CN103920189A - 一种构建工程化脂肪的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种构建工程化脂肪的方法，包括以下步骤：(a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；(b)将携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；(c)将转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；(d)将人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。本发明提供的构建工程化脂肪的方法，将携带人胰岛素的人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内，通过携带的人胰岛素基因在体内的持续表达来促进成脂。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种构建工程化脂肪的方法。
背景技术
构建工程化脂肪有多种方式，成功构建工程化脂肪取决于四个因素：种子细胞、支架、细胞因子、微环境，该四因素可组成多种方案。目前，国内外均着重于支架的改造，通过各种方式将壳聚糖、胶原、透明质酸钠、明胶、丝素蛋白组合来寻找理想的支架，通过支架的改进来构建工程化脂肪。
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建工程化脂肪的方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种构建工程化脂肪的方法，包括以下步骤：
(a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；
(b)将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；
(c)将所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；
(d)将所述人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。
优选地，在所述步骤(a)中，所述构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒包括以下步骤：
合成人胰岛素基因序列，对其扩增后测序；
将测序正确的人胰岛素基因与pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接，得到慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP；
将所述慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转入DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆体；
对所述阳性克隆体进行培养繁殖，提取阳性克隆体的质粒；
将所述阳性克隆体的质粒转染至细胞293T，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒。
优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测所述人脐带间充质干细胞表面抗原，所述表面抗原包括CD13、CD14、CD34、CD44及CD3。
优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力。
优选地，所述检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力采用观察脂肪滴形成的情况进行鉴定。
优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力。
优选地，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞具体为：
将不同感染复数的慢病毒颗粒感染293T细胞，筛选出最适感染复数；
将人脐带间充质干细胞以4-6×105个/孔接种于6孔培养板中，培养8-16h，在LG-DMEM培养基中加入终浓度为7-9mg/L的聚凝胺后，加入最适感染复数的慢病毒颗粒；
所述慢病毒颗粒加入5-7h后，将所述LG-DMEM培养基更换为不含聚凝胺的LG-DMEM培养基，然后放置在36-38℃、体积分数4.5-5.5％CO2的培养箱中培养；所述慢病毒颗粒加入70-75h后收集细胞，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞。
优选地，在所述步骤(c)中，所述支架为丝素蛋白支架、透明质酸衍生酯海绵支架和聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架中的任一种。
优选地，在所述步骤(c)中，在所述复合培养前，将所述支架剪切成0.9-1.1cm×0.9-1.1cm×0.15-0.25cm大小，置于蒸馏水中，用γ射线灭菌，辐射剂量为10kGy；
将灭菌后的所述支架在超净台内用LG-DMEM细胞培养液浸泡24h，更换培养液2-4次，得到处理后的支架。
优选地，所述步骤(c)具体为：取所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞的细胞浓度为2-5×106个/ml的细胞悬液100μl，滴在所述支架上，然后放置于36-38℃CO2恒温培养箱内3-4h；添加LG-DMEM培养基完全淹没细胞和所述支架，置于36-38℃CO2恒温培养箱内培养，22-26h后更换为成脂诱导剂，培养5-7d，得到所述人脐带间充质干细胞-支架复合物。
