CN111733128A - 人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法 - Google Patents

人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法 Download PDF

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Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
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    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Abstract

本发明涉及一种人脂肪间充质干细胞制备方法，包括：步骤一：获取脂肪组织碎片并进行消化处理得到含有脂肪组织的消化液；步骤二：离心后取底层沉淀物以获得血管基质组分，加入培养基进行吹打重悬和计数；步骤三：将血管基质组分重悬后缓慢加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中进行离心后，取上层培养基液体至新的离心管中加入培养基再次离心后取上清液重悬以去除红细胞，得到血管基质组分细胞悬液；步骤四：将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中进行接种培养；步骤五：进行细胞传代培养和冻存。通过本发明的制备方法，对细胞损伤小，因而得到的脂肪间充质干细胞活性高，且得率高，能够有效去除红细胞干扰的同时减少对干细胞的损伤。

Description

人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，特别涉及一种人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法。
背景技术
脂肪间充质干细胞(adipose—derived stem cells，ADSCs)是在脂肪组织的血管基质组分(Stromal Vascular Fraction,SVF)中发现的一类间充质干细胞，是一种具有多向分化潜能的中胚层来源的成体干细胞，在一定的诱导条件下能够分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，并且具有免疫调节的作用。脂肪间充质干细胞的来源非常广泛，可以从脂肪抽吸术或脂肪切除术中大量获得，少量组织即可获取大量干细胞，能够在体外稳定增殖且衰亡率低，适宜大规模培养。此外，随着医学水平的提高，吸脂手术越来越普遍，且风险小，这表明了脂肪间充质干细胞可为再生医学的研究提供丰富的原材料。
血管基质组分(SVF)是脂肪组织去除成熟脂肪细胞后获得的具有干细胞特性的基质细胞团,是一组混合细胞群体。血管基质组分(SVF)的分离是制备脂肪间充质干细胞的关键步骤，分离血管基质组分(SVF)的方法包括酶消化法和机械分离法，机械分离法具有安全、成本低、时间短的特点，但干细胞得率低；而酶消化法操作简单，得到的脂肪干细胞得率更高，但是酶消化法的干细胞得率受酶浓度以及消化时间的影响，并且分离得到的SVF中含有大量的红细胞，红细胞会干扰脂肪干细胞的生长，导致脂肪干细胞贴壁率和存活率低。传统的红细胞去除方法是使用红细胞裂解液(NH4CL)裂解红细胞，但是NH4CL会对干细胞造成一定的损伤，并且NH4CL具有低毒性，由此可见，目前亟待提供一种安全、快速、细胞损伤低、细胞得率高的脂肪间充质干细胞制备方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种人脂肪间充质干细胞制备方法及体外分化能力鉴定方法，具有安全、快速、细胞损伤低、细胞得率高的优点。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种人脂肪间充质干细胞制备方法，包括：
步骤一：获取脂肪组织碎片并利用消化酶进行消化处理得到含有脂肪组织的消化液；
步骤二：对所述消化液进行离心后取底层沉淀物以获得血管基质组分，加入培养基进行吹打重悬和计数；
步骤三：将分离得到的血管基质组分重悬后缓慢加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中进行离心后，取上层培养基液体至新的离心管中加入培养基再次离心后取上清液重悬以去除红细胞，得到血管基质组分细胞悬液；
步骤四：将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中进行接种培养；
步骤五：待细胞生长达到对数生长期后进行细胞传代培养和冻存，并在冻存6个月后进行水浴复苏，接种于培养皿中继续传代培养。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤一具体包括：
在无菌条件下收集人源脂肪组织，并置于无菌生理盐水中；
剔除人源脂肪组织上肉眼可见的血管及纤维成分，并用无菌PBS缓冲液冲洗3次；
