CN104630142A - 一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法，包括:获取胎牛脐带，组织块贴壁法分离细胞；当细胞爬出后，完全培养基培养；当细胞融合度达到80％～90％后，消化1～3min，终止消化、吹打，获得牛脐带间充质干细胞；所述完全培养基为添加了EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5～10ng/mL，PDGF的浓度为5～10ng/mL。本发明采用组织块贴壁法对牛脐带MSC进行了原代分离，在无血清培养基中加入了EGF及PDGF进行培养扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的牛脐带MSC。在培养体系中添加了EGF及PDGF，不仅促进了该细胞的体外扩增，并抑制了该细胞在体外培养的分化。

Description

一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种组织细胞。

MSC由于具有自我更新和多向分化的潜能，成为了近年来研究的热点。大量研究证实，MSC可以从骨髓分离得到，但也存在于其他不同组织和脏器，如肌肉、脂肪组织、脐血、脐带、胎盘、血管等。

脐带是哺乳类具有的连接胎儿和胎盘的管状结构,由两条动脉、一条静脉以及包裹于它们表面的胶冻状组织-华通氏胶(Wharton's jelly)所组成。2003年Romanov等从脐静脉内皮、脐带华通氏胶和血管周围组织中分离获得了MSCs。脐带来源的MSC经过原代培养后形成的成纤维细胞，它们的形态、表面标记及其分化潜能与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)相似。

来源于脐带的MSC，由于属于胚胎外组织，是胎儿分娩后的废弃物，来源广泛、获得成功率高、含量高、增殖能力强、免疫原性低、生物性能稳定、无社会伦理道德限制等优点。

目前针对牛脐带MSC的分离方法尚未建立，现有技术中对于人脐带MSC研究得较多，主要的分离方法是酶消化法跟组织块贴壁法。酶消化法分离脐带间充质干细胞的方法存在一些缺点，酶消化的过程需要消耗一定的时间，延长了分离的时间；而且使用胰酶或胶原酶消化脐带，也大大增加了分离过程的成本；再次，酶消化法过程较为繁琐，且在分离的效果上稳定性较差。组织块贴壁法虽然在获得原代细胞的时间上比较长，但是其操作上比较简单，成本也比较低，因此更加适合推广与应用。另外，分离所得到的原代细胞一般数量较少，需在体外进行传代扩增，现有技术中常见的培养体系就是采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行脐带MSC的体外培养与扩增。

发明内容

本发明技术以牛脐带为组织材料，采用了操作较为简便的组织块贴壁法对牛脐带进行了MSC的原代分离，并对其进行了扩增培养，成功分离得到了牛脐带MSC。扩增培养体系在无血清培养基(厂家：Lonza，商品名：通用Ultra CULTURE无血清培养基)，并添加了表皮细胞生长因子(EGF，浓度范围5～10ng/mL)以及血小板衍生因子(PDGF，浓度范围5～10ng/mL)，促进了牛脐带MSC的高效扩增。

现有技术中酶消化法分离脐带MSC的方法存在一些缺点，酶消化过程延长了分离的时间；而且使用胰酶或胶原酶消化脐带，也大大增加了分离过程的成本；再次，酶消化法过程较为繁琐，且在分离的效果上稳定性较差。另外采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)的培养体系，细胞生长必须依赖于胎牛血清，培养的细胞分化或衰老得较快。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法，包括以下步骤:

(1)获取胎牛脐带，获得牛脐带组织块，剪碎，将完全培养基加到组织块中，吹打均匀后转移到细胞培养皿中；

(2)摇晃培养皿使组织块均匀分布于培养皿中，转移至细胞培养箱中培养，并定期添加完全培养基；

(3)当细胞爬出后，弃掉旧培养基及组织块，用PBS清洗培养皿后，加入完全培养基继续置于细胞培养箱中培养；

(4)当细胞融合度达到80％～90％后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，加入含EDTA的胰酶混合液进行1～3min，待80％～90％细胞变圆即加入完全培养基终止消化，，并将细胞吹打成单细胞悬液，获得牛脐带间充质干细胞；

