CN113980897A - 一种牙髓干细胞培养基及培养方法 - Google Patents
一种牙髓干细胞培养基及培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113980897A CN113980897A CN202111364561.6A CN202111364561A CN113980897A CN 113980897 A CN113980897 A CN 113980897A CN 202111364561 A CN202111364561 A CN 202111364561A CN 113980897 A CN113980897 A CN 113980897A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dental pulp
- pulp stem
- culture medium
- stem cells
- stem cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 87
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 6
- VVOAZFWZEDHOOU-UHFFFAOYSA-N magnolol Chemical compound OC1=CC=C(CC=C)C=C1C1=CC(CC=C)=CC=C1O VVOAZFWZEDHOOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000011022 opal Substances 0.000 claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- VABYUUZNAVQNPG-UHFFFAOYSA-N Piperlongumine Natural products COC1=C(OC)C(OC)=CC(C=CC(=O)N2C(C=CCC2)=O)=C1 VABYUUZNAVQNPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- WHAAPCGHVWVUEX-UHFFFAOYSA-N Piperlonguminine Natural products CC(C)CNC(=O)C=CC=CC1=CC=C2OCOC2=C1 WHAAPCGHVWVUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- VABYUUZNAVQNPG-BQYQJAHWSA-N Piplartine Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)N2C(C=CCC2)=O)=C1 VABYUUZNAVQNPG-BQYQJAHWSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241001503991 Consolida Species 0.000 claims abstract description 13
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-PHDIDXHHSA-N L-Glutathione Natural products OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-PHDIDXHHSA-N 0.000 claims abstract description 10
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229960002901 sodium glycerophosphate Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims abstract description 10
- WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H trizinc;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 10
- 235000006076 zinc citrate Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 239000011746 zinc citrate Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940068475 zinc citrate Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 10
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 241001533451 Ajuga ciliata Species 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 2
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 26
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 ajugase Substances 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004262 dental pulp cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001968 dental pulp cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004268 dentin Anatomy 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003054 facial bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0664—Dental pulp stem cells, Dental follicle stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：筋骨草糖、蛋白石微粉、亚硒酸钠、L‑谷胱甘肽、荜茇酰胺、厚朴酚、bFGF、柠檬酸锌、β‑甘油磷酸钠。本发明提供的培养基添加筋骨草糖和蛋白石微粉，筋骨草糖一方面有助于蛋白石微粉的均匀分布；另一方面和蛋白石微粉一起来提高牙髓干细胞的贴壁性，缩短细胞的贴壁时间，提高牙髓干细胞的增殖效率。添加荜茇酰胺、厚朴酚降低牙髓干细胞在培养过程中被杂菌污染的概率，避免杂菌造成的细胞凋亡和细胞生长缓慢，而且可以延长培养基的使用时间。本发明还提供一种牙髓干细胞的培养方法，采用本发明的培养基，成分安全明确，有效提高牙髓干细胞的增殖效率。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种牙髓干细胞培养基及培养方法。