将人源脂肪组织充分剪碎后加入等体积的消化液，并在37℃的气浴摇床中进行消化处理1h，消化液为在DMEM培养基中加入1％BSA和0.1％Ⅰ型胶原酶配得；
消化处理完成后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，得到含有脂肪组织的消化液。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤二具体包括：
将含有脂肪组织的消化液用75μm滤网过滤去除未消化的残余组织；
将过滤后的消化液移入50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心10min后，留底层沉淀物以得到血管基质组分；
向血管基质组分加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培养基进行吹打重悬和计数。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤三具体包括：
取分离获得的细胞沉淀用2ml DMEM培养基重悬；
向50ml离心管中加入20ml淋巴细胞分离液后，将重悬后的细胞悬液沿离心管管壁缓慢加入到离心管中；
在1000rpm转速条件下离心20min后，收集上层培养基液体并转移至15ml离心管中，补加10mlDMEM培养基，在1800rpm转速条件下离心10min；
弃去上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到去除红细胞的血管基质组分细胞悬液。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤四具体包括：
将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中，调整细胞密度至20000个/cm2，将培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中进行接种培养；
在接种培养48h后进行首次换液，去除未贴壁细胞、死细胞及碎片。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤五具体包括：
待细胞生长达到对数生长期后吸弃细胞培养液上清液，每皿加入2ml含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化2分钟，再加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化后,用吸管轻柔吹打脱壁；
转移至50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心5min，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬，按照1：3的比例进行传代培养；
按照4℃冻存10min、-20℃冻存30min、-80℃过夜冻存、液氮冻存的顺序进行细胞冻存；
冻存6个月后，在37℃水浴中快速复苏细胞，接种于培养皿中继续传代培养。
作为本发明的一种优选方案，所述步骤五之后还进行表面标志物检测步骤，所述表面标志物检测步骤具体包括：
取所述步骤五中P3代和P8代细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后，调整细胞浓度制成细胞悬液，标记8管加入细胞悬液，使每管的细胞数目为1×106个，其中，管1-4加入P3代hADS、管5-8加入P8代hADSCs，管1、管5中不加抗体，管2、管6中加入CD44、CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR抗体的混合液，管3、管7中加入抗体CD90、CD105，管4、管8中加入抗体CD73,每种抗体加入1ul/管；
室温避光孵育30min后，用PBS缓冲液洗涤2次，加入500μL PBS缓冲液重悬细胞，利用流式细胞仪进行检测。
另一方面，本发明还提供一种人脂肪间充质干细胞体外成脂分化能力鉴定方法，包括：
取上述任一技术方案所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成脂分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成脂诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行油红O染色以检测成脂分化能力。
另一方面，本发明还提供一种人脂肪间充质干细胞体外成骨分化能力鉴定方法，其特征在于，包括：
取上述任一技术方案所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行茜素红染色以检测成骨分化能力。
另一方面，本发明还提供一种人脂肪间充质干细胞体外成软骨分化能力鉴定方法，其特征在于，包括：
