CN105112362B - 一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。所述胎盘间充质干细胞的无血清培养基包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：维生素H、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞生长因子、人干细胞因子和厚朴酚。本发明提供的无血清培养具有安全性高，可以显著提高胎盘间充质干细胞的增殖能力的优点，而且在培养过程中的可以较好的保持胎盘间充质干细胞的细胞形态和其干细胞特性，有利于该无血清培养基的推广和应用。

Description

一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞，广泛分布于动物体内的骨髓、肝脏和脂肪等多种组织中。MSCs是一种具有强大的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，同时MSCs还是一种重要的免疫调节细胞。MSCs在炎症细胞因子刺激后对免疫系统表现出很强的抑制作用，可以减少体内的免疫排斥，延长移植物的存活时间。因此，间充质干细胞在组织工程中的化骨、软骨，心肌构建的种子细胞和在造血干细胞、器官移植中具有广泛的应用前景。

间充质干细胞来源丰富，可以来自脂肪、皮肤、周围血液、牙髓、脐带和骨髓。但是，从脂肪、皮肤、周围血液、牙齿和骨髓中分离间充质干细胞均需要侵入性操作，并需经历一个痛苦的手术过程，使间充质干细胞在科学研究和临床应用中受到了大大的限制。近年来，有研究表明胎盘中含有丰富的间充质干细胞，而且胎盘间充质干细胞具有取材方便和数量多的优点，更有利于间充质干细胞在科学研究和临床中的应用。

传统的间充质干细胞的培养方法是使用含有动物血清的培养基培养。但是，添加有动物血清的培养基容易造成成纤维细胞的污染，影响角质细胞的生长，加速角质细胞的分化；同时由于动物血清的成分不确定，对添加有动物血清的培养基构建的人工组织进行体内移植，存在引起强烈的免疫反应和引入不安全因素的风险，而且添加有动物血清的培养基培养的间充质干细胞对细胞生物学、毒理学和病理学的基础研究也会造成一定的干扰。因此，研究和开发出一种无血清培养基是当前亟需解决的难题。

中国专利申请201410018678.2公开了一种培养胎盘间充质干细胞的无血清培养基，所述无血清培养基以DMEM培养液为基础，还含有成纤维细胞生长因子受体2、生长激素、胰岛素、转铁蛋白、谷胱甘肽、BMP-4、L-谷氨酸胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸以及β-巯基乙醇。该无血清培养基可以实现胎盘间充质干细胞的贴壁生长，保持细胞的增殖能力。但是，该培养基中的β-巯基乙醇是一种具有强烈刺激性气味、毒性较高的有机化合物，不利于该无血清培养基的推广和应用。

发明内容

为解决现有技术中的胎盘间充质干细胞的无血清培养基存在的安全性差、细胞增殖速率不够理想的缺陷，本发明的目的在于提供一种安全性高、细胞增殖速率高、能较好的保持干细胞特性的胎盘间充质干细胞的无血清培养基，以解决上述问题。

本发明提供的一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H 0.5-5ug/ml、谷胱甘肽1-15ug/ml、重组人胰岛素1-10mg/ml、人血清白蛋白0.5-3mg/ml、转铁蛋白 0.2-10ug/ml、成纤维细胞生长因子 0.5-10ng/ml、表皮生长因子0.5-10 ng/ml、干细胞生长因子0.5-10 ng/ml、人干细胞因子0.5-10 ng/ml和厚朴酚6-30uM。

优选地，本发明提供的胎盘间充质干细胞的无血清培养基包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H 2-5ug/ml、谷胱甘肽6-12ug/ml、重组人胰岛素4-8mg/ml、人血清白蛋白0.5-2mg/ml、转铁蛋白 5-10ug/ml、成纤维细胞生长因子 5-10ng/ml、表皮生长因子3-8 ng/ml、干细胞生长因子3-8 ng/ml、人干细胞因子3-8 ng/ml和厚朴酚15-25uM。

