CN104928319B - hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法 - Google Patents

Abstract

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT‑PDLSC构建：本发明利用表达hTERT基因的慢病毒载体，在一定条件下将其感染原代培养的PDLSC，经过嘌呤霉素的抗性筛选，得到稳定表达hTERT基因的永生化细胞系，能够将细胞使用寿命从3‑8代延长至35代，得到性质稳定、功能良好、表型正常的永生化细胞模型；本发明在研究牙周膜干细胞对于牙周组织工程、研发有效的治疗牙周炎的药物方面具有有益效果。

Description

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法

技术领域

本发明属于细胞工程、基因工程和永生化技术领域，特别涉及一种hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，主要为人牙周膜干细胞的原代培养和鉴定、通过慢病毒载体构建稳定表达人端粒酶逆转录酶hTERT基因的细胞系，以及细胞系功能学和转化性的检测。

背景技术

慢性牙周炎(chronic periodontitis)作为人类口腔中常见的多发病，会依次出现牙周支持组织的炎症、出血，牙周附着丧失，牙周袋形成，牙槽骨破坏和吸收，最终引起牙齿松动和脱落，严重影响人类了生理和心理健康。从牙周组织的解剖结构看，牙周膜(periodontal ligament,PDL)是被新生牙槽骨和牙骨质所围绕的结缔组织。牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLC)是PDL的主要细胞群体，包括成纤维细胞、成牙骨质细胞、成骨细胞和破骨细胞、未分化间充质细胞。PDLC可表现多能成体干细胞特征，这取决于其中未分化间充质干细胞的存在，使其具有很强的增殖能力(可连续传数代和形成细胞克隆)，还可分化成其他细胞，对牙周骨组织的稳态和再生重建有重大意义。Seo等在2004年首次通过单细胞克隆培养的方法将牙周膜细胞群体中具有间充质干细胞功能的一组细胞分离并鉴定后正式命名为牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)，该细胞可表达间充质干细胞标记物：基质细胞抗原-1(STRO-1)、细胞黏附分子CD146和MUC18，克隆形成率高，可分化为成牙骨质细胞、脂肪细胞和成纤维细胞，植入免疫缺陷鼠中则可形成牙周韧带样结缔组织及牙骨质样结构。Gay也证实PDLSC不仅能分化为成牙骨质样和成骨样细胞，还可分化为成纤维样细胞，形成形态结构、空间排列类似天然牙骨质-牙周膜-骨样的复合体结构。这就说明：在异质性的牙周膜细胞群中确实存在着一部分间充质干细胞即牙周膜干细胞，其处于未分化状态并能够在不同的诱导条件下分化为牙周膜成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞，而牙周膜组织则是该干细胞的储池。因此PDLSC作为牙周组织工程种子细胞对牙周新附着的形成具有重要的研究和应用价值。随着分子生物学技术的大力发展，hPDLSC可向特定方向进行诱导和分化，或进行相关基因修饰，从而为牙周组织的再生开辟更为广阔的应用前景：作为种子细胞构建组织工程化牙周膜组织；使种植体周围的骨组织界面形成真正意义的牙周结缔组织；与其他口腔种子细胞一起联合构建组织工程化牙根甚至完整的牙齿结构。但是目前hPDLSC也还有许多问题亟待解决：(1)细胞容易受到环境、炎症、免疫和年龄等外界因素的影响而导致不稳定；(2)干细胞分离纯化与鉴别技术尚不成熟，获得的细胞数量较少；

(3)传代次数受限，随着细胞不断传代，其分化、增殖能力逐渐下降，同时干细胞特征也会丧失，大大限制了hPDLSC的进一步应用；(4)牙周组织形成过程非常复杂，利用hPDLSC在有限的时间内形成正常结构和功能的牙周组织需要漫长的过程，受到活体内其他各种因素的影响；(5)某些个体情况特殊，如DNA变异使自体干细胞出现缺陷而不能作为种子细胞时，就需要进行异体移植，因此而导致异质性来源的排斥、道德伦理和传染性疾病等也有待解决；(6)hPDLSC具有多向分化潜能和高度增殖能力，但目前的技术如不能精确控制其形成特定目的细胞，不排除有导致畸胎瘤的危险。