取上述任一技术方案所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成软骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成软骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色以检测成脂分化能力，其中，免疫荧光染色包括对Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9进行免疫荧光染色。
综上所述，本发明具有如下有益效果：
1、将脂肪组织充分剪碎后，使用0.1％Ⅰ型胶原酶进行消化，充分剪碎组织有利于组织细胞与酶充分接触，I型胶原酶能够消化细胞间质中的胶原纤维，使组织中的干细胞得到充分释放，并且I型胶原酶的作用较缓和，对细胞损伤小，因而得到的脂肪间充质干细胞活性高，且得率高；
2、将消化后的脂肪组织使用75um滤网进行过滤，去除未消化的残余组织，使用离心法去除成熟的脂肪细胞和脂滴，防止后续操作过程中脂滴与细胞培养瓶底接触，导致细胞不易贴壁的现象，大大提高了脂肪间充质干细胞的得率和纯度；
3、使用密度梯度离心法代替传统的红细胞裂解液来去除SVF中的红细胞，能够有效去除红细胞干扰的同时减少对干细胞的损伤，提高脂肪间充质干细胞的得率和纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一步骤四中接种培养24h后的细胞形态图。
图2为本发明实施例一中的流式鉴定图。
图3为本发明实施例一中流式鉴定的区域统计表。
图4为本发明实施例二中hADSCs成脂诱导分化的形态变化图，其中，4A-4C为诱导组，4D-4F为对照组，4A和4D是第3天细胞，4B和4E是第7天细胞，4C和4F是14天细胞。
图5为本发明实施例二中hADSCs成脂分化14d后经油红O染色的细胞形态图，其中，5A为诱导组，5B为对照组。
图6为本发明实施例三中hADSCs成骨分化14d后经茜素红染色的细胞形态图，其中，6A为诱导组，6B为对照组。
图7为本发明实施例四中hADSCs成软骨诱导分化的形态变化图，其中，A-D为对照组培养第1，3，7，14天的细胞；E-H为诱导组培养第1，3，7，14天的细胞。
图8为本发明实施例四中hADSCs成软骨诱导分化经免疫荧光染色后的细胞形态图，其中，A-C分别为对照组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9的免疫荧光染色，D-F分别为诱导组Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9的免疫荧光染色。
图9为本发明实施例四中hADSCs成软骨分化14d后经甲苯胺蓝染色的细胞形态图，其中，A为对照组，B为诱导组。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种人脂肪间充质干细胞制备方法，如图1所示，包括：
步骤一：获取脂肪组织碎片并利用消化酶进行消化处理得到含有脂肪组织的消化液。
步骤一具体包括：
S101，在无菌条件下收集人源脂肪组织，并置于无菌生理盐水中，供者为无急慢性疾病及传染病的健康志愿者；
S102，剔除人源脂肪组织上肉眼可见的血管及纤维成分，并用无菌PBS缓冲液冲洗3次；
S103，将人源脂肪组织充分剪碎后加入等体积的消化液，碎片大小控制在0.3㎝*0.3㎝*0.3㎝以下，可将剪碎的组织转移入青霉素小瓶中加入消化液，并在37℃的气浴摇床中进行消化处理1h，消化过程设置转速为70r/min，消化液为在DMEM培养基中加入1％BSA和0.1％Ⅰ型胶原酶配得；
S104，消化处理完成后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，得到含有脂肪组织的消化液。
步骤二：对消化液进行离心后取底层沉淀物以获得血管基质组分，加入培养基进行吹打重悬和计数。
步骤二具体包括：
S201，将含有脂肪组织的消化液用75μm滤网过滤去除未消化的残余组织；
S202，将过滤后的消化液移入50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心10min后，离心后可见离心管内液体分为四层，依次去除第一层的脂滴、第二层的成熟脂肪细胞和第三层的上清液体，留底层沉淀物即可得到血管基质组分(SVF)；
S203，向血管基质组分中加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培养基进行吹打重悬和计数。
步骤三：将分离得到的血管基质组分重悬后缓慢加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中进行离心后，取上层培养基液体至新的离心管中加入培养基再次离心后取上清液重悬以去除红细胞，得到血管基质组分细胞悬液。
步骤三具体包括：
S301，取分离获得的细胞沉淀用2ml DMEM培养基重悬；
S302，向50ml离心管中加入20ml淋巴细胞分离液后，将重悬后的细胞悬液沿离心管管壁缓慢加入到离心管中；
S303，在1000rpm转速条件下离心20min，设置离心机升速度1、降速度0，离心后，收集上层培养基液体并转移至15ml离心管中，补加10mlDMEM培养基，在1800rpm转速条件下离心10min；
