CN116218770B - 一种间充质干细胞的制备方法和应用 - Google Patents
一种间充质干细胞的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种间充质干细胞制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明的制备方法通过向预处理后的脐带组织中加入无血清培养基，之后放入缺氧培养箱中进行传代培养，得到间充质干细胞；所述的无血清培养基包括基础培养基和添加剂；所述的添加剂包括参麦注射液和曲美他嗪。该制备方法制备得到的间充质干细胞可以长期保持增殖速度，多次传代后，仍能保持细胞未出现衰老现象，其干性保持好；通过缺氧预处理的间充质干细胞表现出更有利的特性，免受氧化应激、免受宿主免疫攻击，具有更好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，又叫间充质基质细胞，因其独特的优势分化潜能和自我更新能力，不仅被广泛应用于生物再生组织工程，而且被广泛应用于细胞和基因治疗。MSCs是一种中胚层细胞，可以从成人和出生组织中获得，是目前临床试验中应用最广泛的干细胞类型。然而，间充质干细胞存在种子细胞数量不足，体外培养的MSCs活性降低，容易衰老和表型缺失的问题，在应用上受到了一定的限制。比如产自围产期组织的间充质干细胞会随着体外大规模扩增而发生复制性老化；来自老年供体的间充质干细胞普遍表现为早衰表型；来自患者的间充质干细胞表现为间充质干细胞生物学功能下降。体外长期培养的间充质干细胞的增殖、迁移、分化和免疫调节功能普遍下调，治疗能力受损。因此，逆转这些间充质干细胞的功能，即维持间充质干细胞的年轻化，对于基于间充质干细胞的治疗至关重要。
在治疗过程中会采用移植体外常氧培养的MSCs的方法，但是由于机体靶组织的局部缺氧、炎症，尤其是氧化应激，移植的体外常氧培养的MSCs无法承受不利的体内微环境。因此，细胞存活率低，降低了治疗效果。保护MSCs免受氧化应激、免受宿主免疫攻击和其他促凋亡因子的影响，以提高其治疗效果是当务之急。研究表明通过细胞移植前的预处理的办法是可行的，通过体外预处理调节其特性，以适应细胞对氧气水平的分子感知，提供最接近其自然生态位的特定条件。中国专利CN108251359B公开了一种间充质干细胞无血清培养基及培养方法，无血清培养基包括基础培养基和添加成分，所述的添加成分包括低氧诱导因子1、力生长因子和层粘连蛋白LN521、维生素、CDLC、EGF组分，利用该无血清培养基，并将间充质干细胞在5％的低氧培养条件下进行。该发明的无血清培养基成分确定，质量可控，可用于组织贴壁分离间充质干细胞，可使间充质干细胞生长正常；无血清培养基配合低氧的培养条件，对间充质干细胞的生长具有协同促进作用，间充质干细胞生长情况大大改善，同时多次传代次后仍保持了间充质干细胞的“干性”及分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等类型细胞的能力。但是，对于间充质干细胞的缺氧预激活中氧浓度以及是否添加中药成分能够增强脐带间充质干细胞的自我更新和增殖能力鲜有研究。
发明内容
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数指示物。通过端点表述的数值范围包括在对应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。
需要说明的是：
无特殊说明，本文中的百分数为体积分数；
PRP为人血小板裂解物(platelet-rich plasma)。
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种间充质干细胞的制备方法和应用，通过优化缺氧预激活中的氧浓度、缺氧的最佳持续时间以及结合抗氧化剂--中药成分而制备一种高质量的脐带间充质干细胞。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种间充质干细胞的制备方法，通过向预处理后的脐带组织中加入无血清培养基，之后放入缺氧培养箱中进行传代培养，得到间充质干细胞；所述的无血清培养基包括基础培养基和添加剂；所述的添加剂包括参麦注射液和曲美他嗪。
本发明人创新性的发现在体外培养条件下，MSCs通常暴露在平均氧张力约为21％的环境中。然而，间充质干细胞通常生活在缺氧的微环境中，体内生理氧浓度在1-11％之间，生理性低氧(也称为缺氧)可能更符合间充质干细胞的生长需求，生理性低氧培养更加接近细胞在体内微环境的生长状态，有望改善细胞的生物学特性，促进增殖，延缓细胞衰老。与常氧培养比较，当缺氧时，MSCs表现出延长寿命和避免复制性衰老，并表达较少的衰老相关β-半乳糖苷酶。所以创新性的运用具有益气固脱、养阴生津和生脉的功效、同时具有增加心肌供血、抗心肌缺血、减少心肌耗氧量、去除氧自由基等药理学功效的参麦注射液，其主要成分包括红参和麦冬，有效成分主要是人参皂苷和麦冬皂苷，为中药注射剂；还添加能保护间充质干细胞免受过氧化氢诱导的伤害，通过保护细胞在缺氧或缺血情况下的能量代谢，阻止细胞内ATP水平的下降的曲美他嗪。上述多种活性成分共同作用，充分发挥对细胞的保护作用。
