CN113249315A - 一种脐血含有间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，属于干细胞培养技术领域，解决现有技术中，脐血间充质干细胞分离成功率低，培养过程中细胞增殖率低的问题。具体包括以下步骤：步骤S1、脐血的采集与运输；步骤S2、间充质干细胞的提取；步骤S3、原代培养；步骤S4、传代培养；步骤S5、冷冻保存；本发明首先获取有效脐血，通过添加大分子羟乙基淀粉，利用密度梯度离心相结合的方法，加速红细胞的沉降，提高单个间充质干细胞分离的成功率，原代培养使用的特制培养基含有黄芪多糖，在促进细胞增殖的同时，还可维持脐血间充质干细胞的表型和特性，本发明提供的培养方法操作简单，无外源性污染，安全可靠，并且细胞增殖率高。

Description

一种脐血含有间充质干细胞的培养方法
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体的，涉及一种脐血含有间充质干细胞的培养方法。
背景技术
脐血间充质干细胞是一类从脐带血中分离和培养的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化的潜能。脐血间充质干细胞的这些特性，吸引了众多国内外学者的目光，目前，脐血间充质干细胞移植的临床治疗取得了一定进展。
脐带血是指胎儿娩出，脐带结扎，残留在脐带和胎盘靠近胎儿段内的血液。脐带血中含有两种干细胞：造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)。脐带血造血干细胞异体移植后发生免疫排斥反应的可能性极低，它已应用于临床治疗，主要用于治疗造血系统疾病(白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤)、糖尿病、肝脏疾病等。将冷藏0.1～5年的脐血单个核细胞培养3～5周，获得贴壁的细胞呈现成纤维细胞样形态，并具有间充质细胞的免疫表型，表明可以长期冻存保存脐血间充质干细胞。研究认为脐血间充质干细胞分离成功的关键在于：①从脐血中采集分离时间不超过15h；②脐血的量不少于33ml；③单个核细胞量不少于1×108个。但脐血间充质干细胞分离成功率低，因此提供一种方便简单、成功率高的体外脐血间充质干细胞的培养方法是目前需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐血含有间充质干细胞的培养方法。
本发明需要解决的技术问题为：
现有技术中，脐血间充质干细胞分离成功率低，培养过程中细胞增殖率低，不能有效在临床治疗中发挥作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、脐血的采集与运输；
步骤S2、间充质干细胞的提取：将脐带血与质量分数6％的羟乙基淀粉水溶液按照体积比4:1加入烧杯中，室温条件下，转速25-30r/min搅拌5min后，静置30-45min，然后取上清液，于转速1000r/min条件下离心处理10min，弃去上清，培养基重悬细胞后加至含有等体积的Ficoll分离液上，于转速1800r/min条件下离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min后，洗涤2次，得到间充质干细胞；
步骤S3、原代培养：将步骤S2所得的间充质干细胞接种于特制培养基中，接种密度为1.0×106个/L，然后置于37℃、体积分数为0.03％的CO2饱和湿度的培养箱内培养，培养72h后倾倒去全部的上清液体，以后每3天全量换液1次，培养6天，同时记录观察贴壁细胞的形态变化；
步骤S4、传代培养：使用无血清培养液混悬单个细胞接枝到蛋白包被培养瓶中，在低氧条件下培养，待细胞融合率达到80％后进行传代，培养72h后，计算细胞首次传代培养收获的细胞数量；
步骤S5、冷冻保存：将经过3次传代培养后的间充质干细胞于冻存保护液中长期保存。
进一步地，步骤S1中所述脐血采集时间与制备时间的间隔小于8h，脐血体积大于80mL，血清体积分数为10-20％。
进一步地，步骤S2中所述Ficoll分离液密度为1.077g/L。
进一步地，步骤S3中所述特制培养基包括以下原料：黄芪多糖、PRP、骨髓间充质干细胞和无血清培养基，其中黄芪多糖与无血清培养基用量比为0.1-1mg：1mL，PRP与无血清培养基的体积比为1:5-10，骨髓间充质干细胞的用量为无血清培养基质量的0.3-0.5％。
PRP(Platelet Rich Plasma)是富含血小板、血浆或富含生长因子的血液。PRP技术是指利用自身的血液，提取出富含高浓度血小板和各种自身生长因子的血浆。
黄芪多糖是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根经提取、浓缩、纯化而成的水溶性杂多糖，淡黄色，粉末细腻，均匀无杂质，具引湿性。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，可作为免疫促进剂或调节剂，同时具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗应激、抗氧化等作用。
进一步地，步骤S4中所述低氧条件下为氧气10％、二氧化碳6％、氮气84％。
进一步地，步骤S4中蛋白包被培养瓶的制备具体步骤如下：
步骤A1、制备醋酸缓冲溶液，向醋酸缓冲溶液中加入醋酸钠固体，搅拌均匀，控制体系的pH值为5.3，并使用0.2μm的无菌过滤器过滤除菌备用；
步骤A2、培养瓶的包被，向细胞培养瓶中添加2.5mL浓度为5μg/mL的纤连蛋白和2.5mL浓度为0.1g/mL的抗CD90单克隆抗体的醋酸缓冲水溶液，4℃孵育12h后，无菌吸取缓冲液，然后使用生理盐水和无血清培养液分别冲洗一次，即得到蛋白包被培养瓶。
进一步地，步骤S5中所述冻存保护液含有5-10％的DMSO和1-10％的人血清蛋白，余量为DMEM/F12培养基。
本发明的有益效果：
本发明首先获取有效脐血，然后将脐血和质量分数6％的羟乙基淀粉水混合离心，通过添加大分子羟乙基淀粉，利用密度梯度离心相结合的方法，加速红细胞的沉降，提高单个间充质干细胞分离的成功率，在高速离心条件下通过分层液Ficoll将单个细胞从脐血中分离出来，然后在体外先进行原代培养，原代培养使用的特制培养基含有黄芪多糖，在促进细胞增殖的同时，还可维持脐血间充质干细胞的表型和特性，并且本发明培养中含有少量的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞和脐血骨髓干细胞共同孵育，对脐血干细胞体外扩增有支持作用，该特制培养基可减少动物血清应用的风险和免疫原性，安全性好，进而在蛋白包被培养瓶中进行传代培养，包被培养瓶中含有非特异性促贴壁蛋白和特异性促贴壁蛋白，能够促进脐血间充质干细胞的贴壁生长，最后将传代培养3次后的脐血间充质干细胞进行冻存备用，本发明提供的培养方法操作简单，无外源性污染，安全可靠，并且细胞增殖率高。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、脐血的采集与运输；脐血来自2020年10月的正常足月分娩的胎儿脐带血，取标本前经医院伦理委员会批准、并征得产妇及家属同意，脐带血量在90ml；血清体积分数为10％；
步骤S2、间充质干细胞的提取：将脐带血与质量分数6％的羟乙基淀粉水溶液按照体积比4:1加入烧杯中，室温条件下，转速25r/min搅拌5min后，静置30min，然后取上清液，于转速1000r/min条件下离心处理10min，弃去上清，培养基重悬细胞后加至含有等体积的Ficoll分离液上，于转速1800r/min条件下离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min后，洗涤2次，得到间充质干细胞；
步骤S3、原代培养：将步骤S2所得的间充质干细胞接种于特制培养基中，接种密度为1.0×106个/L，然后置于37℃、体积分数为0.03％的CO2饱和湿度的培养箱内培养，培养72h后倾倒去全部的上清液体，以后每3天全量换液1次，培养6天，同时记录观察贴壁细胞的形态变化；
步骤S4、传代培养：使用无血清培养液混悬单个细胞接枝到蛋白包被培养瓶中，在氧气10％、二氧化碳6％、氮气84％的条件下培养，待细胞融合率达到80％后进行传代，培养72h后，计算细胞首次传代培养收获的细胞数量；
步骤S5、冷冻保存：将经过3次传代培养后的间充质干细胞于冻存保护液中长期保存。
其中，步骤S3中所述特制培养基包括以下原料：黄芪多糖、PRP、骨髓间充质干细胞和无血清培养基，其中黄芪多糖与无血清培养基用量比为0.1mg：1mL，PRP与无血清培养基的体积比为1:5，骨髓间充质干细胞的用量为无血清培养基质量的0.3％。
其中，步骤S4中蛋白包被培养瓶的制备具体步骤如下：
步骤A1、制备醋酸缓冲溶液，向醋酸缓冲溶液中加入醋酸钠固体，搅拌均匀，控制体系的pH值为5.3，并使用0.2μm的无菌过滤器过滤除菌备用；
步骤A2、培养瓶的包被，向细胞培养瓶中添加2.5mL浓度为5μg/mL的纤连蛋白和2.5mL浓度为0.1g/mL的抗CD90单克隆抗体的醋酸缓冲水溶液，4℃孵育12h后，无菌吸取缓冲液，然后使用生理盐水和无血清培养液分别冲洗一次，即得到蛋白包被培养瓶。
其中，步骤S5中所述冻存保护液含有5％的DMSO和1％的人血清蛋白，余量为DMEM/F12培养基。
实施例2
一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、脐血的采集与运输；脐血来自2020年10月的正常足月分娩的胎儿脐带血，取标本前经医院伦理委员会批准、并征得产妇及家属同意，脐带血量在90ml；血清体积分数为15％；