细胞永生化(cell immortalization)指在体外环境培养的细胞受到自发的或外界其他因素的干扰后，能逃离增殖衰老危机，从而具有无限增殖能力的过程。正常细胞发生自发性永生化的概率很小，啮齿类的动物大约为10^-5-10^-6，人类细胞则更低小于10^-12，因此大都通过转入外源性的永生化基因来获得细胞永生化状态。传统技术通过将外源性的永生化基因，如病毒(SV40、EBV)、原癌基因(Myc、Mdm2)和抑癌基因突变体(p53和pRb)等利用基因转染等技术导入目的细胞内来增加永生化发生的概率，建立无限增殖且表型稳定的永生化细胞株，为组织工程学、临床研究等提供性质稳定、功能良好的种子细胞。近年来大量研究发现细胞的永生化与端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)密切联系。端粒对于维持细胞寿命起着至关重要的作用，除了能够保持染色体的完整性，还对细胞生存期限起到关键性调控作用，而端粒功能障碍则会导致细胞增殖衰竭或凋亡。在体外培养过程中，随着细胞的不断分裂、传代，端粒长度呈现进行性的缩短而引发细胞衰老。因此，如何维持细胞端粒长度的稳定就成为研究的关键。影响端粒长度的因素有很多，而端粒酶被认为是维持端粒的结构和长度稳定的关键影响因子，在细胞永生化过程中发挥重要作用，其他的蛋白和细胞因子等都可以通过调节端粒酶的活性影响端粒长度，因此端粒酶成为永生化研究的热点。虽然端粒酶的激活可能是多种细胞因子参与的复杂调节过程，但端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)作为端粒酶中最重要的功能单位与这些调控息息相关。端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，由RNA和相关蛋白质组成，于1985年由Blackburn首次从四膜虫细胞提取物中发现，能以自身RNA为模板而不依赖DNA聚合酶，从端粒DNA的3’-OH末端延伸端粒或合成新的端粒DNA重复序列来维持端粒恒定长度，补偿细胞不断分裂时染色体末端的进行性缩短，防止细胞出现凋亡。即端粒酶具有特殊能力可以“自主”对端粒DNA中富含G的链进行延长，再通过“G-G配对”原则将终端回折形成特殊的发卡结构，使端粒DNA复制时新链5’端缺失得到补齐。正常情况下体细胞端粒酶表达受到严格调控，呈现瞬时表达或者低水平，不能检测到活性，细胞会衰老和死亡，而多数恶性肿瘤组织和永生化细胞中端粒酶活性为阳性表达，因此端粒酶的激活与肿瘤的发生密切相关。活性端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA(telomerase RNA,TR)、端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein,TEP)和端粒酶逆转录酶(telomerase reversetranscriptase,TERT)。哺乳动物TERT的转录由许多转录因子、激素、细胞外信号严格控制，不同转录因子调节TERT在不同细胞内含物中表达，而TERT启动子上游HPV增强子的整合可顺式激活TERT基因转录，这种顺式激活作用是TERT基因转录端粒酶调节的原发机制。原代培养细胞如能稳定表达TERT基因就能稳定端粒的长度，从而使细胞达到永生化状态，因此TERT的激活是细胞永生化的关键。相对于将SV40病毒或原癌基因myc、抑癌基因p53等导入目的细胞来建立永生化细胞系的传统方法，转入外源性TERT基因使细胞达到永生化具有很多优点：第一、TERT介导的永生化细胞属于正常细胞，而不是转化细胞，其生长特征、转化性和正常细胞一致；第二、端粒和端粒酶可以使细胞跨越细胞周期的M1期和M2期，维持端粒在恒定的长度，恢复染色体的稳定性，使细胞获得无限增殖和分裂的能力而达到永生化效果。这同胚胎干细胞一样属于真正意义上的永生化，而传统方法只跨越M1期使细胞寿命暂时得到延长。

目前也有通过将SV40病毒连同其他基因一起转染牙周膜细胞使其延长寿命的方法，但转染效率低，会引起细胞生物学功能部分丧失并表现出转化特征，以其作为细胞模型代表性差。因此迫切需要一种高效、快捷的方法构建出性质稳定、功能良好及表型正常的永生化基因工程细胞，作为研究人牙周膜干细胞生物学特征的有效细胞模型，为慢性牙周炎发病机制、牙周组织工程的再生应用提供有效的工具，也为进一步筛选有效地治疗慢性牙周炎的新型中药提供新的可能，因而有着十分重要的意义。发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，利用构建的表达hTERT基因的永生化基因工程细胞，作为研究人牙周膜干细胞生物学特性的有效细胞模型，有利于深入研究在牙周组织工程中作为种子细胞的应用，不同药物对细胞发挥作用和相关机制的信号转导通路，以及利用其筛选有效的治疗慢性牙周炎的中药有效成分，为后续研究牙周组织修复重建的机制、研发新型有效的药物提供有力的工具。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：

步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：

收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mLⅠ型胶原酶吹打混匀，置于37℃,5％CO₂,饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3-5d更换正常培养液一次，正常培养液成分为：体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5-10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞hPDLSC为长梭形、呈放射状生长；

步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT-PDLSC构建：

取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infectionsolution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形。

本发明的有益效果：

本发明利用过表达hTERT基因的慢病毒载体，在一定条件下将其感染原代培养的PDLSC，经过嘌呤霉素的抗性筛选，得到稳定表达hTERT基因的永生化细胞系，能够将细胞使用寿命从3-8代延长至35代，得到性质稳定、功能良好、表型正常的永生化细胞模型。本发明在研究牙周膜干细胞对于牙周组织工程、研发有效的治疗牙周炎的药物方面具有有益效果。

附图说明：

图1是原代和传代培养的hPDLSC，其中图1：(a)hPDLSC贴壁生长；(b)细胞克隆；(c)传代hPDLSC。

图2是hPDLSC的HE和免疫组化鉴定，其中图2：(a)HE染色；(b)波形蛋白免疫组化染色阳性；(c)角蛋白免疫组化染色阴性。

图3是免疫荧光法检测hPDLSC表面及核内特异性标记物的表达，其中图3：(a)STRO-1抗体染色；(d)CD146抗体染色；(g)OCT4抗体染色；(j)Nanog抗体染色；(m)CD34抗体染色；(b,e,h,k,n)为DAPI染色；(c,f,i,l,o)为复合。

