CN110862961A - 一种骨髓间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种骨髓间充质干细胞的制备方法，涉及干细胞制备领域，本发明包括：将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。本发明采用梯度离心贴壁结合两轮抗体正向筛选法从骨髓液中分离高纯度间充质干细胞，培养过程中无大量杂细胞，结合抗体的细胞不会被洗脱至细胞中，细胞功能不受影响。本发明的制备方法安全，并且纯化和扩增骨髓间充质干细胞能力强。

Description

一种骨髓间充质干细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及干细胞制备技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我复制能力和多向分化能力，并且来源广泛，例如可来源于骨髓、脐带血、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等。间充质干细胞有三个显著的特点：1、体外培养的间充质干细胞是贴壁生长的。来源广泛，易于提取，可大量扩增。2、间充质干细胞高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD31、CD34、CD45、HLADR、CD14、CD19和CD11b等标志物。3、在合适的刺激因素下，间充质干细胞能分化成成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等多种组织的细胞。

骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)既往称为骨髓基质成纤维细胞，是存在于骨髓中的一类非造血干细胞。骨髓间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。骨髓间充质干细胞具有间充质干细胞的普遍特性：1、具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力。2、具有免疫调节和修复组织损伤的特殊功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能，并通过释放细胞因子促进组织修复。3、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性。4、骨髓间充质干细胞低度表达MHC-Ⅰ分子，不表达MHC-Ⅱ分子和B7-1、B7-2等共刺激分子，具有很低的免疫原性，能逃脱宿主免疫系统的排除。因此，骨髓间充质干细胞是一种具有巨大临床应用潜力的种子细胞。近年来，国内外已经开展了利用骨髓间充质干细胞的多项临床试验，例如治疗心肌梗死、脊髓损伤、糖尿病、系统性红斑狼疮、肝硬化和膝骨关节炎等疾病。

常规获取骨髓间充质干细胞的方法主要有以下几种：①贴壁分离法：利用MSCs贴壁生长的性质将其分离；②密度梯度离心法：利用Ficoll或者Percoll分离液通过密度梯度离心将MSCs和其他细胞分离；③免疫磁珠法：利用能结合MSCs表面特有标志物的抗体将MSCs和其他细胞分开。

贴壁分离法和密度梯度离心法虽然操作简单，但是分离得到的间充质干细胞纯度不高，杂细胞会伴随着间充质干细胞一起增殖，从而逐渐降低间充质干细胞的纯度和生长速度。传统的免疫磁珠法是先用抗体结合间充质干细胞，然后再用磁珠和磁场分离得到纯化的间充质干细胞。免疫磁珠法能得到纯度很高的间充质干细胞，但是抗体和磁珠会结合在间充质干细胞的表面，对细胞有损伤，也可能会非特异性激活目标细胞或者影响目标细胞在下游实验中的功能。

发明内容

为了解决现有骨髓间充质干细胞的制备方法存在的诸多问题，本发明提供一种骨髓间充质干细胞的制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。

作为优选的实施方式，本发明的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、用50mM的磷酸盐缓冲溶液分别溶解CD73抗体和CD90抗体，使其浓度为10～20μg/ml，2ml/皿加入到100mm细胞培养皿中，4℃放置过夜；

步骤二、第二天弃去包被液后，用PBS清洗3次，每个皿中加入2ml人血白蛋白，37℃封闭1h；

步骤三、用PBS清洗3次，留存待用；

步骤四、取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管中，同时振荡离心管，使肝素和骨髓液迅速混合；

步骤五、向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液；

步骤六、将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min；

步骤七、弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀；

步骤八、按照骨髓液与分离液1:2的体积比例将细胞悬液沿50ml离心管壁加入比重为1.077的Ficoll分离液；

步骤九、700g离心30min；

步骤十、取中间层细胞，转移至无菌离心管内，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min；

步骤十一、弃上清，加入生理盐水1800r/min离心10min，清洗两次；

步骤十二、用含有血清替代物的完全培养基重悬细胞并进行细胞计数；

步骤十三、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD73抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十四、培养48～72小时后半量换液，弃去未贴壁细胞，得到纯化的骨髓间充质干细胞；以后每隔3天半量换液1次；当细胞融合达到80％时进行传代；

步骤十五、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min；

步骤十六、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD90抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十七、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min，得到高纯度的骨髓间充质干细胞。

