的肿瘤细胞，另一方面用shRNA沉默LOX形成低表达LOX的肿瘤细胞，由此形成了正常表达、高表达以及低表达LOX的肿瘤细胞。若选择本身阴性表达LOX的肿瘤细胞，由于其本身低表达LOX，则可以通过控制转染步骤形成不同程度过表达LOX的肿瘤细胞。
将获得的稳定表达不同丰度LOX的肿瘤细胞分别经皮下植入六周龄雌性BALB/c(nu/nu)裸小鼠。简而言之为，将肿瘤细胞的细胞悬液与人工基质胶混合，迅速前肢腋窝皮下注入。为避免肿瘤体积过大引起组织坏死而导致脱细胞后三维支架材料物性不均一，根据所选肿瘤细胞成瘤能力选定肿瘤细胞注射数量，使其一个月后所形成实体瘤体积为1～2cm3。取出表达不同丰度LOX的肿瘤细胞所形成的实体瘤，进行脱细胞处理，得到具有不同刚度的三维肿瘤工程支架材料。
本发明还提供所述的具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料的制备方法，具体步骤如下：
1)根据肿瘤工程需要选择所需肿瘤细胞，检测肿瘤细胞LOX表达量；
2)根据肿瘤细胞LOX表达量采用慢病毒过表达基因或/和沉默基因的方法构建表达不同丰度LOX的肿瘤细胞；
3)将步骤2)得到的表达不同丰度LOX的肿瘤细胞分别经皮下植入裸小鼠；
4)约一个月后脱颈处死荷瘤裸鼠，无菌条件下剪开腋窝皮肤取出肿瘤组织，制成一定形状的肿瘤组织薄片；
5)将步骤4)得到的肿瘤组织薄片用低渗的Tris缓冲液(10mM Tris,5mM EDTA,pH8.0)4℃处理过夜；
6)将步骤5)得到的肿瘤组织薄片置入高渗的Tris缓冲液(50mM Tris,1M NaCl,10mM EDTA,pH 8.0)，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h；
7)将步骤6)得到的肿瘤组织薄片置入0.025％(w/t)trypsin/0.02％(w/t)EDTA溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理30min；
8)将步骤7)得到的肿瘤组织薄片置入0.5％(v/v)Triton X-100溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理48h；
9)将步骤8)得到的肿瘤组织薄片置入含有50mmol/l MgCl2的DNase I(20U/ml)及0.2mg/ml RNase A的溶液中，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h；
10)用无菌PBS冲洗去除残余成分，得到三维肿瘤工程支架材料；
11)将步骤10)得到的三维肿瘤工程支架材料冷冻干燥24h，无菌密封后储存备用。
优选地，步骤4)所述的肿瘤组织体积为1～2cm3，所述的肿瘤组织薄片制成直径为5～10mm，高为1～5mm的圆柱体或者长×宽×高为5～10mm×5～10mm×1～5mm的立方体等形状样品。
综上所述，本发明的具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料利用表达不同丰度LOX的肿瘤细胞表达不同水平的LOX酶，对分泌的胞外基质进行不同程度地交联从而形成不同刚度实体瘤，通过脱细胞肿瘤组织保留肿瘤微环境胞外基质成分和三维结构。与现有的三维肿瘤工程支架材料相比，本发明的三维肿瘤工程支架材料克服了大多数肿瘤工程支架材料在改变基质刚度的同时改变了微结构和胞外基质成分的缺陷，这也是本发明提出的关键。本发明提供的三维肿瘤工程支架材料在改变刚度的同时最大程度保留了肿瘤微环境中除了肿瘤细胞成分外的其他所有成分，并保留了天然的微结构，为研究基质刚度对肿瘤耐药性、上皮间质转化、肿瘤血管新生等的影响提供了最佳模型，为研发新的防治方法提供理论依据。用于制备三维肿瘤工程支架材料的肿瘤细胞可选择不同肿瘤细胞作为材料，只要满足所要研究肿瘤的要求即可。为简洁起见，本发明主要以乳腺癌为例加以阐述，其他类型肿瘤也可以采用相同的原理。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
选择表达较高丰度LOX的乳腺癌细胞MDA-MB-231作为形成三维肿瘤工程支架材料的成瘤细胞，通过慢病毒过表达基因和沉默基因的方法获得稳定表达不同LOX蛋白水平的肿瘤细胞。首先通过聚合酶链反应扩增目的基因LOX后插入表达载体pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(SBI,USA)中，构建重组载体。使用聚合酶链式反应、双酶切和DNA测序的方法对重组载体进行鉴定。重组载体与慢病毒包装质粒共同感染293T细胞使其在细胞中进行病毒包装。获得的慢病毒颗粒用于转染MDA-MB-231，并用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株，利用蛋白免疫印迹法验证LOX的过表达效率。同时，设计靶向LOX的发夹结构shRNA，插入表达载体pCDH-MSCV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(SBI,USA)形成重组载体，验证并进行慢病毒包装。shRNA慢病毒转染MDA-MB-231，用嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株，检测LOX的敲低水平。以不处理MDA-MB-231细胞作为对照组，形成了高表达、低表达和正常表达LOX的MDA-MB-231细胞。若选择的其他肿瘤细胞经检测发现本身阴性表达LOX，则可通过控制慢病毒过表达基因转染步骤形成不同程度过表达LOX的肿瘤细胞。