优选地，所述的基础培养基为MEM-α基础培养基。
优选地，所述添加剂包含成分A和成分B；所述的成分A包括参麦注射液和曲美他嗪；所述的成分B包括人血小板裂解物。
优选地，按照体积分数，所述参麦注射液为基础培养基的0.1％-5％；所述曲美他嗪为基础培养基的0.1％-5％；所述人血小板裂解物为基础培养基的5％-20％。
进一步优选地，按照体积分数，所述参麦注射液为基础培养基的1％；所述曲美他嗪为基础培养基的0.5％；所述人血小板裂解物为基础培养基的10％。
优选地，所述成分A先与基础培养基混合均匀，再添加成分B。
优选地，所述缺氧培养箱中氧气的体积分数为2％-4％。
优选地，所述缺氧培养箱中氧气的体积分数为3％。
优选地，所述的制备方法，包括以下步骤：
S1、脐带的预处理：清洗、酒精浸泡、分段、去除外膜和动静脉；
S2、将预处理后的脐带放入培养瓶；
S3、向培养瓶中加入无血清培养基，之后放入二氧化碳培养箱中培养至间充质干细胞生长到70％-80％融合；
S4、对S3的间充质干细胞进行原代传代培养。
本发明还提供了一种间充质干细胞，所述的间充质干细胞由上述的制备方法制备得到。
本发明还提供了一种上述的间充质干细胞在制备预防和/或治疗炎症、心血管系统疾病和神经系统疾病药物中的应用。
优选地，所述的炎症包括骨关节炎、支气管炎、肺炎、结肠炎；所述的心血管系统疾病包括心律失常、心肌缺血和心功能不全；所述的神经系统疾病包括帕金森氏综合征、老年痴呆症、外伤性脑损伤、脊髓损伤、运动神经元病。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)将参麦注射液和曲美他嗪加入无血清培养基，可以长期保持MSC增殖速度、数量多、表型稳定；多次传代后，仍能保持细胞未出现衰老现象。
(2)本发明不使用胎牛血清，而是使用人血小板裂解物(PRP)，PRP来源于人类，输注人体不会引起异种蛋白免疫反应，尤其是PRP含有的血小板源性生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子Ⅰ、胰岛素样生长因子Ⅱ、血管内皮生长因子等多种因子，与参麦注射液和曲美他嗪一起加入无血清培养基，可以迅速刺激间充质干细胞的增殖，扩增的间充质干细胞在其组织修复、细胞分化、血管新生等方面能力更强，解决了传统培养使用胎牛血清培养细胞的方法缺陷。
(3)本发明使用特殊的低氧浓度培养方法制备间充质干细胞，干性保持好。
附图说明
图1β-半乳糖苷酶衰老检测图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1间充质干细胞的制备
1.脐带的清洗与处理
(1)清洗：75％的酒精消毒脐带保存瓶后，放入安全柜内，取出脐带，用PBS清洗2遍；
(2)浸泡：加入75％的酒精浸泡脐带30秒；
(3)分段：将脐带置于无菌培养皿中，用无菌手术剪剪成3cm的小段；
(4)处理：去除动脉、静脉和外膜，剪碎，
(5)铺瓶：均匀平铺到T75培养瓶底部；
(6)培养：将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，倒置5小时；
2.制备无血清培养基
无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，按体积计算，成分A为参麦注射液1％，曲美他嗪0.5％；成分B为PRP。
先将成分A与MEM-α基础培养基(购自：Gibco；货号：12561072)混合均匀；在使用时再添加成分B，成分B占MEM-α基础培养基的体积分数为10％。
3.培养
(1)往培养瓶中缓慢加入配置好的培养基10ml；将培养瓶水平放入37℃，体积百分比为5％的CO2培养箱中培养；
(2)每4天换液1次，观察组织块边缘细胞生长情况，待组织块细胞爬出且生长至70-80％融合时，可对脐带间充质干细胞原代传代；
4.传代
传至P3代时，按5000-10000cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入30ml的配制好的培养基；将培养瓶水平放入37℃，在3％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
5.收集P5、P10、P15代细胞
(1)待细胞长至70％-90％融合时，弃去培养基，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面1次；
(2)弃去PBS，加入6mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；
(3)加入等量的培养基，终止消化；
(4)收集细胞悬液，1200rpm,6升6降，离心5min；
(5)弃去上清液，加10mLPBS重悬细胞，注意轻轻吹打，避免产生气泡，离心；
(6)最后一次离心后，弃去上清液，用10mLPBS重悬细胞。
实施例2
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基中，成分A参麦注射液为0.1％，曲美他嗪为5％，成分B占MEM-α基础培养基的体积分数为5％；
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在2％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
实施例3
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基中，成分A参麦注射液为5％，曲美他嗪为0.1％，成分B占MEM-α基础培养基的体积分数为20％；
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在4％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例1
与实施例1的区别仅在于：
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在1％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在10％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例3
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基：无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂包含成分A和成分B，按体积计算，成分A为参麦注射液1％，盐酸川芎嗪0.5％；成分B为PRP。
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在5％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例4
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基：无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂为PRP。PRP与MEM-α基础培养基的体积比为10％。
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在21％(常氧)的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例5
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基：无血清培养基由MEM-α基础培养基和添加剂构成，添加剂为PRP。PRP与MEM-α基础培养基的体积比为10％。
步骤4传代中，将培养瓶水平放入37℃，在3％的O2、5％的CO2培养箱中培养。
对比例6
与实施例1的区别仅在于：
步骤2制备无血清培养基中，参麦注射液为0.05％，曲美他嗪为8％，成分B占MEM-α基础培养基的体积分数为25％；
测试例1细胞表型流式鉴定
分别收集实施例和对比例中的P5、P10和P15细胞，调整细胞浓度为1×107个/ml，加入抗体CD73、CD90、CD105、CD34和CD45，室温避光孵育30min，与IgG1结合的细胞作为同型对照，孵育结束后PBS清洗2次，洗去未结合的抗体，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，结果如表1所示：
表1不同氧浓度的培养条件对MSCs表型的影响
| 组别 | CD73(％) | CD90(％) | CD105(％) | CD34(％) | CD45(％) |
| 实施例1 | 99.13 | 99.25 | 98.56 | 0.096 | 0.911 |
| 实施例2 | 98.22 | 98.86 | 98.37 | 0.239 | 0.989 |
| 实施例3 | 98.75 | 97.39 | 97.63 | 0.631 | 1.067 |
| 对比例1 | 96.21 | 96.35 | 97.12 | 0.667 | 0.893 |
| 对比例2 | 95.32 | 96.27 | 96.33 | 1.103 | 1.232 |
| 对比例3 | 95.69 | 95.77 | 95.63 | 0.899 | 1.356 |
| 对比例4 | 94.97 | 94.61 | 93.33 | 1.973 | 1.986 |
| 对比例5 | 95.15 | 94.88 | 96.06 | 1.398 | 1.532 |
| 对比例6 | 97.63 | 96.78 | 97.35 | 0.661 | 1.136 |
由上表可知，低氧处理对脐带间充质干细胞的免疫表型没有影响，低氧组与常氧组免疫表型表达情况相同，各组细胞表面抗原CD73、CD90和CD105呈阳性表达，CD34和CD45呈阴性表达，其中，实施例培养获得的细胞CD73、CD90和CD105阳性率均在95％以上，CD34和CD45阳性率低于2％，符合人脐带间充质干细胞的表型特征，优于对比例。说明低氧处理未改变细胞“干性”，符合间充质干细胞的鉴定标准。显示本发明提供的无血清培养基结合低氧适于培养人脐带间充质干细胞，同时，培养基的组成对其性能具有一定的影响。
测试例2β-半乳糖苷酶衰老检测
分别取实施例1-3和对比例1-6的P5、P10、P15代脐带间充质干细胞在各自不同氧气条件下培养至细胞融合度达80％，胰酶消化，以1×104/cm2密度接种于24孔板，在各自不同氧体积分数下培养5d，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞衰老情况，吸去24孔板中的细胞培养液，PBS洗涤1次，加入250μLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min，吸除细胞固定液，PBS洗涤3次，每孔加入250μL染色工作液，37℃孵育过夜，后清除工作液，再用PBS清洗三遍，将24孔板置于普通光学显微镜下，随机选取6个视野，观察记录实验结果。使用软件Image J对染色部分进行定量统计，得到的结果如图1所示。
结果表明：低氧处理可以延缓间充质干细胞的衰老。通过β-半乳糖苷酶染色法，衰老细胞呈蓝色。实施例脐带间充质干细胞在2-4％低氧+MEM-α+0.1-5％参麦注射液+0.1-5％曲美他嗪条件下衰老细胞数量明显少于对比例组。定量分析发现低氧组和对比例组染色比率存在显著性差异。
测试例3抗氧化能力鉴定
分别取P5、P10、P15代细胞，做T-AOC检测。测定T-AOC的活性水平可直接反映机体抗氧化酶的活力和抗氧化系统的功能状态，T-AOC可反应机体内总体氧化应激水平；并可间接反映机体的脂质过氧化损伤程度，其水平与细胞抗氧化能力呈正相关，与机体脂质过氧化呈负相关。
使用Fe3+/Fe2+化学法测定T-AOC水平(具体操作严格按照T-AOC检测试剂盒(购自：南京建成生物科技有限公司，货号：A015-1-2)操作程序进行)。
表2检测试剂表
按照表2的试剂混匀，放置10分钟，双蒸水调零1cm光径，520nm测各种管吸光度
规定；在37℃时每分钟每毫升上清使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位；计算公式如下：
总抗氧化能力＝(测定OD值－对照OD值)/0.01/30×(反应液总量/取样量)×样本测试前(单位/毫升上清)稀释倍数。
实施例和对比例抗氧化能力的结果如表3所示。
表3抗氧化能力结果
| P5 | P10 | P15 | |
| 实施例1 | 10.33 | 9.06 | 7.89 |
| 实施例2 | 10.15 | 8.83 | 7.25 |
| 实施例3 | 9.98 | 8.62 | 7.13 |
| 对比例1 | 7.85 | 6.99 | 4.87 |
| 对比例2 | 5.06 | 4.03 | 3.09 |
| 对比例3 | 3.62 | 3.11 | 2.33 |
| 对比例4 | 3.06 | 2.35 | 1.56 |
| 对比例5 | 3.67 | 3.06 | 2.03 |
| 对比例6 | 8.37 | 7.66 | 5.59 |
由上表可知，实施例制备的MSC其总抗氧化能力显著高于对照组，说明低氧处理协同专有的培养基配方增强了细胞抗氧化能力。本发明提供的无血清培养基结合低氧培养的人脐带间充质干细胞具有明显的特性。本发明制备的MSC总抗氧化能力明显升高。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于：通过向预处理后的脐带组织中加入无血清培养基，之后放入缺氧培养箱中进行传代培养，得到间充质干细胞；所述的无血清培养基包括基础培养基和添加剂；所述的基础培养基为MEM-α基础培养基；
所述添加剂为成分A和成分B；所述的成分A为参麦注射液和曲美他嗪；所述的成分B为人血小板裂解物；按照体积分数，所述参麦注射液为基础培养基的0.1%-5%；所述曲美他嗪为基础培养基的0.1%-5%；所述人血小板裂解物为基础培养基的5%-20%；
所述缺氧培养箱中氧气的体积分数为2%-4%。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述成分A先与基础培养基混合均匀，再添加成分B。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述缺氧培养箱中氧气的体积分数为3%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、脐带的预处理：清洗、酒精浸泡、分段、去除外膜和动静脉；
S2、将预处理后的脐带放入培养瓶；
S3、向培养瓶中加入无血清培养基，之后放入二氧化碳培养箱中培养至间充质干细胞生长到70%-80％融合；
S4、对S3的间充质干细胞进行原代传代培养。
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