进一步地，本发明提供的胎盘间充质干细胞的无血清培养基的最佳配方为：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H 5ug/ml、谷胱甘肽10ug/ml、重组人胰岛素6.5mg/ml、人血清白蛋白1mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、成纤维细胞生长因子 10ng/ml、表皮生长因子5 ng/ml、干细胞生长因子5ng/ml、人干细胞因子5 ng/ml和厚朴酚25uM。

进一步地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

进一步地，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

本发明提供的一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基的组分中，维生素H是细胞内多种酶的辅酶，在蛋白质合成和物质代谢中起着重要的作用，有利于胎盘间充质干细胞的生长；谷胱甘肽具有抗氧化作用，有利于维持细胞的生物功能；重组人胰岛素可以提高合成代谢能力，刺激细胞的生长；人血清白蛋白可以提供细胞生长所需的营养物质，还可以调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁。

成纤维细胞生长因子是重要的促细胞有丝分裂因子和血管生长因子，能够促进细胞的增殖和生长；表皮生长因子是一种多功能的生长因子，促进细胞的生长；干细胞生长因子可以促进细胞的快速增殖，提高细胞的增殖能力。

厚朴酚为棕褐色至白色精细粉末的厚朴提取物，分子式为C₁₈H₁₈O₂，CAS号为528-43-8。厚朴酚可以促进胎盘间充质干细胞的快速增殖，提高胎盘间充质干细胞的增殖能力，并能够维持细胞的干细胞特性和细胞良好的生长状态。

另外，本发明还提供了一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入维生素H、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞生长因子、人干细胞因子和厚朴酚，混匀，过膜除菌即得。

此外，本发明还提供了一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基在胎盘间充质干细胞培养中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的无血清培养基具有安全性高、可以显著提高胎盘间充质干细胞的增殖能力的优点，而且在培养过程中的可以较好的保持胎盘间充干细胞的细胞形态和其干细胞特性。本发明提供的制备方法简单，制得的胎盘间充质干细胞的无血清培养基用于胎盘间充质干细胞的培养，培养获得的细胞表现出优异的细胞性能。

附图说明

图1为含不同浓度厚朴酚的培养基对细胞增殖的影响；

图2为胎盘间充质干细胞在不同培养基中的增殖柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品，例如：厚朴酚购于上海士锋生物科技有限公司，产品货号为B10449，干细胞因子购于以色列ProSpec-Tany公司，产品货号为CYT-255，人干细胞生长因子购于美国peprotech公司，产品货号为100-22A，成纤维细胞生长因子和表皮生长因子购于上海恒斐生物科技有限公司，成纤维细胞生长因子的货号为13256029，表皮生长因子的货号为4414129。本发明中，培养基1：本发明实施三提供的胎盘间充质干细胞的无血清培养基；培养基2：高糖型DMEM基础培养基+10%体积百分比的胎牛血清。

实施例一、含不同浓度厚朴酚的培养基对细胞增殖的影响

发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的胎盘间充质干细胞的无血清培养基配方，并进一步对厚朴酚的浓度影响进行了考察。

将厚朴酚粉末用二甲基亚砜溶解成100mM的厚朴酚母液，分别用高糖型DMEM基础培养基将厚朴酚母液稀释成35μM、30μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM、1.56μM、0.78μM、0.39μM的药物溶液。

将P1代胎盘间充质干细胞以10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度厚朴酚的胎盘间充质干细胞的无血清培养基培养，每孔100μL，以不加厚朴酚的胎盘间充质干细胞的无血清培养基为正常细胞组。置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养，分别于24h、48h和72h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加有厚朴酚的处理组的吸光值与不加厚朴酚的正常细胞组的吸光值相对比，求算每孔的细胞存活率，结果如图1所示。从图1可知，当厚朴酚浓度达到6.25μM时，存活率呈现升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当厚朴酚浓度达到25μM时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。