S304，弃去上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到去除红细胞的血管基质组分细胞悬液。
步骤四：将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中进行接种培养。
步骤四具体包括：
S401，将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中，调整细胞密度至20000个/cm2，将培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中进行接种培养；
S402，在培养24小时后，将细胞置于倒置显微镜下观察，出现多边形、类圆形或短梭形贴壁细胞，如图1所示；在接种培养48h后，在能够观察到约20-40％融合的长梭形贴壁细胞时，进行首次换液，去除未贴壁细胞、死细胞及碎片。
步骤五：待细胞生长达到对数生长期后进行细胞传代培养和冻存，并在冻存6个月后进行水浴复苏，接种于培养皿中继续传代培养。
步骤五具体包括：
S501，待细胞生长达到对数生长期后，即细胞融合达到70％～80％时，进行细胞传代，吸弃细胞培养液上清液，每皿加入2ml含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化2分钟，再加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化后,用吸管轻柔吹打脱壁；
S502，转移至50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心5min，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬，按照1：3的比例进行传代培养；
S503，消化所得的细胞除用于延续培养和进行相关实验之外，其余均按照4℃冻存10min、-20℃冻存30min、-80℃过夜冻存、液氮冻存的顺序进行细胞冻存，在液氮中可长期保存；
S504，冻存6个月后，在37℃水浴中快速复苏细胞，接种于培养皿中继续传代培养。
随着培养时间的延长，传代后细胞形态趋于一致，多边形和类圆形细胞减少，大部分为纺锤形或梭形细胞，核清晰，胞质颗粒明显，细胞生长速度加快；传代至5代之后，细胞形态基本一致，为纺锤形或梭形细胞，与成纤维细胞形态类似，边缘折光性强，顺向成群排列生长，呈“鱼群”样，生长速度稳定，分裂周期为48h，提示细胞具有旺盛的体外增殖能力；细胞传至第15代时，未见形态有异常改变，提示所得细胞具有较强的自我更新能力。
步骤五之后还进行表面标志物检测步骤，即对脂肪间充质干细胞表面标记物表达水平进行检测，测定CD34、CD44、CD11b、CD19、CD45、CD90、CD105、CD73、HLA-DR的表达，表面标志物检测步骤具体包括：
S601，取步骤五中P3代和P8代细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后，调整细胞浓度制成细胞悬液，标记8管加入细胞悬液，使每管的细胞数目为1×106个，其中，管1-4加入P3代hADS、管5-8加入P8代hADSCs，管1、管5中不加抗体，管2、管6中加入CD44、CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR抗体的混合液，管3、管7中加入抗体CD90、CD105，管4、管8中加入抗体CD73,每种抗体加入1ul/管；
S602，室温避光孵育30min后，用PBS缓冲液洗涤2次，加入500μL PBS缓冲液重悬细胞，利用流式细胞仪进行检测，使用补偿微球调节补偿。
如图2和图3所示，流式检测结果可见P3代hADSCs细胞CD73、CD90、CD105呈阳性，阳性表达率：CD90为99.99％、CD105为100.00％、CD73为99.87％；CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈阴性，表达率为0.06％；从上述流式结果可知，P3代hADSCs细胞阴性率低于2％，阳性率均高于95％，符合国际细胞治疗协会(ISCT)2006年推荐定义MSC的标准。
实施例二
一种人脂肪间充质干细胞体外成脂分化能力鉴定方法，包括：
S701，取实施例一的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成脂分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成脂诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验。
S702，在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化，如图4所示，在倒置显微镜观察结果显示：hADSCs成脂诱导3-6天，一部分细胞两极较诱导前变短,变为较宽的梭形或三角形；诱导7天后,细胞出现收缩,逐渐变成圆形,细胞膜凹凸不平有皱褶,沿胞膜下出现不透明细颗粒，至14天左右多房型液滴汇合成大的液泡,并将细胞核推向细胞一侧。
S703，在诱导分化14天后，进行油红O染色以检测成脂分化能力。
如图5所示，hADSCs成脂诱导分化14d后，进行油红O染色后,胞质中大小不等的圆形液滴被特异性染为橙红色，证明液滴为脂滴；未分化细胞和细胞内非脂质聚积部分不能着色；而对照组细胞只有极少数明显染色细胞，说明有少量自发成脂细胞，而诱导组细胞聚集形成紧密成簇的聚合体，并有明显的染色细胞。由此说明，hADSCs具有成脂分化能力。
实施例三
一种人脂肪间充质干细胞体外成骨分化能力鉴定方法，包括：
S801，取实施例一的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验。
S802，在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化，在倒置显微镜观察结果显示：hADSCs经成骨诱导7-10天，从单层逐渐变为多层，随后以一个核心逐渐聚集，形成具有三维空间结构的细胞团，呈多中心、放射状排列,位于中心的细胞体积增大,形态由梭形转变为卵圆形或多角形,而周围细胞仍呈长梭形状；细胞质内出现不规则的颗粒状物质，有些细胞团的中央可见棕色物质，最终形成矿化结节，即钙离子以钙盐的方式沉淀下来，所形成的的“钙结节”；14天后不规则形态的细胞数增多，体积增大；二对照组细胞形态变化不大，仍为梭形。
S803，在诱导分化14天后，进行茜素红染色以检测成骨分化能力。
如图6所示，hADSCs成骨诱导分化14d后，进行茜素红染色后，茜素红和钙发生显色反应，被诱导成骨的细胞外面沉积的钙结节被染成了深红色，从茜素红染色的效果看，对照组细胞没有明显染色细胞，而诱导组有明显深染色，由此说明hADSCs具有成骨分化能力。
实施例四
一种人脂肪间充质干细胞体外成软骨分化能力鉴定方法，包括：
S901，取上述任一技术方案的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成软骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成软骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验。
S902，在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化，如图7所示，在倒置显微镜观察结果显示：hADSCs在诱导第1天均呈现出典型的梭形或纺锤状，第3天时诱导组失去这种典型形态，第7天时，诱导组在局部出现成簇的单层聚合体，第14天时，形成直径更大的多层聚合体；整个诱导过程中，对照组均未发生明显形态变化。
S903，在诱导分化14天后，进行免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色以检测成脂分化能力，其中，免疫荧光染色包括对Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9进行免疫荧光染色。
如8所示，hADSCs成软骨诱导分化14d后，进行免疫荧光染色，对软骨细胞外基质的主要成分Ⅱ型胶原和蛋白多糖进行免疫荧光染色，可见细胞胞浆出现特异染色，而对照组无染色；成软骨分化的特异转录因子SOX9在hADSCs向软骨细胞分化过程中起到重要作用，并可指导Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成，因此，进一步对SOX9进行免疫荧光染色，结果显示诱导组出现与DAPI蓝色细胞核相重叠的红色染色，而对照组无特异染色。
如图9所示，hADSCs成软骨诱导分化后甲苯胺蓝染色结果：对照组细胞仍然呈长梭形，没有明显蓝染的细胞，而诱导组细胞聚集形成紧密成簇的聚合体，并有明显的蓝染，由此说明hADSCs具有成软骨分化能力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，包括：
步骤一：获取脂肪组织碎片并利用消化酶进行消化处理得到含有脂肪组织的消化液；
步骤二：对所述消化液进行离心后取底层沉淀物以获得血管基质组分，加入培养基进行吹打重悬和计数；
步骤三：将分离得到的血管基质组分重悬后缓慢加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中进行离心后，取上层培养基液体至新的离心管中加入培养基再次离心后取上清液重悬以去除红细胞，得到血管基质组分细胞悬液；
步骤四：将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中进行接种培养；
步骤五：待细胞生长达到对数生长期后进行细胞传代培养和冻存，并在冻存6个月后进行水浴复苏，接种于培养皿中继续传代培养。
2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：
在无菌条件下收集人源脂肪组织，并置于无菌生理盐水中；
剔除人源脂肪组织上肉眼可见的血管及纤维成分，并用无菌PBS缓冲液冲洗3次；
将人源脂肪组织充分剪碎后加入等体积的消化液，并在37℃的气浴摇床中进行消化处理1h，消化液为在DMEM培养基中加入1％BSA和0.1％Ⅰ型胶原酶配得；