背景技术
干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。干细胞的来源有很多，包括牙齿、骨髓、脐带、脐带血、脂肪等。
牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。2000年Gronthos 等通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞中形态呈梭形，可自我更新和多向分化，有着较强的克隆能力。这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞就称为牙髓干细胞 (DentalPulp Stem Cells, DPSCs)。
牙髓干细胞属于多功能的成体干细胞，是从牙髓组织中分离出的间充质干细胞。牙髓干细胞已经被证实具有多向分化能力，能够分化为骨、脂肪和血管内皮等组织细胞。现有研究表明，牙髓干细胞能够用于牙本质、牙髓、牙体、牙冠的组织修复与再生，还可以用于颅骨、颌骨及面骨的损伤修复。牙髓干细胞在其他疾病方面的研究应用也有很多，牙髓干细胞可以用于神经再生、糖尿病、自身免疫性疾病等疾病的治疗上。
目前，牙髓干细胞制备方法常用的有酶联合消化法、组织块培养法和组织块酶消化法等方法，各种方法虽均能获得牙髓干细胞，但是牙髓干细胞在制备过程中不仅极易污染，导致细胞数量较少，生长缓慢。并且，还常因为牙髓干细胞不易贴壁造成细胞增殖率较低，不能及时获得理想质量和数量的牙髓干细胞。因此，有必要对牙髓干细胞的培养基及培养过程进行改进，提高牙髓干细胞的增殖效率。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种牙髓干细胞培养基，不添加血清、抗生素以及动物蛋白等成分，实现了牙髓干细胞在体外的大量增殖，提高了牙髓干细胞的增殖效率。
本发明的目的之二在于提供一种牙髓干细胞的培养方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种牙髓干细胞培养基，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：筋骨草糖、蛋白石微粉、亚硒酸钠、L-谷胱甘肽、荜茇酰胺、厚朴酚、bFGF、柠檬酸锌、β-甘油磷酸钠。
优选地，基础培养基中各成分的添加浓度为：筋骨草糖7.3-8.6ng/mL、蛋白石微粉4.5-6.1 ng/mL、亚硒酸钠15-20ng/mL、L-谷胱甘肽1.5-3.5μg/mL、荜茇酰胺2.2-3.2ng/mL、厚朴酚1.8-2.7ng/mL、bFGF 20-25ng/mL、柠檬酸锌5.4-6.9μg/mL、β-甘油磷酸钠5-10ng/mL。
优选地，基础培养基中各成分的添加浓度为：筋骨草糖7.9ng/mL、蛋白石微粉4.7ng/mL、亚硒酸钠18ng/mL、L-谷胱甘肽2.5μg/mL、荜茇酰胺2.6ng/mL、厚朴酚2.3ng/mL、bFGF 22ng/mL、柠檬酸锌6.4μg/mL、β-甘油磷酸钠8 ng/mL。
优选地，所述蛋白石微粉的平均粒径为5-20μm。
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种牙髓干细胞的培养方法，采用上述培养基在37℃，5%CO2的条件下培养牙髓干细胞。
优先地，所述牙髓干细胞的培养方法包括以下步骤：将自人牙髓组织中分离得到的牙髓干细胞接种于上述的培养基中进行原代培养，当细胞融合度达到75-85%后，用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养。
优先地，培养基中牙髓干细胞浓度为2-5×104个/mL。
优先地，传代培养的比例为1:3-4。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种牙髓干细胞培养基，添加筋骨草糖和蛋白石微粉，筋骨草糖一方面有助于蛋白石微粉的均匀分布；另一方面和蛋白石微粉一起来提高牙髓干细胞的贴壁性，缩短细胞的贴壁时间，提高细胞的增殖活性，经过短时间的培养即可收获大量牙髓干细胞，提高牙髓干细胞的增殖效率。本发明的培养基中还添加荜茇酰胺、厚朴酚，降低牙髓干细胞在培养过程中被杂菌污染的概率，避免杂菌造成的细胞凋亡和细胞生长缓慢，而且可以延长培养基的使用时间，降低培养成本。
本发明还提供一种牙髓干细胞的培养方法，采用本发明的培养基，成分安全明确，有效提高牙髓干细胞的增殖效率。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种牙髓干细胞培养基，由基础培养基DMEM/F12培养基和添加在基础培养基中的以下成分组成：筋骨草糖7.9ng/mL、平均粒径为5-20μm蛋白石微粉4.7ng/mL、亚硒酸钠18ng/mL、L-谷胱甘肽2.5μg/mL、荜茇酰胺2.6ng/mL、厚朴酚2.3ng/mL、bFGF 22ng/mL、柠檬酸锌6.4μg/mL、β-甘油磷酸钠8 ng/mL。
一种牙髓干细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）将自人牙髓组织中分离得到的牙髓干细胞接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，培养基中牙髓干细胞浓度为2×104个/mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，当细胞融合度达到75%后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后进行传代培养；
（2）取步骤（1）进行传代培养的细胞接种于T75培养瓶中，培养瓶加入培养基10mL，培养基中牙髓干细胞浓度为4×104个/mL，按照1:3的比例进行传代培养，传代培养在37℃、5%CO2的条件下进行。
实施例2
一种牙髓干细胞培养基，由基础培养基DMEM/F12培养基和添加在基础培养基中的以下成分组成：筋骨草糖7.3ng/mL、平均粒径为5-20μm蛋白石微粉4.5ng/mL、亚硒酸钠15ng/mL、L-谷胱甘肽1.5μg/mL、荜茇酰胺2.2ng/mL、厚朴酚1.8ng/mL、bFGF 20ng/mL、柠檬酸锌5.4μg/mL、β-甘油磷酸钠5ng/mL。