实施例二、胎盘间充质干细胞的无血清培养基

胎盘间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H 1ug/ml、谷胱甘肽5ug/ml、重组人胰岛素3mg/ml、人血清白蛋白0.5mg/ml、转铁蛋白 2ug/ml、成纤维细胞生长因子 0.5ng/ml、表皮生长因子0.5 ng/ml、干细胞生长因子0.5 ng/ml、人干细胞因子0.5 ng/ml和厚朴酚6uM。

制备方法：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入维生素H 、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞生长因子、人干细胞因子和厚朴酚，混匀，过膜除菌即得。

实施例三、胎盘间充质干细胞的无血清培养基

胎盘间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H 5ug/ml、谷胱甘肽10ug/ml、重组人胰岛素6.5mg/ml、人血清白蛋白1mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、成纤维细胞生长因子 10ng/ml、表皮生长因子5 ng/ml、干细胞生长因子5ng/ml、人干细胞因子5 ng/ml和厚朴酚25uM。

制备方法与实施例二类似。

实施例四、胎盘间充质干细胞的无血清培养基

胎盘间充质干细胞的无血清培养基，包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：维生素H5ug/ml、谷胱甘肽15ug/ml、重组人胰岛素10mg/ml、人血清白蛋白3mg/ml、转铁蛋白 8ug/ml、成纤维细胞生长因子 10ng/ml、表皮生长因子10 ng/ml、干细胞生长因子10 ng/ml、人干细胞因子10 ng/ml和厚朴酚30uM。

制备方法与实施例二类似。

实施例五、胎盘间充质干细胞在不同培养基中的增殖

将P1代胎盘间充质干细胞分别用培养基1和培养基2进行培养，将细胞制成浓度为2×10⁸ /L的细胞悬液，以100 μL/孔接种于无菌的96孔培养板中，使用BrdU掺入到DNA合成期，检测P5、P10和P15代细胞的增殖能力。结果如图2显示，本发明优选的无血清培养基能够明显缩短P10和P15代细胞的倍增时间及提高了P10和P15代细胞的增殖能力。

实施例六、胎盘间充质干细胞的细胞表面标志物的表达情况

将P1代胎盘间充质干细胞在培养基1进行培养，取第5代的胎盘间充质干细胞，加入胰酶消化后制成单细胞悬液。分别加入抗人CD44、CD105、CD90、CD14、CD34和CD45的单克隆抗体，在4 ℃孵育30 min，用PBS洗2次后用流式细胞仪检测。结果如表1显示，采用本发明提供的胎盘间充质干细胞的无血清培养基培养的胎盘间充质干细胞经过5 次传代培养，都能很好的维持细胞的生物学特性不变。表1 胎盘间充质干细胞的细胞表面标志物的表达情况

分子表型	表达水平（%）
		CD44	98.21±0.20
CD90	99.10±0.16
		CD105	96.90±0.56
CD14	0.05±0.02
		CD34	0.03±0.00
CD45	0.09±0.02

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基由高糖型DMEM基础培养基、维生素H 5ug/ml、谷胱甘肽10ug/ml、重组人胰岛素6.5mg/ml、人血清白蛋白1mg/ml、转铁蛋白6ug/ml、成纤维细胞生长因子 10ng/ml、表皮生长因子5 ng/ml、干细胞生长因子5ng/ml、人干细胞因子5 ng/ml和厚朴酚25uM组成。

2.如权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述谷胱甘肽为还原型谷胱甘肽。

3.如权利要求1所述的胎盘间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：向高糖型DMEM基础培养基中，按所述浓度加入维生素H、谷胱甘肽、重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞生长因子、人干细胞因子和厚朴酚，混匀，过膜除菌即得。

4.如权利要求1-2中任一项所述的胎盘间充质干细胞的无血清培养基在胎盘间充质干细胞培养中的用途。