所述完全培养基为添加了EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5～10ng/mL，PDGF的浓度为5～10ng/mL。

优选，步骤(1)所述完全培养基的加入量是每1cm脐带添加1ml完全培养基。

所述定期添加完全培养基是每隔3-5天添加一次，每次完全培养基的添加量为3ml。

优选，所述获取胎牛脐带的步骤包括：

(1)取4月龄带子宫的胎牛，低温运输箱中保存，3小时内送至实验室；

(2)在超净台中从子宫中取出胎牛，用剪刀剪断脐带，放入装有预冷的75％乙醇的玻璃平皿中浸泡10s；

(3)将脐带转移到另一个装有预冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血钳夹住脐带一端，用平镊挤掉血管中的血液，并清洗脐带表面血渍；重复清洗一次获得胎牛脐带。

优选，所述获得牛脐带组织是将胎牛脐带剪成1cm的小段，用组织镊剥掉脐带外面的膜，再去除动脉和静脉，把获得的组织剪至1mm³大小。

所述细胞培养箱的培养条件是5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％。

优选，所述无血清培养基为Lonza公司的通用Ultra CULTURE无血清培养基。

步骤(4)所述胰酶混合液中EDTA的浓度为0.01g/L，胰酶的浓度为0.25g/L，浓度均为质量体积比。

现有技术存在缺点的导致原因：

1、酶消化是一个较缓慢的过程，在操作上也比较繁琐，消化后还需要经过离心收集与洗涤去掉胰酶或胶原酶，所以处理起来所需的时间比较长。

2、胰酶或胶原酶是比较贵的生物制剂，所以采用酶消化法相对组织块贴壁法，成本会大大提高。

3、经过酶消化后的细胞贴壁性较差，导致了分离效果的不稳定。

4、原有的培养体系中，细胞的生长必须依赖于胎牛血清，而且没有添加EGF及PDGF成分，EGF及PDGF可以促进该细胞的增殖，抑制该细胞的分化。

本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：

(1)现有技术中一般采用酶消化法进行脐带MSC的原代分离，而培养体系是一般都采用DMEM/F12培养基加上体积比为10％的胎牛血清(FBS)进行MSC的体外培养，本发明采用了组织块贴壁法，操作简便，成本也较低，而且得到的MSC纯度比较高。

(2)本发明采用组织块贴壁法对牛脐带MSC进行了原代分离，在无血清培养基中加入了EGF及PDGF进行培养扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的牛脐带MSC。在培养体系中添加了EGF及PDGF，不仅促进了该细胞的体外扩增，并抑制了该细胞在体外培养的分化。

(3)在组织块爬出细胞阶段，采用逐步添加培养基的方法，相对于一次性加入大量的培养基的方法，该方法可提高组织块贴壁率，进而加快细胞爬出的速度。

附图说明

图1为脐带MSC细胞的生长曲线图；

图2为牛脐带MSC原代细胞形态图；

图3为牛脐带MSC P3代细胞形态图；

图4为牛脐带MSC P3代细胞流式鉴定图；

图5为对比例细胞形态的对比图。

具体实施方式

实施例1牛脐带MSC的分离及培养

1、采集胎牛脐带

(1)取4月龄带子宫的胎牛，低温运输箱中保存，3小时内送至实验室。

(2)在超净台中从子宫中取出胎牛，用剪刀剪断脐带，放入装有预冷的75％乙醇的玻璃平皿中浸泡10s。

(3)将脐带转移到另一个装有预冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血钳夹住脐带一端，用平镊挤掉血管中的血液，并清洗脐带表面血渍。重复清洗一次。