一种牙髓干细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）将自人牙髓组织中分离得到的牙髓干细胞接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，培养基中牙髓干细胞浓度为4×104个/mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，当细胞融合度达到80%后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后进行传代培养；
（2）取步骤（1）进行传代培养的细胞接种于T75培养瓶中，培养瓶加入培养基10mL，培养基中牙髓干细胞浓度为3×104个/mL，按照1: 4的比例进行传代培养，传代培养在37℃、5%CO2的条件下进行。
实施例3
一种牙髓干细胞培养基，由基础培养基DMEM/F12培养基和添加在基础培养基中的以下成分组成：筋骨草糖8.6ng/mL、平均粒径为5-20μm蛋白石微粉6.1 ng/mL、亚硒酸钠20ng/mL、L-谷胱甘肽3.5μg/mL、荜茇酰胺3.2ng/mL、厚朴酚2.7ng/mL、bFGF 25ng/mL、柠檬酸锌6.9μg/mL、β-甘油磷酸钠10ng/mL。
一种牙髓干细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）将自人牙髓组织中分离得到的牙髓干细胞接种于12孔培养板中，每孔加入培养基1mL，培养基中牙髓干细胞浓度为5×104个/mL，在37℃，5%CO2的培养箱中进行原代培养，当细胞融合度达到85%后，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后进行传代培养；
（2）取步骤（1）进行传代培养的细胞接种于T75培养瓶中，培养瓶加入培养基10mL，培养基中牙髓干细胞浓度为5×104个/mL，按照1:3的比例进行传代培养，传代培养在37℃、5%CO2的条件下进行。
对比例1
对比例1提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去筋骨草糖，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去蛋白石微粉，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去荜茇酰胺，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去荜茇酰胺，将厚朴酚的用量调整为4.9ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去厚朴酚，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种牙髓干细胞培养基，和实施例1的区别为省去厚朴酚，将荜茇酰胺的用量调整为4.9ng/mL，其余均和实施例1相同。
分别统计实施例1至3，对比例1至2中牙髓干细胞在12孔板中培养时的贴壁时间，结果如表1所示。
表1
| 样品 | 贴壁时间（h） |
| 实施例1 | 45 |
| 实施例2 | 47 |
| 实施例3 | 46 |
| 对比例1 | 61 |
| 对比例2 | 64 |
由表1可以看出，实施例1至3中的细胞贴壁时间较短。对比例1至2中分别省去了筋骨草糖和蛋白石微粉，细胞贴壁时间明显变长。说明筋骨草糖和蛋白石微粉的添加有助于牙髓干细胞贴壁，缩短贴壁时间。
在实施例1至3，对比例1至2中牙髓干细胞培养至第12d时用台盼蓝染色法进行计数，统计各组增殖倍数，增殖倍数=培养至第12d时牙髓干细胞总数量/初始牙髓干细胞接种数量。结果如表2所示。
表2
| 样品 | 增殖倍数 |
| 实施例1 | 37.26 |
| 实施例2 | 34.89 |
| 实施例3 | 35.61 |
| 对比例1 | 15.56 |
| 对比例2 | 11.67 |
由表2可以看出，实施例1至3中牙髓干细胞的增殖倍数较高，说明在相同的时间内实施例1至3中收获的细胞数量更多。对比例1至2中调整了培养基的成分后细胞的增殖能力均有不同程度的下降。这是因为筋骨草糖和蛋白石微粉可以提高牙髓干细胞的贴壁性，缩短细胞的贴壁时间，提高细胞的增殖活性，进而提高牙髓干细胞的增殖效率。
在实施例1至3，对比例3至6的牙髓干细胞培养24h后取少量培养基，在显微镜下观察细胞污染程度，若出现细菌则及时更换培养基，若未出现则继续培养，此后每小时取样一次进行检测，统计每组培养基出现被细菌污染的时间，该时间作为换液时间，结果如表3所示。
表3
| 样品 | 换液时间（h） |
| 实施例1 | 86 |
| 实施例2 | 80 |
| 实施例3 | 83 |
| 对比例3 | 41 |
| 对比例4 | 49 |
| 对比例5 | 54 |
| 对比例6 | 45 |
由表3可以看出实施例1至3的换液时间均在80h以上。对比例3至6中分别省去了荜茇酰胺或者厚朴酚，无论是否调整剩余成分的用量，换液时间均缩短，不及实施例1至3，说明荜茇酰胺、厚朴酚可以降低牙髓干细胞在培养过程中被杂菌污染的概率，延长培养基的使用时间，降低培养成本。
综上可知，本发明的培养基通过添加筋骨草糖、蛋白石微粉、荜茇酰胺、厚朴酚等成分和培养基中的其他成分共同作用，提高了牙髓干细胞的增殖活性。为牙髓干细胞的实验及临床应用提供保障。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种牙髓干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加在基础培养基中的以下成分：筋骨草糖、蛋白石微粉、亚硒酸钠、L-谷胱甘肽、荜茇酰胺、厚朴酚、bFGF、柠檬酸锌、β-甘油磷酸钠。
2.根据权利要求1所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，基础培养基中各成分的添加浓度为：筋骨草糖7.3-8.6ng/mL、蛋白石微粉4.5-6.1 ng/mL、亚硒酸钠15-20ng/mL、L-谷胱甘肽1.5-3.5μg/mL、荜茇酰胺2.2-3.2ng/mL、厚朴酚1.8-2.7ng/mL、bFGF 20-25ng/mL、柠檬酸锌5.4-6.9μg/mL、β-甘油磷酸钠5-10ng/mL。