消化处理完成后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，得到含有脂肪组织的消化液。
3.根据权利要求2所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：
将含有脂肪组织的消化液用75μm滤网过滤去除未消化的残余组织；
将过滤后的消化液移入50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心10min后，留底层沉淀物以得到血管基质组分；
向血管基质组分加入5ml含10％胎牛血清的DMEM培养基进行吹打重悬和计数。
4.根据权利要求3所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：
取分离获得的细胞沉淀用2ml DMEM培养基重悬；
向50ml离心管中加入20ml淋巴细胞分离液后，将重悬后的细胞悬液沿离心管管壁缓慢加入到离心管中；
在1000rpm转速条件下离心20min后，收集上层培养基液体并转移至15ml离心管中，补加10mlDMEM培养基，在1800rpm转速条件下离心10min；
弃去上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到去除红细胞的血管基质组分细胞悬液。
5.根据权利要求4所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：
将血管基质组分细胞悬液转移至培养皿中，调整细胞密度至20000个/cm2，将培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中进行接种培养；
在接种培养48h后进行首次换液，去除未贴壁细胞、死细胞及碎片。
6.根据权利要求5所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤五具体包括：
待细胞生长达到对数生长期后吸弃细胞培养液上清液，每皿加入2ml含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶，置于37℃培养箱中消化2分钟，再加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化后,用吸管轻柔吹打脱壁；
转移至50ml离心管中，在1800rpm转速条件下离心5min，弃去上清液，加入含15％胎牛血清的DMEM-F12培养基重悬，按照1：3的比例进行传代培养；
按照4℃冻存10min、-20℃冻存30min、-80℃过夜冻存、液氮冻存的顺序进行细胞冻存；
冻存6个月后，在37℃水浴中快速复苏细胞，接种于培养皿中继续传代培养。
7.根据权利要求6所述的人脂肪间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述步骤五之后还进行表面标志物检测步骤，所述表面标志物检测步骤具体包括：
取所述步骤五中P3代和P8代细胞，用PBS缓冲液洗涤2次后，调整细胞浓度制成细胞悬液，标记8管加入细胞悬液，使每管的细胞数目为1×106个，其中，管1-4加入P3代hADS、管5-8加入P8代hADSCs，管1、管5中不加抗体，管2、管6中加入CD44、CD34、CD11 b、CD19、CD45、HLA-DR抗体的混合液，管3、管7中加入抗体CD90、CD105，管4、管8中加入抗体CD73,每种抗体加入1ul/管；
室温避光孵育30min后，用PBS缓冲液洗涤2次，加入500μL PBS缓冲液重悬细胞，利用流式细胞仪进行检测。
8.一种人脂肪间充质干细胞体外成脂分化能力鉴定方法，其特征在于，包括：
取权利要求1-7中任一项所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成脂分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成脂诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行油红O染色以检测成脂分化能力。
9.一种人脂肪间充质干细胞体外成骨分化能力鉴定方法，其特征在于，包括：
取权利要求1-7中任一项所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行茜素红染色以检测成骨分化能力。
10.一种人脂肪间充质干细胞体外成软骨分化能力鉴定方法，其特征在于，包括：
取权利要求1-7中任一项所述的制备方法中步骤五培养的P3代细胞，利用人脂肪间充质干细胞成软骨分化试剂盒诱导hADSCs成脂分化，以含成软骨诱导剂的完全诱导分化培养基LG-DMEM作为诱导组、以空白LG-DMEM培养基作为对照组进行对照实验；
在诱导分化过程中与倒置显微镜下观察细胞形态学变化；
在诱导分化14天后，进行免疫荧光染色和甲苯胺蓝染色以检测成脂分化能力，其中，免疫荧光染色包括对Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9进行免疫荧光染色。
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