2、牛脐带的分离

(1)将脐带剪成1cm的小段，用组织镊剥掉脐带外面的膜，再去除动脉和静脉，把获得的组织(即华通氏胶)撕成小块。

(2)把获得的组织块用眼科剪剪至1mm³大小，然后转移到离心管中，将5mL完全培养基加到组织块中，吹打均匀后接种于直径为15mL的培养皿中。

(3)摇晃培养皿使组织块均匀分布于培养皿中，做好标记后转移至5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％的细胞培养箱中培养。

(4)每三天添加3mL的完全培养基。

3、牛脐带MSC原代细胞培养

定期观察细胞爬出的情况，当观察到有细胞爬出后，弃掉培养基及组织块，用PBS清洗后加入新鲜的完全培养基继续置于细胞培养箱中培养。当细胞融合度达到80％～90％后，即可进行传代处理。

4、牛脐带MSC传代培养

(1)弃去旧培养基，用PBS轻轻洗两遍后，加入质量体积比为0.25％胰酶(含0.01％EDTA)进行消化2min，待80％～90％细胞变圆后立即加入完全培养基终止消化，并将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，按1:3的比例进行细胞传代。

(2)根据细胞生长的情况，每隔2～3天更换一次培养基，当细胞的融合度达到80％～90％，则进行细胞传代。

所述完全培养基为添加了EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5ng/mL，PDGF的浓度为10ng/mL。

取实施例1中分离培养得到的P3代细胞，采用胰酶消化后用完全培养基按1×10⁴/mL接种到二十四孔板上，每孔1mL体系。每隔24h取三孔细胞分别进行胰酶消化和细胞收集，并进行细胞计数算出三个孔细胞数量的平均值。连续进行细胞计数七天，再根据实验结果，绘制出该细胞的生长曲线。实验结果见图2，由图1可以看出该细胞的生长曲线呈“S”型，可分为3个生长时期：1～2天为迟缓期，细胞增殖较慢：3～5天为对数生长期，细胞增殖速度变快，呈对数生长；6～7天为平台期，细胞增殖减缓。通过该生长曲线，可看出该细胞的生长及增殖情况符合MSC细胞的生长特点。

实施例2牛脐带MSC细胞鉴定

1、形态学观察

定期在倒置显微镜下观察原代细胞以及传代后每一代细胞的生长情况及形态变化，初步判定细胞的类型及纯度。细胞的形态见图2及图3；图2为组织块贴壁后爬出来的原代细胞，在组织块附近呈集落式生长，细胞形态为梭形成纤维状，符合间充质干细胞的形态特点。

图3为牛脐带MSC P3代细胞，由图可见细胞状态较好，为梭形、成纤维状，形态均一可初步判定该细胞纯度较高。

2、流式检测表面标志物

选择P3代的牛脐带MSC细胞，采用胰酶消化收集后制成单细胞悬液，取一定量细胞加入带有免疫荧光的抗体进行孵育，进行MSC表面标记物的流式检测。加入的抗体分别为CD34(阴性表达)、CD45(阴性表达)、CD44(阳性表达)、CD90(阳性表达)。

流式结果见附图4

图4为牛脐带MSC P3代细胞的流式鉴定结果。本次实验挑选了四个MSC细胞的特异性标记，分别是CD34、CD44、CD45、CD90。流式结果显示CD34^-CD44⁺的细胞比例高达96.7％，CD45^-CD90⁺的细胞比例高达95.6％。说明采用本发明方法分离培养得到的牛脐带MSC细胞表面表达的特异性标记符合MSC的特性，并且纯度较高。

对比例1 FGF在牛脐带MSC培养过程中的作用

现有技术中有文献将EGF、PDGF、FGF联合使用，本对比例将对FGF在牛脐带MSC在培养过程中的作用进行效果对比实验。取实施例1中分离培养得到的P3代细胞，采用胰酶消化后用Ultra CULTURE无血清培养基按1×10⁴/mL接种到六孔板上，每孔2mL体系。PDGF、EGF和FGF按照不同的添加方式进行添加，并进行两次平行实验，添加的方案如表1。定期观察细胞生长状态及形态变化，每3天进行一次换液，第7天对细胞进行拍照，附图5即为细胞形态的对比图片，其中图5-A、图5-B、图5-C、图5-D、图5-E和图5-F分别对应表1中第(1)、(2)、(3)、(4)和(5)组的添加方案。再用胰酶消化收集细胞，用细胞计数仪进行细胞计数。细胞计数的结果见表2。