本发明还提供一种由上述制备方法制备的骨髓间充质干细胞。

本发明的有益效果是：

本发明采用梯度离心贴壁结合两轮抗体正向筛选法从骨髓液中分离MSCs，其原理如下：利用不同细胞间存在的沉降速度差，使用淋巴细胞分离液经密度梯度离心后，不需要的红细胞聚集在离心管的底部形成沉淀，MSCs细胞被富集在血浆层和淋巴细胞分离液层之间，即白膜层细胞，得到骨髓间充质干细胞；再用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞，待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；最后用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞，待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。

本发明的制备方法与贴壁分离法和密度梯度离心法相比，不存在培养过程中含有大量杂细胞的情况，而且经过两轮抗体，细胞纯度得到了更大的提升，分离BMMSCs纯度更高；与免疫磁珠法相比，本发明中抗体结合于细胞培养中，在洗脱过程中，结合抗体的细胞不会被洗脱至细胞中，细胞在功能上也不会受到任何影响，并且新生长的细胞不含有抗体，不会对细胞表面蛋白产生影响，更有利于BMMSCs的存储与应用。

本发明的制备方法在安全性、纯化和扩增能力方面，明显优于常规的分离方法，使用的血清替代物完全培养基优于常规的含血清培养基，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的一种骨髓间充质干细胞的制备方法的流程图。

具体实施方式

如图1所示，本发明的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，主要通过使用梯度离心结合两轮抗体筛选的方法来获取高纯度的骨髓间充质干细胞，主要包括以下步骤：

将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。

本发明采用梯度离心贴壁结合两轮抗体正向筛选法，在密度梯度离心结束后，非目标细胞和红细胞共同沉淀在离心管底部，直接从血浆层下面即白膜层收集骨髓间充质干细胞；再经两轮抗体结合特异性干细胞培养后，进一步获得更高纯度的骨髓间充质干细胞。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1高纯度骨髓间充质干细胞的制备-梯度离心结合两轮抗体筛选(本发明)

(1)用50mM的磷酸盐缓冲溶液分别溶解CD73抗体和CD90抗体，使其浓度为10～20μg/ml，2ml/皿加入到100mm细胞培养皿中，4℃放置过夜；

(2)第二天弃去包被液后，用PBS清洗3次，每个皿中加入2ml人血白蛋白，37℃封闭1h；

(3)用PBS清洗3次，留存待用；

(4)取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管中，同时振荡离心管，使肝素和浓稠髓腔血迅速混合，防止小型凝血块的出现；

(5)向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液；

(6)将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min；

(7)弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀；

(8)按照骨髓液与分离液1:2的体积比例将细胞悬液沿50ml离心管壁加入比重为1.077的Ficoll分离液；

(9)将离心机升速、降速均调至最慢的速度，700g离心30min；

(10)取中间层细胞，转移至新无菌离心管内，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min；

(11)弃上清，加入适量生理盐水1800r/min离心10min，清洗两次；

(12)用含有血清替代物的完全培养基重悬细胞并进行细胞计数；

(13)将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD73抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

(14)培养48～72小时后半量换液，弃去未贴壁细胞，得到纯化的骨髓间充质干细胞；以后每隔3天半量换液1次；当细胞融合达到80％时进行传代；

(15)待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min；

(16)将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD90抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

(17)待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min，得到高纯度的骨髓间充质干细胞。

对比例1高纯度骨髓间充质干细胞的制备-贴壁分离法

(1)取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管，同时振荡离心管，使肝素和浓稠髓腔血迅速混合，防止小型凝血块的出现。

(2)向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液。

(3)将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min。

(4)弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀。

(5)将细胞接种于100mm培养皿中。放入37℃、5％CO₂培养箱培养。

(6)待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min既得高纯度的骨髓间充质干细胞。

对比例2高纯度骨髓间充质干细胞的制备-密度梯度离心法

(1)取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管，同时振荡离心管，使肝素和浓稠髓腔血迅速混合，防止小型凝血块的出现。

(2)向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液。

(3)将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min。

(4)弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀。

(5)按骨髓液与分离液1：2的体积比例将细胞悬液轻轻沿50ml离心管壁加入比重为1.077的Ficoll分离液。

(6)将离心机升速、降速均调至最慢的速度，700g离心30min。

(7)取中间层细胞，转移至新无菌离心管内，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min。

(8)弃上清，加入适量生理盐水1800r/min离心10min，清洗两次。

(9)将细胞接种于100mm培养皿中。放入37℃、5％CO₂培养箱培养。

(10)待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min既得高纯度的骨髓间充质干细胞。

试验例1纯度检测

将实施例1和对比例1、对比例2增值培养得到的骨髓间充质干细胞进行纯度检测。将3种方法培养的骨髓间充质干细胞用干细胞温和消化酶消化，用PBS重悬。每种制备方法取6支流式上样管，分别编号1号、2号……6号。1号管作为阴性对照管，2号作为阳性对照管，其余为样本管。取1ml细胞，将细胞密度调整为1*10⁶个/ml，制成细胞悬液。取50μl细胞分别加入1号，3号～6号流式上样管中，2号管加50μl补偿微球。之后1号管加入30μl PBS；2号管加入10μl CD73，10μl CD90，10μl CD105；3号管加入10μl CD73，20μl PBS；4号管加入10μlCD90，20μlPBS；5号管加入10μl CD105，20μl PBS；6号管加入10μl CD73，10μl CD90，10μlCD105。保持每管中的细胞密度相等，混匀，避光孵育30min。孵育结束后，在每个流式上样管中分别加入500μl PBS，混匀，1000r/min，离心5min。弃上清，每管分别加入500μl PBS重悬细胞。混匀后上机分析，分析结果如表1所示：

表1细胞纯度检测试验结果

实验组	CD73	CD90	CD105
				对比例1	85％	87％	87％
对比例2	90％	94％	87％
				实施例1	99％	97％	99％

纯度检测试验结果分析：

通过对实施例1、对比例1，对比例2制备方法得到的骨髓间充质干细胞做流式细胞仪检测，根据结果对比可以发现，实施例1的表面抗原纯度均达到了97％以上，比对比例1和对比例2的表面抗原纯度高，说明实施例1的提取方法提取的骨髓间充质干细胞的纯度要优于对比例1和对比例2。

试验例2增殖能力检测

按实施例1和对比例1、对比例2的方法进行骨髓间充质干细胞的增值培养，分别在则指培养的第3、4、5天时检测细胞数量，结果如表2所示：

表2细胞增殖试验结果

细胞增殖试验结果分析：

通过对实施例1、对比例1，对比例2制备方法得到的骨髓间充质干细胞做细胞数检测，根据结果对比可以发现，实施例1在第3d、第4d、第5d的细胞数量均高于对比例1和对比例2。说明实施例1的提取方法提取的骨髓间充质干细胞的增殖效果要优于对比例1和对比例2。

本发明公开了一种骨髓间充质干细胞的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

Claims (3)

1.一种骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将骨髓液与0.9％的生理盐水混合，经密度梯度离心，从血浆下层收集间充质干细胞；用包被CD73抗体的细胞培养板培养白膜层细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化；用包被CD90抗体的细胞培养板继续培养骨髓间充质干细胞；待细胞长至70～80％时，将细胞用干细胞温和消化酶消化并收集高纯度的骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、用50mM的磷酸盐缓冲溶液分别溶解CD73抗体和CD90抗体，使其浓度为10～20μg/ml，2ml/皿加入到100mm细胞培养皿中，4℃放置过夜；

步骤二、第二天弃去包被液后，用PBS清洗3次，每个皿中加入2ml人血白蛋白，37℃封闭1h；

步骤三、用PBS清洗3次，留存待用；

步骤四、取骨髓液5～6mL，放入含有2～3mL肝素的50mL离心管中，同时振荡离心管，使肝素和骨髓液迅速混合；

步骤五、向骨髓液中加入等体积生理盐水，用吸管吹打混匀制成细胞悬液；

步骤六、将上述混匀的细胞悬液进行离心，800r/min，离心8min；

步骤七、弃掉上层脂肪细胞层，剩余的细胞反复吹打混匀；

步骤八、按照骨髓液与分离液1:2的体积比例将细胞悬液沿50ml离心管壁加入比重为1.077的Ficoll分离液；

步骤九、700g离心30min；

步骤十、取中间层细胞，转移至无菌离心管内，加入等体积的生理盐水，1500r/min离心15min；

步骤十一、弃上清，加入生理盐水1800r/min离心10min，清洗两次；

步骤十二、用含有血清替代物的完全培养基重悬细胞并进行细胞计数；

步骤十三、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD73抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十四、培养48～72小时后半量换液，弃去未贴壁细胞，得到纯化的骨髓间充质干细胞；以后每隔3天半量换液1次；当细胞融合达到80％时进行传代；

步骤十五、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min；

步骤十六、将细胞以1×10⁶的浓度接种于包被CD90抗体的100mm培养皿中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养；

步骤十七、待细胞达到70～80％时，每皿加入0.9％生理盐水清洗细胞表面，取3ml干细胞温和消化酶消化细胞，收集细胞悬液至50ml无菌离心管内，1800rpm离心10min，得到高纯度的骨髓间充质干细胞。

3.如权利要求1或2所述的制备方法制备的骨髓间充质干细胞。

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