步骤S2、间充质干细胞的提取：将脐带血与质量分数6％的羟乙基淀粉水溶液按照体积比4:1加入烧杯中，室温条件下，转速28r/min搅拌5min后，静置38min，然后取上清液，于转速1000r/min条件下离心处理10min，弃去上清，培养基重悬细胞后加至含有等体积的Ficoll分离液上，于转速1800r/min条件下离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min后，洗涤2次，得到间充质干细胞；
步骤S3、原代培养：将步骤S2所得的间充质干细胞接种于特制培养基中，接种密度为1.0×106个/L，然后置于37℃、体积分数为0.03％的CO2饱和湿度的培养箱内培养，培养72h后倾倒去全部的上清液体，以后每3天全量换液1次，培养6天，同时记录观察贴壁细胞的形态变化；
步骤S4、传代培养：使用无血清培养液混悬单个细胞接枝到蛋白包被培养瓶中，在氧气10％、二氧化碳6％、氮气84％的条件下培养，待细胞融合率达到80％后进行传代，培养72h后，计算细胞首次传代培养收获的细胞数量；
步骤S5、冷冻保存：将经过3次传代培养后的间充质干细胞于冻存保护液中长期保存。
其中，步骤S3中所述特制培养基包括以下原料：黄芪多糖、PRP、骨髓间充质干细胞和无血清培养基，其中黄芪多糖与无血清培养基用量比为0.6mg：1mL，PRP与无血清培养基的体积比为1:8，骨髓间充质干细胞的用量为无血清培养基质量的0.4％。
其中，步骤S4中蛋白包被培养瓶的制备具体步骤如下：
步骤A1、制备醋酸缓冲溶液，向醋酸缓冲溶液中加入醋酸钠固体，搅拌均匀，控制体系的pH值为5.3，并使用0.2μm的无菌过滤器过滤除菌备用；
步骤A2、培养瓶的包被，向细胞培养瓶中添加2.5mL浓度为5μg/mL的纤连蛋白和2.5mL浓度为0.1g/mL的抗CD90单克隆抗体的醋酸缓冲水溶液，4℃孵育12h后，无菌吸取缓冲液，然后使用生理盐水和无血清培养液分别冲洗一次，即得到蛋白包被培养瓶。
其中，步骤S5中所述冻存保护液含有8％的DMSO和8％的人血清蛋白，余量为DMEM/F12培养基。
实施例3
一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，具体包括以下步骤：
步骤S1、脐血的采集与运输；脐血来自2020年10月的正常足月分娩的胎儿脐带血，取标本前经医院伦理委员会批准、并征得产妇及家属同意，脐带血量在90ml；血清体积分数为20％；
步骤S2、间充质干细胞的提取：将脐带血与质量分数6％的羟乙基淀粉水溶液按照体积比4:1加入烧杯中，室温条件下，转速30r/min搅拌5min后，静置45min，然后取上清液，于转速1000r/min条件下离心处理10min，弃去上清，培养基重悬细胞后加至含有等体积的Ficoll分离液上，于转速1800r/min条件下离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min后，洗涤2次，得到间充质干细胞；
步骤S3、原代培养：将步骤S2所得的间充质干细胞接种于特制培养基中，接种密度为1.0×106个/L，然后置于37℃、体积分数为0.03％的CO2饱和湿度的培养箱内培养，培养72h后倾倒去全部的上清液体，以后每3天全量换液1次，培养6天，同时记录观察贴壁细胞的形态变化；
步骤S4、传代培养：使用无血清培养液混悬单个细胞接枝到蛋白包被培养瓶中，在氧气10％、二氧化碳6％、氮气84％的条件下培养，待细胞融合率达到80％后进行传代，培养72h后，计算细胞首次传代培养收获的细胞数量；
步骤S5、冷冻保存：将经过3次传代培养后的间充质干细胞于冻存保护液中长期保存。
其中，步骤S3中所述特制培养基包括以下原料：黄芪多糖、PRP、骨髓间充质干细胞和无血清培养基，其中黄芪多糖与无血清培养基用量比为1mg：1mL，PRP与无血清培养基的体积比为1:10，骨髓间充质干细胞的用量为无血清培养基质量的0.5％。
其中，步骤S4中蛋白包被培养瓶的制备具体步骤如下：
步骤A1、制备醋酸缓冲溶液，向醋酸缓冲溶液中加入醋酸钠固体，搅拌均匀，控制体系的pH值为5.3，并使用0.2μm的无菌过滤器过滤除菌备用；
步骤A2、培养瓶的包被，向细胞培养瓶中添加2.5mL浓度为5μg/mL的纤连蛋白和2.5mL浓度为0.1g/mL的抗CD90单克隆抗体的醋酸缓冲水溶液，4℃孵育12h后，无菌吸取缓冲液，然后使用生理盐水和无血清培养液分别冲洗一次，即得到蛋白包被培养瓶。
其中，步骤S5中所述冻存保护液含有10％的DMSO和10％的人血清蛋白，余量为DMEM/F12培养基。
对比例1
本对比例为专利公布号CN 111172104 A公布的一种脐血间充质干细胞的分离培养方法所培养出的脐血间充质干细胞。