3.根据权利要求2所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，基础培养基中各成分的添加浓度为：筋骨草糖7.9ng/mL、蛋白石微粉4.7ng/mL、亚硒酸钠18ng/mL、L-谷胱甘肽2.5μg/mL、荜茇酰胺2.6ng/mL、厚朴酚2.3ng/mL、bFGF 22ng/mL、柠檬酸锌6.4μg/mL、β-甘油磷酸钠8ng/mL。
4.根据权利要求1所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述蛋白石微粉的平均粒径为5-20μm。
5.根据权利要求1至4任一项所述牙髓干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
6.一种牙髓干细胞的培养方法，其特征在于，采用权利要求5所述培养基在37℃，5%CO2的条件下培养牙髓干细胞。
7.根据权利要求6所述牙髓干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将自人牙髓组织中分离得到的牙髓干细胞接种于权利要求5所述的培养基中进行原代培养，当细胞融合度达到75-85%后，用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养。
8.根据权利要求7所述牙髓干细胞的培养方法，其特征在于，培养基中牙髓干细胞浓度为2-5×104个/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111364561.6A CN113980897A (zh) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 一种牙髓干细胞培养基及培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111364561.6A CN113980897A (zh) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 一种牙髓干细胞培养基及培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113980897A true CN113980897A (zh) | 2022-01-28 |
Family
ID=79749150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111364561.6A Pending CN113980897A (zh) | 2021-11-17 | 2021-11-17 | 一种牙髓干细胞培养基及培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113980897A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114480268A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞的制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105112362A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-12-02 | 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 | 一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 |
| WO2016179243A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Reversion of primed pluripotent stem cells to naive pluripotent stem cells |
| CN106754677A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-05-31 | 严志海 | 一种体外骨髓间充质干细胞培养基 |
| CN109316491A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-02-12 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | Nk细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用 |
| WO2019208713A1 (ja) * | 2018-04-26 | 2019-10-31 | 国立大学法人東京工業大学 | 多能性幹細胞の分化促進方法 |
| CN110819586A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-02-21 | 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 | 一种用于牙髓干细胞向成骨细胞诱导分化的培养基及其制备方法以及应用 |
-
2021
- 2021-11-17 CN CN202111364561.6A patent/CN113980897A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016179243A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Reversion of primed pluripotent stem cells to naive pluripotent stem cells |
| CN105112362A (zh) * | 2015-08-18 | 2015-12-02 | 广州暨南生物医药研究开发基地有限公司 | 一种胎盘间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 |
| CN106754677A (zh) * | 2016-12-24 | 2017-05-31 | 严志海 | 一种体外骨髓间充质干细胞培养基 |
| WO2019208713A1 (ja) * | 2018-04-26 | 2019-10-31 | 国立大学法人東京工業大学 | 多能性幹細胞の分化促進方法 |
| CN109316491A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-02-12 | 北京世纪劲得生物技术有限公司 | Nk细胞联合间充质干细胞在治疗肝炎及肝纤维化中的应用 |