表1

(1)54×104cell	(3)82×104cell	(5)85×104cell
			(2)57×104cell	(4)84×104cell	(6)82×104cell

表2

由本对比例可得出以下结论：

1、由(1)(2)组及(3)(4)组的细胞计数结果对比可以得出，EGF、PDGF联合使用可明显促进牛脐带MSC的增殖；而通过细胞形态的比较，可以看出EGF、PDGF联合使用的(3)(4)组的细胞在形态上较好，为梭形、成纤维状，形态也较均一。而没有加入EGF、PDGF的(1)(2)组细胞密度比较稀疏，形态上有较大的改变，部分细胞已经开始出现分化现象。

2、由(3)(4)组及(5)(6)组的细胞计数结果对比可得，EGF、PDGF两个联合使用与EGF、PDGF、FGF三个联合使用，对于牛脐带MSC的增殖促进作用并没有明显的差异；而在细胞形态上，(3)(4)组及(5)(6)组的细胞形态也无明显差别，均为梭形、成纤维状细胞，状态都较好。

由以上对比例可得出结论，EGF及PDGF联合使用，不仅可以促进牛脐带MSC的增殖，而且可抑制该细胞在体外培养的分化。而FGF在本专发明技术中的培养体系中，对于细胞的增殖及抑制分化方面，并没有明显的效果。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)获取胎牛脐带，获得牛脐带组织块，剪碎，将完全培养基加到组织块中，吹打均匀后转移到细胞培养皿中；

(2)摇晃培养皿使组织块均匀分布于培养皿中，转移至细胞培养箱中培养，并定期添加完全培养基；

(3)当细胞爬出后，弃掉旧培养基及组织块，用PBS清洗培养皿后，加入完全培养基继续置于细胞培养箱中培养；

(4)当细胞融合度达到80％～90％后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，加入含EDTA的胰酶混合液进行消化1～3min，待80％～90％细胞变圆即加入完全培养基终止消化，并将细胞吹打成单细胞悬液，获得牛脐带间充质干细胞；

所述完全培养基为添加了EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5～10ng/mL，PDGF的浓度为5～10ng/mL。

2.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，步骤(1)所述完全培养基的加入量是每1cm脐带添加1ml完全培养基。

3.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，所述定期添加完全培养基是每隔3-5天添加一次，每次完全培养基的添加量为3ml。

4.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，所述获取胎牛脐带的步骤包括：

(1)取4月龄带子宫的胎牛，低温运输箱中保存，3小时内送至实验室；

(2)在超净台中从子宫中取出胎牛，用剪刀剪断脐带，放入装有预冷的75％乙醇的玻璃平皿中浸泡10s；

(3)将脐带转移到另一个装有预冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血钳夹住脐带一端，用平镊挤掉血管中的血液，并清洗脐带表面血渍；重复清洗一次获得胎牛脐带。

5.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，所述获得牛脐带组织是将胎牛脐带剪成1cm的小段，用组织镊剥掉脐带外面的膜，再去除动脉和静脉，把获得的组织剪至1mm³大小。

6.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，所述细胞培养箱的培养条件是5％CO₂、37℃、饱和湿度为95％。

7.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，所述无血清培养基为Lonza公司的通用Ultra CULTURE无血清培养基。

8.根据权利要求1所述的分离及培养方法，其特征在于，步骤(4)所述胰酶混合液中EDTA的浓度为0.01g/L，胰酶的浓度为0.25g/L，浓度均为质量体积比。