对实施1-3和对比例1培养的脐血间充质干细胞进行原代培养获取率和分化潜能鉴定；
获取率测定过程如下：将各组实施例步骤S3得到的细胞和对比例1原代培养的细胞，取标准体积作为样品，采用台盼蓝法进行细胞计数，做3次重复，取平均值，记录细胞数量；
分化潜能鉴定：
(1)向脂肪细胞诱导分化：以每孔2x104的密度将步骤S4获取的细胞接种在25cmx25cm塑料培养瓶和6孔板，诱导分化体系为含10％FBS、10-6mol/L地塞米松、100ug/mL1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50ug/mL抗坏血酸的IMDM培养基，每3天半量换液1次，第14天采用油红0染色是否呈阳性，于倒置显微镜下观察脂肪空泡的形成；
(2)向成骨细胞诱导分化:细胞以每孔2x104的密度接种于25cmx25cm塑料培养瓶和6孔板，诱导分化体系为含1.0x10-8mol/L地塞米松、2x105mol/L抗坏血酸，7.0x10-3mol/L的B-磷酸甘油的IMDM培养基，每3天半量换液1次，第14天用VonKossa染色检测是否有钙化基质沉积；测试结果如下表所示：
Figure BDA0003093666760000091
Figure BDA0003093666760000101
由上表可以看出，实施例1-3的脐血间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化结果表明细胞浆中油红O染色呈阳性，且含有脂肪空泡，说明分离出的细胞具有向脂肪分化的能力，向成骨细胞诱导分化测试中有矿化基质沉积，说明本发明分离出的脐带间充质干细胞能具有良好的成骨分化能力，并且本发明实施例1-3培养方法所得的原代脐血间充质干细胞数量远多于对比例1的培养方法，综上，本发明的培养方法操作简单，无外源性污染，安全可靠，并且细胞增殖率高。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤S1、脐血的采集与运输；
步骤S2、间充质干细胞的提取：将脐带血与羟乙基淀粉水溶液按照体积比4:1加入烧杯中，室温条件下，搅拌5min后，静置30-45min，取上清液，离心处理10min，弃去上清，培养基重悬细胞后加至含有等体积的Ficoll分离液上，离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min后，洗涤2次，得到间充质干细胞；
步骤S3、原代培养：将步骤S2所得的间充质干细胞接种于特制培养基中，接种密度为1.0×106个/L，然后置于37℃、体积分数为0.03％的CO2饱和湿度的培养箱内培养，培养72h后倾倒去全部的上清液体，以后每3天全量换液1次，培养6天，同时记录观察贴壁细胞的形态变化；
步骤S4、传代培养：使用无血清培养液混悬单个细胞接枝到蛋白包被培养瓶中，在低氧条件下培养，待细胞融合率达到80％后进行传代，培养72h后，计算细胞首次传代培养收获的细胞数量；
步骤S5、冷冻保存：将经过3次传代培养后的间充质干细胞于冻存保护液中长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤S1中所述脐血采集时间与制备时间的间隔小于8h，脐血体积大于80mL，血清体积分数为10-20％。
3.根据权利要求1所述的一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤S3中所述特制培养基包括以下原料：黄芪多糖、PRP、骨髓间充质干细胞和无血清培养基，其中黄芪多糖与无血清培养基用量比为0.1-1mg：1mL，PRP与无血清培养基的体积比为1:5-10，骨髓间充质干细胞的用量为无血清培养基质量的0.3-0.5％。
4.根据权利要求1所述的一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤S4中蛋白包被培养瓶的制备具体步骤如下：
步骤A1、制备醋酸缓冲溶液，向醋酸缓冲溶液中加入醋酸钠固体，搅拌均匀，控制体系的pH值为5.3，并使用0.2μm的无菌过滤器过滤除菌备用；
步骤A2、培养瓶的包被，向细胞培养瓶中添加2.5mL浓度为5μg/mL的纤连蛋白和2.5mL浓度为0.1g/mL的抗CD90单克隆抗体的醋酸缓冲水溶液，4℃孵育12h后，无菌吸取缓冲液，然后使用生理盐水和无血清培养液分别冲洗一次，即得到蛋白包被培养瓶。
5.根据权利要求1所述的一种脐血含有间充质干细胞的培养方法，其特征在于，步骤S5中所述冻存保护液含有5-10％的DMSO和1-10％的人血清蛋白，余量为DMEM/F12培养基。
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