分别将105-107个高表达、正常表达和低表达LOX的MDA-MB-231细胞与人工基质胶按1:1体积比混合，然后立即注入六周龄雌性BALB/c(nu/nu)裸小鼠前肢腋窝皮下。待实体瘤体积为1～2cm3时，脱颈处死荷瘤裸鼠，无菌条件下剪开腋窝皮肤取出肿瘤组织，根据需要制成直径为5～10mm，高为1～5mm的圆柱体或者长×宽×高为5～10mm×5～10mm×1～5mm的肿瘤组织薄片，用低渗的Tris缓冲液(10mM Tris,5mM EDTA,pH 8.0)4℃处理过夜，置入高渗的Tris缓冲液(50mM Tris,1M NaCl,10mM EDTA,pH 8.0)，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h，置入0.025％(w/t)trypsin/0.02％(w/t)EDTA溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理30min。接着，将得到的肿瘤组织薄片置入0.5％(v/v)Triton X-100溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理48h，置入含有50mmol/l MgCl2的DNase I(20U/ml)及0.2mg/ml RNase A的溶液中，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h。最后，用无菌PBS冲洗去除残余成分，得到三维肿瘤工程支架材料，冷冻干燥24h，无菌密封后储存备用。
本发明提供的三维肿瘤工程支架材料通过脱细胞肿瘤组织保留天然肿瘤微环境基质微结构和成分，利用成瘤细胞表达不同水平LOX酶交联胞外基质，在不改变肿瘤微环境微结构和胞外基质成分的情况下形成不同刚度的三维多孔支架材料。正是由于这些综合因素，使得本发明提供的三维肿瘤组织工程支架材料为研究基质刚度对肿瘤耐药性、上皮间质转化、肿瘤血管新生等研究提供了最佳模型，为研发新的防治方法提供理论依据。制备方法简单，相比以往的三维肿瘤工程支架材料有明显的优势。

Claims (5)

1.一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料，其由脱细胞实体瘤构成，其特征在于：所述脱细胞实体瘤由皮下注射表达不同丰度赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)肿瘤细胞形成，利用肿瘤细胞表达不同水平的LOX交联胞外基质形成具有不同刚度的实体瘤，通过脱细胞保持肿瘤组织胞外基质成分和三维结构。
2.根据权利要求1所述的一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料，其特征在于：所述脱细胞实体瘤可根据临床需要制成直径为5～10mm、高为1～5mm的圆柱体或者长×宽×高为5～10mm×5～10mm×1～5mm的立方体。
3.根据权利要求1所述的一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料，其特征在于：所述表达不同丰度LOX肿瘤细胞可选择表达较高丰度LOX的肿瘤细胞，通过慢病毒过表达LOX和shRNA沉默LOX形成高表达和低表达LOX的肿瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的一种具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料，其特征在于：所述表达不同丰度LOX肿瘤细胞可选择阴性表达LOX的肿瘤细胞，通过控制慢病毒过表达基因转染步骤形成正常表达和高表达LOX的肿瘤细胞。
5.一种制备权利要求1所述的具有不同刚度三维肿瘤工程支架材料的方法，包括下述步骤：
1)根据肿瘤工程需要选择所需肿瘤细胞，检测肿瘤细胞LOX表达量；
2)根据肿瘤细胞LOX表达量采用慢病毒过表达基因或/和沉默基因的方法构建表达不同丰度LOX的肿瘤细胞；
3)将步骤2)得到的表达不同丰度LOX的肿瘤细胞分别经皮下植入裸小鼠；
4)约一个月后脱颈处死荷瘤裸鼠，无菌条件下剪开腋窝皮肤取出肿瘤组织，制成一定形状的肿瘤组织薄片；
5)将步骤4)得到的肿瘤组织薄片用低渗的Tris缓冲液(10mM Tris,5mM EDTA,pH 8.0)4℃处理过夜；
6)将步骤5)得到的肿瘤组织薄片置入高渗的Tris缓冲液(50mM Tris,1M NaCl,10mMEDTA,pH 8.0)，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h；
7)将步骤6)得到的肿瘤组织薄片置入0.025％(w/t)trypsin/0.02％(w/t)EDTA溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理30min；
8)将步骤7)得到的肿瘤组织薄片置入0.5％(v/v)Triton X-100溶液，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理48h；
9)将步骤8)得到的肿瘤组织薄片置入含有50mmol/l MgCl2的DNase I(20U/ml)及0.2mg/ml RNase A的溶液中，利用摇床(70转/min，37℃)振荡处理24h；
10)用无菌PBS冲洗去除残余成分，得到三维肿瘤工程支架材料；
11)将步骤10)得到的三维肿瘤工程支架材料冷冻干燥24h，无菌密封后储存备用。
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