图4是hPDLSC多向诱导染色，其中图4：(a)成骨诱导组茜素红染色；(b)正常对照组茜素红染色；(c)成脂肪诱导组油红“O”染色；(d)正常对照组油红“O”染色；(e)成软骨诱导组甲苯胺蓝染色；(f)正常对照组甲苯胺蓝染色。

图5是不同MOI的LV-EGFP感染hPDLSC(P3)3d后绿色荧光表达情况(×100)。

图6是不同浓度嘌呤霉素对hPDLSC(P3)的杀灭效果，其中图6：(a)不同浓度嘌呤霉素作用4d后对hPDLSC(P3)的杀灭效果(×100)；

(b)MTT检测细胞在不同浓度嘌呤霉素作用后不同时间点的生长情况。

图7是LV-hTERT感染hPDLSC(×100)，其中图7：(a)感染后24h；(b)嘌呤霉素筛选4d；(c)20d有细胞克隆形成；(d)hTERT-PDLSC(P5)；(e)hTERT-PDLSC(P15)；(f)hTERT-PDLSC(P35)。

图8是Real-time PCR检测hPDLSC感染前后TERT基因mRNA水平的表达，其中图8中各组数据均用(平均值±标准误)表示，n＝3是指3次重复实验的数据，其他各组均和hTERT-PDLSC P10这一组比较，差异都有统计学意义，其中**代表P<0.01，***代表P<0.001)。

图9是hPDLSC感染前后hTERT和Flag蛋白水平的表达，其中图9：(a)蛋白hTERT和Flag的表达；(b)hTERT蛋白水平的定量图；(c)Flag蛋白水平的定量图(与hTERT-PDLSC P10相比差异有统计学意义，*P<0.05；***P<0.001)。

图10是hPDLSC与hTERT-PDLSC形态学比较，其中图10：(a)P5代hPDLSC；(b)P10代hPDLSC；(c)P10代hTERT-PDLSC；(d)P35代hTERT-PDLSC。

图11是hPDLSC与hTERT-PDLSC细胞周期比较，其中图11：(a)P5代hPDLSC；(b)P35代hTERT-PDLSC。

图12是细胞β-半乳糖苷酶活性，图中表示其他各组均和hTERT-PDLSC P10这一组比较，***代表P<0.001。

图13是hTERT-PDLSC多向诱导染色，其中图13：(a)成骨诱导组茜素红染色；(b)正常对照组茜素红染色；(c)成脂肪诱导组油红“O”染色；(d)正常对照组油红“O”染色；(e)成软骨诱导组甲苯胺蓝染色；(f)正常对照组甲苯胺蓝染色。

图14是hPDLSC感染前后各标志物蛋白水平的表达，其中图14：(a)蛋白COL3α1,FGF2α,COL1,α-SMA的表达；(b)对COL3α1,FGF2α,COL1,α-SMA蛋白水平的定量图；(c)蛋白OPN,ALP的表达；(d)对OPN,ALP蛋白水平的定量图，图中**P<0.01；***P<0.001。

图15是细胞的血清依赖性实验，图中表示各组均和hPDLSC P5这一组进行比较，差异有统计学意义，其中*代表P<0.05。

图16是细胞软琼脂克隆形成实验，其中图16：(a)hPDLSC P5；(b)hTERT-PDLSCP35；(c)TCA-8113。

图17是hTERT-PDLSC染色体核型检测结果。

具体实施方式

以下叙述本发明的具体实施过程。应该说明的是，这些实施例对本发明只有说明作用，没有限制作用。

hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，包括以下步骤：

步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：

收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mLⅠ型胶原酶吹打混匀，置于37℃,5％CO₂,饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3-5d更换培养液一次，培养液为体积比79％的DMEM/F12培养基，体积比79％的20％胎牛血清，体积比79％的1％三抗三者混合物，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5-10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养)，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞(hPDLSC)为长梭形、呈放射状生长，

通过HE染色表明细胞的胞浆为红色，胞核为蓝紫色；免疫组化染色说明培养的细胞波形蛋白染色阳性、角蛋白染色阴性；免疫荧光染色说明细胞对STRO-1、CD146和OCT4强阳性表达，对Nanog弱阳性表达，CD34阴性表达；多向分化诱导染色表明细胞在成骨诱导(正常传代细胞培养基中加入地塞米松0.1μmol/L，维生素C50μg/mL，β-甘油磷酸钠10mmol/L)、成脂肪诱导(正常传代细胞培养基中加入地塞米松1μmol/L，IBMX 45μmol/L，吲哚美辛200μmol/L，胰岛素10μg/mL)和成软骨诱导(正常传代细胞培养基中加入丙酮酸钠100μg/mL，TGF-β3 10ng/mL，1％1×ITS，L-脯氨酸0.35mmol/L)条件下培养28天后，分别通过茜素红染色、油红“O”染色和甲苯胺蓝染色说明细胞具有成骨、成脂肪和成软骨诱导分化的能力。

1、PDLSC的原代培养、分离和传代、冻存

1)取材(提前告知患者本人及家人用途并征得同意)

选取因正畸治疗需要在西安交通大学附属口腔医院颌面外科门诊拔除的12-20岁青少年前磨牙，男女不限。入选条件：牙齿无龋病及非龋性疾病、无根尖周病及牙周病，术前根尖X线片显示所拔除牙齿根尖无明显骨质吸收、牙周膜清晰完整，患者无肝炎、结核等传染性疾病。2)牙齿拔除前患者口腔用1％H₂O₂含漱，1％碘酊消毒牙冠，待完整拔出牙齿后立即置于预冷含三抗的无菌D-Hanks液中暂存，避免碰及牙根表面。3)迅速将牙齿转移至超净工作台，置于培养皿中，用D-Hanks液反复冲洗牙冠及牙根表面，用手术刀片刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min，沉淀中加1mLⅠ型胶原酶吹打混匀后置于细胞培养箱消化。

4)组织块变松散后，加原代细胞培养基终止消化，培养24h后半量换液，以后每隔3-5d更换培养液一次，观察细胞贴壁和生长情况，结果参照图1(a)所示，说明为散在贴壁或从组织块中爬出，形态为长梭形，呈放射状或者漩涡状生长，形成生长晕；观察到有细胞克隆出现(参照图1(b)所示有多角形细胞克隆)，挑取细胞克隆至新的24孔板，培养至融合80％左右时转移至培养皿继续扩大培养、传代及冻存，结果参照图1(c)所示，说明传代后的细胞在3-8代形态均一稳定。

2、hPDLSC鉴定

1)HE及免疫组织化学染色鉴定

a)制备细胞爬片

将hPDLSC消化后接种于置有盖玻片的6孔培养板中培养，当细胞融合生长至50％-60％时取出盖玻片，PBS液漂洗后再经4％多聚甲醛室温下固定，PBS冲洗干净，37℃烘干，备染。

b)HE染色

(a)爬片浸入95％酒精固定15min，PBS漂洗2次；

(b)在苏木素染色液中染色5-10min，PBS漂洗2次；

(c)在稀盐酸酒精溶液浸泡数秒进行分色，PBS漂洗2次；

(d)在淡氨水中浸泡，使胞核蓝化3-5min，PBS漂洗2次；

(e)在伊红染液中染色5-10min，PBS漂洗2次；

(f)逐级脱水：过70％、80％、90％酒精各1次，95％酒精2次，无水乙醇3次，每次1min；

(g)透明：过二甲苯溶液3次，每次1min；

(h)封片：将盖玻片有细胞的一面向下置于载玻片上，盖玻片周围滴加中性树胶封固，显微镜下观察、照相。

结果参照图2(a)所示，说明细胞呈长梭形，胞体丰满，胞浆嗜伊红被染成红色，胞核嗜碱性而显示为蓝紫色，单个细胞核居于细胞中央呈圆形或椭圆形，内有核仁；细胞为放射状、旋涡状排列。

c)免疫组化ABC法染色

(a)用0.2％TritonX-100处理细胞爬片10min，PBS漂洗；

(b)浸入3％H₂O₂于室温孵育5-10min，PBS漂洗2次，每次5min；

(c)滴加5％-10％正常山羊血清封闭，在湿盒内37℃保温孵育15-20min，以消除非特异性染色，弃血清后勿洗，滴加适当比例一抗工作液，湿盒中37℃孵育1h，4℃过夜，次日PBS漂洗3次，每次5min；

(d)滴加适当比例稀释的二抗，湿盒内37℃孵育15-30min，PBS漂洗3次，每次5min；

(e)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(SABC复合物)，37℃孵育10-30min，PBS漂洗3次，每次5min；

(f)DAB显色：1mL蒸馏水中加DAB显色试剂盒的A、B、C试剂各一滴，混均后加至细胞爬片，室温下显色，镜下观察控制反应时间；

(g)细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗涤，迅速过盐酸酒精溶液分化，过氨水溶液返蓝，自来水重洗；

(h)逐级脱水：经过75％酒精1次，80％、90％、95％的酒精2次，无水乙醇3次，每级3-5min；

(i)透明：浸入二甲苯溶液透明，更换2-3次共约15min；

(j)封片：擦干切片周围二甲苯，将有细胞的一面向下置于载玻片上，周围滴加适量中性树脂封片，显微镜下观察、照相。

结果参照图2(b、c)所示，说明细胞波形蛋白呈阳性染色，见胞浆被染为棕黄色，而角蛋白染色为阴性。

2)免疫荧光检测细胞标记物的表达

a)取第3代hPDLSC，消化后接种于置有盖玻片的6孔培养板中培养，当细胞融合生长至60％-70％时终止培养，PBS漂洗2次；

b)每孔加4％多聚甲醛于室温下固定30min，PBS冲洗2次，每次10min；

c)加1mL 0.2％TritonX-100室温透化细胞10min，PBS冲洗3次，每次10min；

d)加入1mL 1％BSA溶液封闭细胞30min，PBS冲洗3次，每次10min；

e)每个盖玻片滴加适当比例一抗，4℃冰箱避光孵育过夜，次日PBS冲洗3次，每次10min；

f)加适当比例二抗室温避光孵育1h，PBS冲洗3次，每次10min；

g)加DAPI染液，室温避光孵育5min，PBS冲洗3次，每次10min；

h)载玻片上滴加抗荧光淬灭剂后，将盖玻片有细胞的一面向下铺平，适量中性树脂封片，荧光显微镜下观察并拍照。

结果参照图3所示，第1行经STRO-1、CD146、OCT4染色后胞质、胞核被特异性染为绿色，表达较强，Nanog胞质绿色染色较浅，CD34不明显；第2行是胞核均被DAPI染成蓝色；第3行是胞膜、胞质、胞核的特异性绿染和胞核蓝染的合成，说明原代培养的细胞STRO-1、CD146、OCT4是强阳性表达，Nanog弱阳性表达，而对CD34表达阴性，符合流式检测的结果。

4)多向诱导分化特异性染色a)取生长状态良好的第3代hPDLSC，调整细胞密度为1×10⁴个/mL，接种于12孔板内，每孔500μL，37℃培养箱内孵育；

b)镜下观察细胞80％融合时，吸弃原培养液，PBS冲洗2次；

c)分为4组(3个实验组：成骨诱导组(正常传代细胞培养基中加入地塞米松0.1μmol/L，维生素C50μg/mL，β-甘油磷酸钠10mmol/L)、成脂肪诱导组(正常传代细胞培养基中加入地塞米松1μmol/L，IBMX 45μmol/L，吲哚美辛200μmol/L，胰岛素10μg/mL)和成软骨诱导组(正常传代细胞培养基中加入丙酮酸钠100μg/mL，TGF-β3 10ng/mL，1％1×ITS，L-脯氨酸0.35mmol/L)、对照组)，每组设3个复孔，实验组每孔加入成骨、成脂肪、成软骨诱导液1mL，对照组加正常培养液1mL；

d)标准环境培养，观察细胞形态变化，隔3d换液1次，28d停止诱导；

e)PBS清洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min后双蒸水清洗3次，用不同的染色液进行染色。

结果参照图4所示：成骨诱导—茜素红染色：诱导组见细胞被染成浅粉色，大量的钙化结节被染成紫红色(图4-a，箭头所示即为钙化结节)，对照组细胞只是细胞被染成淡粉色，排列密集，并无紫红色钙化结构形成(图4-b)；成脂肪诱导—油红“O”染色：诱导组细胞被苏木精染成蓝色，形态无明显改变，细胞连接处有串珠样、葡萄样的圆形脂滴被油红“O”染成橘黄色或者橙红色(图4-c，箭头示即为脂滴、脂肪颗粒)，周围还有一些未聚集的单个脂滴，而对照组只能观察到细胞被染成蓝色，无脂滴或脂肪颗粒形态(4-d)；成软骨诱导—甲苯胺蓝染色：诱导组细胞生长密集，形成大量纤维条索被染成蓝色(图4-e箭头所示)，而对照组无明显纤维结构(图4-f)。说明细胞具备向成骨、成脂肪、成软骨多向诱导分化的能力。

步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT-PDLSC构建：

取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infectionsolution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形。

通过实时定量PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平分别说明感染细胞能够表达hTERT基因；将本发明得到感染细胞通过细胞状态、细胞周期检测、β-半乳糖苷酶活性测定、多向诱导分化能力和Western blot等方法鉴定，结果表明感染后细胞传至35代时仍然为形态规整的长梭形，周期检测其增殖能力较强，β-半乳糖苷酶活性很低、不易衰老，具有成骨、成脂肪、成软骨诱导分化能力，能够具备原始细胞表达COL3α1、FGF2、OPN、COL1、α-SMA、ALP的能力；再通过血清依赖性、软琼脂克隆以及染色体核型，说明感染细胞仍然具备对血清的浓度依赖性，在软琼脂中不能正常生长增殖，染色体形态结构、数目正常，为正常的二倍体细胞，这说明本发明中将hTERT基因通过慢病毒载体转入人牙周膜干细胞后能够得到生长增殖活跃、具备干细胞活性、表型正常的永生化人牙周膜干细胞。

1、确定慢病毒的最佳感染复数(MOI)

将第3代生长状态良好的hPDLSC用胰酶消化后调整细胞密度为5×10⁴个/mL，接种于24孔板，每孔500μL；24h后镜下观察细胞贴壁良好，每孔加入500μLEnhanced infectionsolution(ENi.S.)和polybrene(5μg/mL)，再根据不同MOI值(100、75、65、50、30、10)加入不同量的对照病毒，每组设3个复孔；24h后换正常培养液，2d后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，通过感染后细胞生长情况和荧光表达的强弱选择最佳MOI值用于后续实验。

结果参照图5所示：对照病毒感染细胞3d后细胞的生长和荧光表达情况，各个MOI值时细胞均能观察到绿色荧光，但相比较MOI＝65，MOI＝75、100时基本所有存活细胞都有EGFP表达，但存活细胞数目较少，说明MOI较大时虽然感染效率较高，但高浓度病毒本身的毒性作用会使部分细胞死亡从而抑制细胞生长，MOI＝10、30、50时细胞数目虽然较多，但是能够表达荧光的细胞所占比例较少，即病毒浓度较低时虽然对细胞生长没有毒性作用，但是其感染效率同时也会降低。因此，结合细胞生长和感染效率两方面综合考虑选择MOI＝65作为后续LV-hTERT感染细胞的最佳感染复数。

2、确定嘌呤霉素抗性筛选浓度

取第3代正常hPDLSC经胰酶消化后调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔500μL细胞悬液接种于24孔板，培养24h后待细胞贴壁稳定，按不同嘌呤霉素浓度分为6个实验组(0、1、2、3、5、10μg/mL)，每组设3个复孔，静置培养观察4d，选择能使细胞全部死亡的最低浓度作为嘌呤霉素的最佳筛选浓度。

结果参照图6所示：4d后于显微镜下观察发现0μg/mL组细胞生长良好，1μg/mL仍有零星细胞存活，而2、3、5、10μg/mL组均无细胞存活，大量死细胞皱缩成球形漂浮在上清液中。因此选择2μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选适宜浓度。

3、携带hTERT基因的目的病毒感染细胞

取第3代生长状态佳的hPDLSC消化后调整细胞密度为1×104个/mL，接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，每孔加Enhanced infection solution(ENi.S.)、polybrene(5μg/mL)，以及MOI＝65的病毒原液共500μL混匀；24h后换正常培养基，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d换液1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片沾湿胰酶于标记克隆处停留5-10s，将克隆转移至新的12孔板，加入新鲜培养基继续培养，生长至80％时扩大培养。

结果参照图7所示：用携带目的基因hTERT的慢病毒以MOI＝65感染生长状态良好的第3代hPDLSC，24h后有部分细胞死亡，贴壁细胞形态无明显改变(如图7-a)；2μg/mL嘌呤霉素抗性筛选后细胞增殖缓慢，4d后有一些未被感染的细胞死亡、漂浮(图7-b)；换用正常培养液后细胞生长逐渐恢复正常，20d左右可见单个细胞出现了克隆团块(图7-c)；挑取单细胞克隆团块至新的培养皿扩大培养至第5代(图7-d)、第15代(图7-e)、第35代(图7-f)，细胞形态无明显改变，增殖活跃。

4、感染细胞中目的基因hTERT的表达

1)实时定量PCR检测hTERT-PDLSC中hTERT mRNA表达

(1)Trizol法提取细胞总RNA：

取生长状态佳的第5代hPDLSC，传至第10代已衰老的hPDLSC，感染后的第10、35代hTERT-PDLSC，空白病毒感染的第7代EGFP-PDLSC，舌癌细胞TCA-8113，细胞计数达1×10⁷个/mL，按照RNA提取说明书进行操作：

(a)细胞裂解：预冷PBS冲洗细胞1-2次，加入1mL Trizol轻晃使其完全浸润细胞表面，室温静置5min，反复吹打使细胞裂解充分，收集液体至1.5mL EP管中；

(b)RNA分离：加入200μL氯仿，剧烈震荡试管15s，室温静置5min，4℃，12000rpm，离心15min；

(c)RNA沉淀：吸取上层水相至新的1.5mL EP管(约400-500μL，)，加500μL4℃预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min；

(d)RNA洗脱：小心弃去上清液，留取沉淀，缓慢顺管壁加入1mL现配的75％乙醇颠倒混匀振荡洗涤RNA沉淀，12000rpm离心5min，重复3次；

(e)RNA再溶解：小心吸弃乙醇上清，留取沉淀，于超净台中放置直至RNA沉淀变透明，加入10μL 0.1％DEPC溶解并混匀沉淀RNA；

(f)RNA保存：RNA测定浓度后可保存于-70℃超低温冰箱，或立即逆转录。

(2)逆转录反应

按照PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)Sample试剂盒说明书进行，冰上操作，加样方法如表1所示：

表1 逆转录反应加样表

PCR仪设置逆转录反应条件如下：37℃15min(逆转录)；85℃5s(逆转录失活)；4℃维持得到的cDNA，-20℃长期保存或直接进行PCR。

(3)聚合酶链式反应(PCR)：

采用Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒进行实验，加样方法如表2，步骤如表3，引物设计(根据Gene Bank数据库基因的mRNA序列设计引物)如表4所示：

表2 PCR反应加样表

表3 PCR反应步骤

表4 Real time PCR引物设计

结果参照图8所示：感染前细胞中对hTERT基因基本不表达，而感染后hTERT-PDLSC能够表达hTERT，随着不断传代其表达虽略微下降，但直到第35代，相对于未感染细胞仍然能够高表达hTERT；TCA-8113作为恶性肿瘤细胞，其端粒酶活性已处于激活状态，以其作为阳性对照说明hTERT在无限增殖的肿瘤细胞中能够表达；而感染了对照病毒LV-EGFP的细胞也不表达hTERT说明病毒本身对细胞表达hTERT基因并没有影响。

2)Western blot检测hTERT蛋白水平的表达情况。

(1)蛋白样品的制备(利用RIPA蛋白裂解液提取贴壁细胞总蛋白)：

分组培养第5代hPDLSC和目的病毒感染后第10、35代hTERT-PDLSC细胞，待细胞达90％融合时，弃培养基；用预冷PBS冲洗2次后置于冰上，加入蛋白裂解液1mL，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上裂解30min；收集裂解的细胞至1.5mL离心管，4℃，12000rpm，离心5min，取上清进行BCA蛋白定量。

(2)蛋白样品煮沸变性：提取的蛋白上清液按体积比例与上样缓冲液混匀后于沸水中煮沸5-10min，-20℃保存备用。

(3)SDS-PAGE电泳：

(a)10％分离胶和4％浓缩胶配制方法如表5所示：

表5 SDS-PAGE电泳分离胶和浓缩胶配置表

(b)玻板和胶架清洗干净后晾干，安装胶架后先加10％分离胶溶液，异丙醇推赶气泡，约30min凝固后上层加入4％浓缩校，插入选好的梳子，20min后待浓缩胶凝固，将梳子垂直向上轻轻拔出，将胶放入电泳槽；根据蛋白定量的结果计算上样量(按照每个样品加样30μg)；微量进样器吸取marker和不同的样品缓慢加至加样孔中；通电后以浓缩胶电压80V，分离胶电压100V电泳2h至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。

(4)转膜：

以Marker为标准切取目的蛋白分子量大小的胶，在转膜夹子上按方向依次放好滤纸、胶、PVDF膜、滤纸后将整个夹板保持紧密，放入转膜槽，以电流90mA转膜1h左右拿出膜(最好放入冰浴环境中降温进行)。

(5)封闭：放入含10％脱脂奶粉的TBS溶液后在摇床上慢摇封闭2h；

(6)结合适当比例一抗，4℃过夜；

(7)漂洗：用PBST在摇床上室温漂洗3次，每次10min；

(8)结合适当比例二抗，37℃避光孵育1h后再次漂洗3次；

(9)发光、显影。

结果参照图9所示：感染前细胞hTERT蛋白水平基本不表达，而感染后hTERT-PDLSC直到第35代，相对于未感染细胞仍然能够高表达hTERT；由于LV-EGFP载体为UBI-EGFP-Flag-IRES-PURO，LV-hTERT载体为UBI-MCS-3Flag-IRES-PURO，通过检测未感染细胞、感染LV-EGFP细胞、感染LV-hTERT细胞中Flag蛋白的水平来说明Flag tag融合蛋白在细胞内的表达情况：图9显示未感染细胞和TCA-8113均未见Flag蛋白表达，而LV-EGFP感染细胞在30kD左右(EGFP28kD+Flag 2kD＝30kD)有蛋白条带，LV-hTERT感染细胞在124kD(hTERT122kD+Flag 2kD＝124kD)有蛋白条带显影，说明病毒已成功转入细胞。

(三)、hTERT-PDLSC生物学及功能学特性的检测

1、形态学特征

将第5、10代的hPDLSC和第10、35代的hTERT-PDLSC接种于小培养皿中，待细胞生长至80％左右时终止培养，PBS洗涤3次，纯甲醇固定细胞15min后用Giemsa染液染色20min，自来水缓慢洗去多余染液、干燥，观察细胞形态、拍照。

结果参照图10所示：第5代hPDLSC和感染后第10、35代的hTERT-PDLSC形态无明显差异，均呈现为均一的长梭形，胞体丰满，单层生长，而未感染的hPDLSC到第10代见细胞形态不规整，多数为多角形，边缘不清晰。

2、细胞周期

分别取第5代hPDLSC和第35代的hTERT-PDLSC，调整密度为1×10⁶个/mL，PBS清洗2次，800rpm离心3min，弃上清；加入4℃预冷75％乙醇1mL，轻柔吹打均匀，4℃固定过夜后1000rpm离心3min，弃上清，PBS洗涤2次，尽量去净乙醇；用加了PI和RNA酶抑制剂的PBS混匀，4℃避光孵育30min，488nm波长下流式细胞仪上机检测并分析细胞周期分布。

结果参照图11所示：hPDLSC(P5)的G0/G1期所占比例为85.48％，G2/S期比例为12.59+1.93＝14.52％；而hTERT-PDLSC中G0/G1期和G2/S期所占比例分别为83.3％和16.7％。不同组细胞的周期结果和其生长状态是保持一致的：hPDLSC(P5)的大多数细胞处于G0/G1期即DNA合成前期(为DNA复制和蛋白质合成做物质准备)，而G2/S期(细胞DNA合成期)的细胞数目较少，表明其克隆形成能力和增殖潜能较大；而感染后P35代hTERT-PDLSC和P5代hPDLSC相比较，处于G0/G1期的比例稍微有所降低，S期比例则略增高，但差异性不大，说明其细胞的增殖活性仍然较强，异质性大，分化程度较低。3、

衰老相关因子(β-半乳糖苷酶)活性的测定

细胞分组：P5、P10的hPDLSC，P10、P35的hTERT-PDLSC，舌鳞癌细胞系Tca-8113。

各组细胞在培养皿中生长至80％时，弃培养基，4℃预冷PBS冲洗2次后置于冰上，加入1mL RIPA细胞裂解液，冰上裂解30min，反复吹打培养皿底，收集细胞裂解液至1.5mLEP管，4℃，12000rpm，离心5min，取上清保存于-70℃备用，待样品收齐后用Elisa法检测。

结果参照图12所示：第5代hPDLSC和感染后第10、35代细胞其β-半乳糖苷酶活性都很低，与TCA一致，而第10代hPDLSC的β-半乳糖苷酶活性则大大升高，说明正常细胞培养至一定代数就会出现细胞衰老的情况，而hTERT基因的转入则可以维持端粒酶活性，延缓细胞衰老。

4、多向诱导分化能力

实验分组：P35的hTERT-PDLSC在成骨、成脂肪、成软骨不同诱导条件下进行培养及染色，实验方法同前。

结果参照图13所示：感染后细胞hTERT-PDLSC传至P35代时在成骨、成脂、成软骨条件诱导培养基中培养28d后仍然可以出现诱导分化细胞的特异性物质，也就是说慢病毒感染原代细胞后并没有改变其多向诱导分化的能力。

7、细胞标记物的表达

实验分组：P5的hPDLSC和P15、P35的hTERT-PDLSC。实验方法同前。

Western blot实验中所用的抗体信息如表6所示：

表6 Western blot抗体信息

结果参照图14所示：成纤维细胞标记物FGF2α和骨相关表面分子COL1在第10代感染后细胞中的表达比原代hPDLSC明显增高，而到第35代时又会有所下降到与原代无明显差异；其他的成骨、成纤维、BMSC相关的标记物在感染前后的hPDLSC的表达无明显差异。这就说明了本实验通过慢病毒将外源性的hTERT基因转入原代培养的hPDLSC后不但使细胞具有永生化特征，同时细胞原来具有的干细胞特性并没有改变，仍然可以表达其特异性标记物。

(四)致瘤性检测

1、血清依赖性实验

将第5代hPDLSC、第35代hTERT-PDLSC和TCA-8113按3000个/mL密度接种于96孔板，每孔200μL，每组8个复孔；接种24h后分别换含0％、2％、5％和10％FBS的DMEM/F12或1640培养基，标准环境培养7d后终止，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，37℃孵育4-6h，吸弃孔内液体，每孔加入150μL DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔于490nm波长的吸光度值，进行统计学分析。

结果参照图15所示：hPDLSC和hTERT-PDLSC均不能在无血清培养基中正常生长、增殖，有大量细胞死亡、漂浮，随着血清浓度从2.5％增高到10％，可显著促进细胞增殖，二者对血清的依赖性相似；而恶性肿瘤细胞或转化细胞则可在无血清环境中生长，且不同浓度血清对生长增殖差异不大，可能是其自分泌生长因子后对血清等营养物质依赖性下降。

2、软琼脂克隆形成实验

通过软琼脂克隆形成实验来观察细胞悬浮生长能力。用双蒸水和低熔点琼脂糖配置琼脂糖凝胶(底层凝胶浓度为1.2％，上层为0.8％)，高温高压消毒灭菌；底层凝胶与DMEM或1640培养基充分混匀，加入6孔板中；取第5代hPDLSC、第35代hTERT-PDLSC和TCA-8113细胞制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁴个/mL，取上层凝胶与细胞悬液混匀，加入6孔板培养，2-3w后观察克隆形成情况。

结果参照图16所示：比较第5代hPDLSC、35代hTERT-PDLSC和TCA-8113在软琼脂中培养28d后的生长状况，可见前两者呈现单细胞悬浮状态，未见细胞增殖呈团块状(图16-a,b)；而TCA-8113则可观察到上层软琼脂中有大量的细胞克隆团块形成(图16-c)。3、染色体核型的检测

采用胰蛋白酶-Giemsa染色法，利用低浓度胰蛋白酶消化处理有丝分裂中期染色体，使染色体上非组蛋白去除或重新分布，经Giemsa染色后观察染色体带型。

结果参照图17所示：hPDLSC和hTERT-PDLSC接种后5d进入对数生长期，10d后细胞生长到培养皿底部面积90％左右，达到接近汇合的状态，增殖速度会下降，15d左右细胞完全汇合长满底部，但无复层生长现象，20d后会观察到这两组细胞开始死亡，漂浮于上清液中；而恶性肿瘤细胞可以在底部生长汇合后出现复层生长现象。

Claims (1)

1.hTERT慢病毒重组体永生化人牙周膜干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、原代人牙周膜干细胞(hPDLSC)的培养：

收集拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3牙周膜组织，800rpm离心5min后，沉淀中并按照1个牙取得的组织都加1mLⅠ型胶原酶吹打混匀，置于37℃， 5％CO₂， 饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化至组织松散，每隔3-5d更换正常培养液一次，正常培养液成分为：体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5-10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第3代生长状态佳的人牙周膜干细胞hPDLSC为长梭形、呈放射状生长；

步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化基因工程细胞系hTERT-PDLSC构建：

取步骤一培养得到的第3代生长状态佳的hPDLSC消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infectionsolution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用含2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞为长梭形；细胞传至35代时仍然为形态规整的长梭形，周期检测其增殖能力较强，β-半乳糖苷酶活性很低、不易衰老，具有成骨、成脂肪、成软骨诱导分化能力，能够具备原始细胞表达COL3α1、FGF2、OPN、COL1、α-SMA、ALP的能力，且生长增殖活跃、具备干细胞活性、表型正常的永生化人牙周膜干细胞特性，具有永生化特征，同时细胞原来具有的干细胞特性并没有改变，仍然可以表达其特异性标记物。