本发明实施例提供的构建工程化脂肪的方法，是将胰岛素基因转入人脐带间充质干细胞后与支架复合培养，得到的人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内来完成构建工程化脂肪。其中，人脐带间充质干细胞具有诱导分化的能力，其携带的人胰岛素基因可在体内持续表达，使人脐带间充质干细胞在分化过程中，有胰岛素的持续表达从而来促进成脂。
附图说明
图1示出了本发明实施例2重组慢病毒颗粒转染至293T包装细胞后的显微镜观察图；
图2示出了本发明实施例3成脂诱导14天油红O染色的显微镜观察图；
图3示出了本发明实施例3成骨诱导14天茜素红染色的显微镜观察图；
图4示出了本发明实施例4重组慢病毒颗粒在293T细胞中的包装的显微镜观察图；
图5示出了本发明实施例4不同转染复数值重组慢病毒颗粒载体转染人脐带间充质干细胞的显微镜观察图；
图6示出了本发明实施例5中的对照组和转染组的人胰岛素表达状况；
图7示出了本发明实施例5中的丝素蛋白支架的扫描电镜图；
图8示出了本发明实施例5中扫描电镜观察玻片图；
图9示出了本发明实施例5中苏木精-伊红染色后显微镜下观察玻片图；
图10示出了本发明实施例5中油红O染色后显微镜下观察玻片图；
图11示出了本发明实施例5中荧光原位杂交检测标本中的性染色体荧光原位杂交图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例中提供了一种构建工程化脂肪的方法，包括以下步骤：
(a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；
(b)将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；
(c)将所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；
(d)将所述人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。
本发明实施例提供的构建工程化脂肪的方法，是将胰岛素基因转入人脐带间充质干细胞后与支架复合培养，得到的人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内来完成构建工程化脂肪。其中，人脐带间充质干细胞具有诱导分化的能力，其携带的人胰岛素基因可在体内持续表达，使人脐带间充质干细胞在分化过程中，有胰岛素的持续表达从而来促进成脂。
实施例2
携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒的构建
登陆Genebank查询人胰岛素基因(GenebankNo.NM000207)。根据文献设计人胰岛素基因cDNA的特异突变序列，由美国Invitrogen公司进行全基因合成，得到人胰岛素基因，其序列为：
ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCTGACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGAAACGTGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCGTCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG。
人胰岛素基因序列设计引物时，引入BamHⅠ和AscⅠ酶切位点，上游引物序列为：
5'-GGATCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGC-3'，
下游引物序列为：
5'-GGCGCGCCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAC-3'，引物序列由美国Invitrogen公司上海分公司合成。通过引物对人胰岛素基因序列扩增，得到扩增产物，用限制性内切酶BamHⅠ和AscⅠ酶切扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果显示，获得的人胰岛素基因片段大小为333bp，基因片段大小符合，然后进行回收。
将回收的人胰岛素DNA片段与pMD18-T载体连接，根据PMD18-T Vector说明书建立反应体系，pMD18-T Vector购自日本TaKaRa公司，转入DH5α感受态细胞，LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。PCR检测筛选阳性克隆，并将人胰岛素DNA片段与PMD18-T Vector T载体的连接物进行酶切鉴定，结果可见300～400bp的目的片段；将筛选到的阳性克隆送至美国Invitrogen公司上海分公司进行测序鉴定，测序报告与预期完全符合。
人胰岛素基因序列插入载体pLenti6.3-IRES-EGFP中，pLenti6.3-IRES-EGFP质粒购买至美国Invitrogen公司。pLenti6.3-IRES-EGFP质粒是该公司对慢病毒载体pLenti6.3/v5DEST改造而成，通过重组将多克隆位点(multiple cloning site，MCS)-IRES-EGFP序列插入pLenti6.3/v5DEST，MCS中包括BamH Ⅰ和Asc Ⅰ位点。
将测序正确的阳性克隆扩增后提取质粒，然后BamH Ⅰ和AscⅠ酶切后回收人胰岛素基因片段；pLenti6.3-IRES-EGFP质粒采用BamH Ⅰ和Asc Ⅰ酶切后回收载体基因片段，回收基因片段均采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，将回收的人胰岛素基因片段和载体基因片段用T4DNA连接酶室温连接2h，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于LB琼脂平板上，过夜培养，形成单菌落。对单菌落进行PCR检测筛选阳性克隆，送至美国Invitrogen公司上海分公司进行测序。测序报告结果显示慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP构建成功，测序结果与预期完全符合。测序正确的阳性克隆进行扩增，提取质粒备用。
将对数生长期293T细胞(由中国科学院上海细胞库提供)以4-5×106个/皿接种于直径为10cm细胞培养皿中，于36-38℃、4.5-5.5％CO2培养箱培养过夜，采用脂质体法将实施例1得到的慢病毒载体系统中质粒转染至包装细胞293T中，包装后在荧光倒置相差显微镜(100倍)下观察EGFP阳性表达细胞如图1所示，从图1可以看出，荧光倒置相差显微镜下，细胞膜及胞质中均有绿色荧光分布，包装成功。
脂质体转染法具体为：
将9μg Packaging Mix(美国Invitrogen公司)和3μg慢病毒质粒加入至1.5ml Opti-MEMⅠ中，36μl Lipofectamine2000加入至1.5mL Opti-MEM Ⅰ中，室温放置5min后混匀质粒和Lipofectamine2000稀释液，室温孵育20min。细胞用Opti-MEM Ⅰ洗2遍后，加入5ml Opti-MEM Ⅰ。将3ml质粒脂质体混合物加入到细胞培养皿中，轻轻混匀，于36-38℃、4.5-5.5％CO2培养箱中孵育4～6h后，更换为含10％FBS的HG-DMEM培养基。48h后收集细胞培养上清，以20000×g离心15min，去除细胞残余，上清用0.45μm滤器过滤。再将上清在50000×g下超速离心2h，去除上清，重悬于200μl HG-DMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。
实施例3
人脐带间充质干细胞购买至上海复蒙基因生物科技有限公司。(1)人脐带间充质干细胞在转染重组慢病毒颗粒前，检测所述人脐带间充质干细胞表面抗原，所述表面抗原包括CD13、CD14、CD34、CD44及CD3。
具体地，培养细胞,弃去培养液,用PBS洗2次,再用2.5g/L胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA)消化；PBS洗涤后制成浓度为1.0×107个/ml的单细胞悬液。分别加入抗人CD13-FITC、CD14-PE、CD34-PE、CD44-PE及HLADR-FITC单克隆抗体各5μl,最后4℃孵育30min,上流式细胞仪检测，显示人脐带间充质干细胞表面抗原正常。
(2)将携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力。
进一步地，所述检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力采用观察脂肪滴形成的情况进行鉴定。
具体地，以每孔1.0×105个/cm2的密度接种于4个培养皿,当细胞达80％融合时,取其中2个培养皿加入成脂诱导分化液,成脂诱导分化液为在LG-DMEM中加入10μg/ml胰岛素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和200μmol/L吲哚美辛；成脂诱导第7天,倒置显微镜下即可见部分细胞胞质内脂滴形成；另2个培养皿作对照。每3-4d换液1次，第14天采用油红O染色，显微镜下观察脂肪滴的形成情况，得到图2。如图2所示，油红O染色呈阳性,但脂滴较小。
(3)将携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力。证明分离细胞具有成骨分化能力，符合干细胞特性。
具体地，细胞以每孔1.0×105个/cm2的密度接种于4个培养皿,当细胞达80％-90％融合时,取其中2个培养皿加入成骨诱导液，成骨诱导液含体积分数10％FBS,10-7mol/L地塞米松、50mg/L维生素C及10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的LG-DMEM培养基；另2个培养皿作对照。每3-4d换液1次，第14天用茜素红染色检测钙化基质沉淀，显微镜下观察，得到图3。如图3所示，可见钙化基质沉淀，分离细胞具有成骨分化能力，符合干细胞特性。
实施例4
将携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞具体为：
将不同感染复数的重组慢病毒颗粒感染293T细胞，筛选出最适感染复数；
具体为：将293T细胞以1×105个/孔接种于24孔板中，37℃培养；次日将病毒液37℃水浴融解，用含有5％FBS的HG-DMEM培养基10倍梯度稀释(10-1稀释至10-6)后感染细胞，24h后去除含慢病毒的培养基，加入2ml含有5％FBS的HG-DMEM培养基；48-72h在荧光倒置相差显微镜(100倍)下观察各孔中EGFP阳性表达细胞如图4所示，从图4可以看出，荧光倒置相差显微镜下，细胞膜及胞质中均有绿色荧光分布，转染效率约90％。离心后获得浓缩慢病毒，慢病毒滴度为1.3×108TU/ml。
将人脐带间充质干细胞以2×104个/孔接种于96孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜；次日用不同MOI(0、1、3、5、7、10、15、20)的重组慢病毒颗粒感染细胞，以表达EGFP绿色荧光的细胞为转染阳性细胞，如图5所示，分别于48h、72h、96h观察不同MOI(0、1、3、5、7、10、15、20)的转染结果。统计同一视野下转染阳性细胞数和总细胞数。根据以下公式计算转染效率：转染效率＝EGFP阳性细胞数/总细胞数×100％。转染效率90％以上的最低MOI值为最适MOI。从图5可以看出，最适MOI值为10，转染效率为90％，MOI值>10时，转染效率无明显升高。
将人脐带间充质干细胞以4-6×105个/孔接种于6孔培养板中，培养8-16h，在LG-DMEM培养基中加入终浓度为7-9mg/L的聚凝胺后，加入最适感染复数的慢病毒颗粒；
慢病毒颗粒加入5-7h后，将培养基更换为不含聚凝胺的LG-DMEM培养基，然后放置在37℃、体积分数5％CO2的培养箱中培养；慢病毒颗粒加入70-75h后收集细胞，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，然后对携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞检测人胰岛素基因的表达状况。采用QPCR和Western blot检测人胰岛素基因的表达，QPCR检测未转染组和转染组内参Ct值分别为28.98±0.65和26.81±0.19，比较差异无统计学意义(P>0.05)；两组人胰岛素基因Ct值分别为33.75±0.36和23.35±0.11，比较差异有统计学意义(P<0.05)；转染组2-ΔΔCt值是对照组的300.25倍。Westernblot检测植入物人胰岛素基因的表达得到图6，1：对照组细胞上清；2：转染组细胞上清；组3：对照组细胞裂解液；组4：转染组细胞裂解液；a为GAPDH；b为人胰岛素蛋白。从图6可以看出，转染组表达了人胰岛素蛋白，而对照组没有表达。
实施例5
支架材料是构建组织工程化组织的关键因素。支架的天然材料主要有：蚕丝、透明质酸、甲壳素、胶原和纤维蛋白等；人工合成材料主要有：聚阴氟乙烯、聚乙烯醉、聚乳酸(PLA)、聚乙酸醇(PGA)和聚乳酸一聚乙酸醇酸(PLGA)等。常用的支架主要有胶原支架、HYAFFll海绵支架(透明质酸衍生酯)、聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架等。
优选地，所述支架为丝素蛋白支架，丝素蛋白支架具有良好的机械特性和生物相容性、生物降解性，其来源丰富，价格低廉。此外，丝素蛋白支架与多功能干细胞在体外能够良好复合，而且，丝素蛋白对前脂肪细胞具有良好的吸附作用，并能维持前脂肪细胞的正常形态与功能；在免疫原性方面，丝素蛋白支架在整个植入期间，耐受性良好且动物和移植物免疫反应均轻微。进一步地，所述丝素蛋白支架的孔径为50-60μm，经验证，孔径为50-60μm的丝素蛋白支架为构建组织工程脂肪的最佳孔径。
优选地，在步骤(c)中，在所述复合培养前，将所述支架剪切成0.9-1.1cm×0.9-1.1cm×0.15-0.25cm大小，置于蒸馏水中，用γ射线灭菌，辐射剂量为10kGy；
将灭菌后的所述支架在超净台内用LG-DMEM细胞培养液浸泡24h，更换培养液2-4次，得到处理后的支架。
所用支架为丝素蛋白支架，将处理的1块丝素蛋白支架用4％戊二醛固定24h，扫描电镜观察，如图7所示,丝素蛋白支架具有天然多孔三维空间结构，支架内部孔径大小均一，且相互交通，孔径为50-60μm，孔隙率为90％。
将转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物。取转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞的细胞浓度为2-5×106个/ml的细胞悬液100μl，滴在支架上，然后放置于37℃CO2恒温培养箱内3-4h；添加LG-DMEM培养基完全淹没细胞和支架，置于36-38℃CO2恒温培养箱内培养，22-26h后更换为成脂诱导剂，培养5-7d，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物。将人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内，完成构建工程化脂肪。
所用支架采用丝素蛋白支架，将人脐带间充质干细胞-支架复合物移植于Wistar大鼠背部皮下两侧，左侧为转染组，右侧为对照组。12周后，断颈处死Wistar大鼠，取出植入物，肉眼观察植入物形态、大小、色泽，钳夹判断质地。然后进行生化鉴定。
石蜡切片与冰冻切片，具体为：将植入3个月后的植入物从Wistar大鼠体内取出，体积分数10％中性甲醛固定48h以上，进行石蜡切片。常规脱蜡脱水：将石蜡切片置于65℃烤片机中烤片2h以上，二甲苯脱蜡10min(37℃)2次，再依次经体积分数100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇、蒸馏水洗各3min，90℃蒸馏水水浴20min，2×SSC放置30s；晾干后对切片进行消化：37℃下蛋白酶K消化15min，体积分数10％中性甲醛中固定10min，2×SSC洗5min，依次经体积分数70％乙醇、85％乙醇、100％乙醇各3min，自然干燥玻片。
(1)将玻片分别行扫描电镜观察、苏木精-伊红染色后观察和油红O染色后观察。图8为扫描电镜(300倍)观察玻片图，显示移植物内脂肪样细胞聚集成团，其结构与正常脂肪组织相似；图9为苏木精-伊红染色后观察图(100倍)，显示脂肪样组织内及其周围可见新生血管；图10为油红O染色后观察图(160倍)，显示丝素蛋白材料降解明显，染色呈阳性，证明移植物为脂肪组织。
(2)将上述样本的石蜡切片运用荧光原位杂交检测标本中的性染色体荧光原位杂交：取10μl探针(购自北京金菩嘉公司)混合液(8μl杂交液+2μl探针)于上述处理的石蜡切片上，封固，置入杂交仪中，83℃变性5min后，37℃杂交过夜。次日，将杂交后的切片置入(46±1)℃的2×SSC洗10min，(46±1)℃的0.1％NP-40/2×SSC洗5min，然后室温下体积分数70％乙醇3min，暗处自然干燥玻片，最后加10μl二脒基苯基吲哚于杂交区域并盖上盖玻片，暗处放置10-20min，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察不同颜色的信号，通过IMStar软件进行图像合成，得到图11。如图11所示，红色荧光代表Y染色体，绿色荧光代表X染色体，移植物中细胞核同时显示一红一绿两个荧光信号，即移植物细胞有人X、Y基因表达，提示该移植物为外来物，并非Wistar大鼠自身所有，即为本方法所构建的组织工程化脂肪。
以上实施例所用的DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的基础培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型(HG-DMEM)低于4500mg/L和低糖型(LG-DMEM)低于1000mg/L。Opti-MEM I、HG-DMEM和LG-DMEM培养基均购自GIBCO公司。其他试剂均为生化领域常用的试剂。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种构建工程化脂肪的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒；
(b)将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞，得到转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞；
(c)将所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞与支架复合培养，得到人脐带间充质干细胞-支架复合物；
(d)将所述人脐带间充质干细胞-支架复合物移植到体内。
2.根据权利要求1所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，所述构建携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒包括以下步骤：
合成人胰岛素基因序列，对其扩增后测序；
将测序正确的人胰岛素基因与pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接，得到慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP；
将所述慢病毒表达载体pLenti6.3-insulin-IRES-EGFP转入DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆体；
对所述阳性克隆体进行培养繁殖，提取阳性克隆体的质粒；
将所述阳性克隆体的质粒转染至细胞293T，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒。
3.根据权利要求1所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测所述人脐带间充质干细胞表面抗原，所述表面抗原包括CD13、CD14、CD34、CD44及CD3。
4.根据权利要求1所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力。
5.根据权利要求4所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，所述检测人脐带间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的能力采用观察脂肪滴形成的情况进行鉴定。
6.根据权利要求4所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞前，检测人脐带间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力。
7.根据权利要求6所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(b)中，将所述携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞具体为：
将不同感染复数的慢病毒颗粒感染293T细胞，筛选出最适感染复数；
将人脐带间充质干细胞以4-6×105个/孔接种于6孔培养板中，培养8-16h，在LG-DMEM培养基中加入终浓度为7-9mg/L的聚凝胺后，加入最适感染复数的慢病毒颗粒；
所述慢病毒颗粒加入5-7h后，将所述LG-DMEM培养基更换为不含聚凝胺的LG-DMEM培养基，然后放置在36-38℃、体积分数4.5-5.5％CO2的培养箱中培养；所述慢病毒颗粒加入70-75h后收集细胞，得到携带人胰岛素的重组慢病毒颗粒转染人脐带间充质干细胞。
8.根据权利要求1所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，所述支架为丝素蛋白支架、透明质酸衍生酯海绵支架和聚乳酸一聚乙醇酸共聚物支架中的任一种。
9.根据权利要求8所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，在所述复合培养前，将所述支架剪切成0.9-1.1cm×0.9-1.1cm×0.15-0.25cm大小，置于蒸馏水中，用γ射线灭菌，辐射剂量为10kGy；
将灭菌后的所述支架在超净台内用LG-DMEM细胞培养液浸泡24h，更换培养液2-4次，得到处理后的支架。
10.根据权利要求9所述的构建工程化脂肪的方法，其特征在于，所述步骤(c)具体为：取所述转染人胰岛素的人脐带间充质干细胞的细胞浓度为2-5×106个/ml的细胞悬液100μl，滴在所述支架上，然后放置于36-38℃CO2恒温培养箱内3-4h；添加LG-DMEM培养基完全淹没细胞和所述支架，置于36-38℃CO2恒温培养箱内培养，22-26h后更换为成脂诱导剂，培养5-7d，得到所述人脐带间充质干细胞-支架复合物。
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