| CN110819586A (zh) * | 2019-11-26 | 2020-02-21 | 广州赛莱拉生物基因工程有限公司 | 一种用于牙髓干细胞向成骨细胞诱导分化的培养基及其制备方法以及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 刘明月;胡伟平;王晓芬;李宁;曹潇方;史欣;王晓峰;: "低浓度β-甘油磷酸钠培养牙髓干细胞向成牙本质细胞分化及相关因子的表达", 中国组织工程研究, no. 41 * |
| 刘飞;刘阳;戴姗姗;马宁虎;张林;郭青玉;: "犬乳牙牙髓干细胞体外培养及生物学性能研究", 实用口腔医学杂志, no. 03 * |
| 王萍;王亚平;周;杨明聪;: "人牙髓细胞的体外培养及生物学特性研究", 重庆医科大学学报, no. 02, pages 166 * |
| 陈宙;陈春雷;林晖;何琳;韩卓兴;: "荜茇酰胺对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖和凋亡的影响", 广东医学院学报, no. 05 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114480268A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞的制备方法 |
| CN114480268B (zh) * | 2022-01-21 | 2024-01-30 | 深圳市茵冠生物科技有限公司 | 人脐带间充质干细胞的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mitrano et al. | Culture and characterization of mesenchymal stem cells from human gingival tissue | |
| Ge et al. | Isolation and characterization of mesenchymal stem cell-like cells from healthy and inflamed gingival tissue: potential use for clinical therapy | |
| KR100908481B1 (ko) | 중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽줄기세포의 배양 방법 | |
| CN109762782B (zh) | 一种促间充质干细胞生长的培养基及其制备方法 | |
| CN105238751B (zh) | 一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN111826348B (zh) | 一种人诱导性多能干细胞来源的间充质干细胞体外高效制备方法和应用 | |
| KR20100065338A (ko) | 인간 또는 동물 배아에서 중간엽 줄기세포를 추출 및 그 분비물을 추출하는 방법 | |
| CN113151165B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法 | |
| Pilbauerova et al. | Enzymatic Isolation, Amplification and Characterization of Dental Pulp Stem Cells. | |
| CN112080463A (zh) | 一种促进骨髓间充质干细胞成骨分化的方法 | |
| KR20080056280A (ko) | 줄기 세포 분화 방법 및 치아 상태의 치료에서의 그 용도 | |
| CN102965338A (zh) | 人脐带间充质干细胞的提取和培养方法 | |
| CN113980897A (zh) | 一种牙髓干细胞培养基及培养方法 | |
| KR101896803B1 (ko) | 인간 만능줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 생산율을 증가시키는 방법 및 이에 의해 생성된 중간엽 줄기세포 | |
| CN111909898B (zh) | 一种人牙髓干细胞的分离和扩增方法及其应用 | |
| CN116218770B (zh) | 一种间充质干细胞的制备方法和应用 | |
| CN1920010A (zh) | 一种从脐带血中分离多能成体祖细胞的方法 | |
| Wang et al. | Clonal isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human amnion | |
| CN111454892A (zh) | 牙间充质干细胞培养基及在牙髓干细胞内的活性验证方法 | |
| CN109652367B (zh) | 一种制备临床级脂肪干细胞的方法 | |
| CN106957814B (zh) | 一种羊膜间充质干细胞培养基和培养羊膜间充质干细胞的方法 | |
| CN113018316A (zh) | 多能干细胞来源的间充质干细胞在修复皮肤损伤中的应用 | |
| CN117106705B (zh) | 一种胎盘/脐带间充质干细胞培养组合物及其应用 | |
| CN114480272A (zh) | 一种用于脐带间充质干细胞培养的添加剂、培养基及其制备方法 | |
| CN117603909B (zh) | 高免疫抑制的UCMSCs及其培养方法、试剂与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230906 Address after: 130300 Weiwu Road, Industrial Concentration Zone, Misha Town, Dehui City, Changchun City, Jilin Province Applicant after: Changchun Golden Bird Biomedical Development Co.,Ltd. Address before: 710000 east side of Chang'an South Road, changyanbao office, Yanta District, Xi'an City, Shaanxi Province Applicant before: Li Baojian |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220128 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |