CN102028970A - 一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂，由人脐带胎盘来源的干细胞与含体积比浓度0.5-5％血清白蛋白的生理盐水及50-70IU/ml低分子肝素钠配制而成。所述的干细胞制剂经尾静脉输入肝硬化大鼠模型中，有效剂量为5×10⁶细胞/次，用于肝硬化的病人进行外周静脉输注的有效剂量为0.5～5×10⁶/次/kg体重。将本发明所述的干细胞制剂应用于肝硬化的大鼠和病人后，可明显改善肝硬化大鼠和病人的生存率，并能够阻滞和逆转肝硬化的进程，改善全身状态和肝功能状态，促进肝脏病理恢复，从而为临床治疗肝硬化开辟细胞治疗的新途径。

Description

一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂

技术领域

本发明属于干细胞与组织工程领域，涉及间充质干细胞的新用途，尤其是涉及人脐带胎盘来源的间充质干细胞用于治疗肝硬化的干细胞制剂。

技术背景

肝硬化是各种原因所致的肝脏慢性、进行性的弥漫性改变，由多种原因引起的肝纤维化发展而来，包括病毒性肝炎、血吸虫感染、慢性酒精中毒、代谢和遗传性疾病、肝脏瘀血、胆汁淤积、循环障碍、肠道感染、营养不良、药物或化学毒物等。我国主要以病毒性肝炎为主，其次为血吸虫病，但酒精性肝硬化有增高趋势。肝硬化早期经过积极防治后可以逆转或不再进展，而晚期将严重影响患者的生活质量，甚至危及生命，目前临床上对其治疗手段极其有限，多为对症治疗。原位肝移植是治疗终末期肝硬化的有效手段，但供体缺乏、费用昂贵，而且移植后需长期服用免疫抑制剂，因此需要积极寻找有效的治疗方法。

近年来，干细胞可塑性研究为各种疾病的治疗提供了一种新的手段。国内外均已证明在特定的条件下，造血干细胞和间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)在体内、体外特定诱导条件下均可转化为肝细胞样细胞，并能行使肝细胞的功能。随着研究深入，业已证实造血干细胞转化为肝细胞的可能性较小。MSCs是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，如骨髓、脐带血、胎盘、脐带与脂肪组织等。与造血干细胞相比，MSCs来源广泛、扩增效应强、无致瘤性、组织相容性强(经数代培养后组织相容性I类和II抗原不表达或弱表达，适宜于异体间干细胞移植)。此外，MSCs可在体外培养扩增，可塑性强，并能在特定诱导条件下还可向成纤维细胞、肝细胞、脂肪细胞、心肌细胞、成骨和软骨细胞、神经细胞、内皮细胞等分化，随着对MSCs生物学特性及功能的深入研究，目前已经从多种组织中分离出MSC，更因其扩增迅速，免疫原性低，易于转染外源基因等优点成为实施细胞治疗的理想细胞，有着广阔的临床应用前景，已成为当今干细胞移植和组织再生工程研究的热点。

动物实验和临床试验结果表明，骨髓间充质干细胞对肝硬化具有一定疗效。Yamamotoet al用Liv8-抗体将骨髓干细胞分选成造血干细胞和非造血干细胞两部分，然后分别Liv8-阳性和阴性的骨髓干细胞分别植入肝损伤的小鼠体内。4wk后，对照发现Liv8-阴性亚群的骨髓干细胞(非造血干细胞)能更有效地向肝细胞方向分化。Lee et al采用阴性免疫分选系统高效分离出人间充质干细胞(hMSCs)，并且首次采用HGF和Oncostain M二步诱导法体外培养hMSCs。4wk后可以看到细胞呈立方形和肝细胞特异的基因标记，并且具有正常肝细胞功能特性，包括合成白蛋白、贮存糖原、分泌尿素、摄取低密度脂蛋白，具有巴比妥诱导的细胞色素P450活性等。

在临床试验研究方面，Terai et al报道了9名接受从周围静脉输注自体骨髓细胞治疗的肝硬化患者，在移植24wk后，血清白蛋白、总蛋白水平明显改善(P＜0.05)，显著改善Child-Pugh分级(P＜0.05)，并未观察到任何副作用。朱康顺等报道36例肝硬化失代偿期患者肝内移植自体骨髓干细胞，移植术后2个月、3个月，ALT、TB和PT均较术前明显改善(P＜0.05)，而ALB直到术后3个月才明显好转(P＜0.05)。5例患者移植术后腹水加重，1例因腹腔感染并肝功能衰竭死亡，1例因上消化道大出血死亡。移植后2个月腹水减轻的占70.8％(17/24)，乏力好转的占83.9％(26/31)，食欲改善的占90.3％(28/31)。移植术中和术后，未见明显不良反应和并发症发生。据此认为，自体骨髓干细胞肝内移植治疗失代偿期肝硬化是一种安全的治疗措施，可起到暂时性的肝脏支持作用。

MSCs目前国内用于肝硬化试验治疗的多为自体骨髓MSCs。近年来研究表明脐带胎盘间充质干细胞有着潜在的临床应用前景和商业价值，比骨髓间充质干细胞更具优势：(1)为废物利用，来源更为容易，供者无痛苦，对母婴均无损害；(2)MSCs的含量丰富，CFU-F的形成率高，而骨髓中MSCs含量低，约为0.001％-0.01％，且随着年龄的增加细胞数量逐渐减少；(3)扩增效应更强，一根脐带的理论扩增细胞数量可达1010以上，可满足临床需要，更具商业药用价值，而骨髓MSCs扩增4代后，扩增效果明显下降；(4)经数代培养后组织相容性I类弱表达或不表达，而II类抗原不表达，更适宜于异体间干细胞移植。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人脐带胎盘来源的间充质干细胞用于制备治疗肝硬化的制剂的用途。

为实现上述发明目的，本发明所述的干细胞制剂是由人脐带胎盘来源的干细胞与含体积比浓度0.5-5％血清白蛋白的生理盐水及50-70IU/ml低分子肝素钠配制而成。

所述干细胞制剂中人脐带胎盘来源的干细胞按(0.5～5)×10⁶个细胞/kg体重，与0.5-5ml牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HSA和95-99.5ml生理盐水及50-70IU/ml低分子肝素钠配制而成。用于肝硬化的病人进行外周静脉输注的有效剂量为(0.5～5)×10⁶/次/kg体重。该有效剂量是通过动物模型实验取得治疗效果以及人体用药常识而确定的。

所述的干细胞制剂由人脐带胎盘来源的干细胞经体外培养而成。

所述人脐带胎盘来源的干细胞制剂是由从人脐带胎盘分离得到的间充质干细胞制成的细胞制剂。

所述间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞群表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105(阳性率≥98％)，不表达CD31、CD34、HLA-DR(阳性率≤2％)。

所述的人脐带胎盘来源的间充质干细胞是按以下方法制备的，将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶或培养板中，待成纤维状细胞达到70-80％融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集第3-5代细胞冻存、复苏备用。

本发明的有益效果是：利用人脐带胎盘来源的间充质干细胞通过静脉输注方式移植给肝硬化病人，明显改善肝硬化病人的生存率，并能够阻滞和逆转肝硬化的进程，改善全身状态和肝功能状态，促进肝脏病理恢复，从而为临床治疗肝硬化开辟细胞治疗的新途径。

附图说明

图1为SD大鼠肝脏组织病理切片检查结果(H&E染色，×200)图。其中，A图显示正常SD大鼠肝脏细胞分布；B图显示肝硬化模型中变性坏死的肝细胞及胶原纤维的累积；C图显示人脐带胎盘来源的间充质干细胞移植组肝脏组织重构，胶原纤维减少甚至消失。

图2为实时定量PCR法检测间充质干细胞移植组和模型组肝脏的I型胶原α链基因表达水平。

图3为人脐带胎盘来源的间充质干细胞(MSC)植入肝脏的免疫荧光示踪图。A为植入2天的示踪图；B为植入4天的示踪图；C为植入7天的示踪图；D为植入14天的示踪图。

具体实施方式

下面以大鼠肝损伤模型为例结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，因大鼠细胞用量以人单位体重用量进行换算，且因大鼠体积较小，每次只能输注1ml，因此必须减少血清蛋白及生理盐水用量，但本发明并不受限于下述实施例。

实施例1：人脐带胎盘间充质干细胞制剂的制备

将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶或培养板中，待成纤维状细胞达到70-80％融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的。收获单细胞悬液供移植用，收集第2-4代细胞严格按照低温保存步骤冻存、复苏备用。

分别取复苏的人脐带胎盘间充质干细胞1×10⁶个细胞、3×10⁶个细胞，5×10⁶个细胞，与0.05ml牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HSA和0.95ml生理盐水及60IU低分子肝素钠配制间充质干细胞制剂各1ml。

所述的DMEM/F12培养基选自GIBCO公司的CAT NO.12400-024产品。

所述的间充质干细胞呈成纤维样贴壁生长，流式细胞仪检测该细胞群表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表达CD31、CD34、HLA-DR。体外在合适的诱导条件下可以像成骨、肝系、心肌细胞分化。体内移植后可快速到达损伤的肝脏组织。本发明中所述的细胞群表达是指阳性率≥98％，不表达或低表达是指阳性率≤2％。

实施例2：肝硬化大鼠造模

二乙基亚硝胺(DEN)诱导模型：雄性SD大鼠，3.5周，90g，按DEN与无菌水体积比0.1‰，自由饮用，至4周造模成功。

硫代乙酰胺(TAA)诱导模型：雄性SD大鼠，3.5周，90g，按DEN与无菌水质量体积比0.3‰诱导2周，0.45‰诱导3周，0.6‰诱导4周，一共诱导8周，造模成功。

实施例3：人脐带胎盘来源的间充质干细胞输注实验

1.动物：雄性SD大鼠的二乙基亚硝胺(DEN)诱导模型、硫代乙酰胺(TAA)诱导模型。

2.剂量：每种模型大鼠均分为3个剂量组，分别给予1×10⁶个细胞/ml/次，3×10⁶/ml/次，5×10⁶/ml/次的细胞剂量，均为1次输注。

3.途径：尾静脉

4.治疗时机：

DEN诱导模型：为4周造模成功后停止饮用DEN配制的饮用水1周开始使用MSC制备的制剂。

TAA诱导模型：为8周造模成功后停止饮用TAA配制的饮用水1周开始使用MSC制备的制剂。

5.效果评价：

(1)精神状态、行为能力：模型组大鼠

(2)肝功能指标：细胞移植后第28天移植组、模型对照组及正常组大鼠全部处死，右心室采血5-10ml，用全自动生化分析仪检测血清肝功能指标。详见表1。结果表明，间充质干细胞移植组肝功能在治疗4周后接近正常。模型对照组肝功能均未能恢复(*P＜0.05，*表示细胞输注组与模型对照组存在显著性差异)。见下表。

(3)肝脏病理切片检查结果：H&E染色，光学显微镜下观察，间充质干细胞移植组肝脏病理结构显示肝细胞变性减轻，胶原纤维沉积大量较少甚至消失，呈现正常肝小叶结构，模型对照组存活的大鼠肝脏病理结构显示肝细胞严重变性坏死，肝小叶结构紊乱，胶原纤维增生明显，且包绕肝细胞形成硬化结节。详见图1。其中A为HE染色的正常肝脏组织切片。B为诱导后的肝脏组织切片，肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，纤维组织在全小叶多处弥漫性增生，假小叶形成。而经过MSC治疗的肝组织结构紊乱减轻，胶原纤维减少甚至消失，见图1-C。

(4)肝脏I型胶原α链基因水平检测结果：采用实时定量PCR技术分析，移植组大鼠肝脏I型胶原α链基因表达水平明显低于模型对照组，两组之间存在显著性差异。详见图2。

(5)人脐带胎盘来源的间充质干细胞(MSC)植入肝脏证据：取12只大鼠，分为4组，每组3只，4组大鼠分别示踪移植后2天、4天、7天和14天的细胞定位，用于示踪的细胞经携带红色荧光的慢病毒感染后以3×10⁶/ml/次的剂量输注给肝硬化大鼠模型。在移植后的第2、4、7、14天，采集12只大鼠的新鲜肝脏标本，其冰冻切片结果证实携带红色荧光的间充质干细胞成功植入大鼠肝脏。如图3所示，无论是DEN诱导模型还是TAA诱导模型，在移植后的第2、4、7、14天，均在肝脏内看到特异的红色荧光信号。

(6)统计学分析：所有计量型资料以均值±标准误(means±SEM)表示，进行ANOVA分析，计数型资料用Fisher’s精确概率检验分析。

上述利用本发明所述的人脐带胎盘来源的间充质干细胞制备的制剂尾静脉输注大鼠肝硬化模型的实验证明，该制剂能够阻滞和逆转肝硬化的进程，改善全身状态和肝功能状态，促进肝脏病理恢复。

本发明的优点在于：

(1)将人脐带胎盘来源的间充质干细胞移植到肝硬化模型大鼠和肝硬化病人体内，能明显提高模型大鼠和病人的生存能力，调理受损肝脏组织微环境、促进肝细胞再生和或功能的修复

(2)为临床治疗肝硬化开辟细胞治疗方法的新途径。

(3)本发明所利用的人脐带胎盘来源的间充质干细胞活力高、增殖能力强、制备简便、连续培养及冻存复苏后仍具有多向分化潜能，细胞同质性高，具有正常的核型和端粒酶活性。

(4)本发明利用人脐带胎盘来源的间充质干细胞制备的制剂静脉输注技术方案简便、易操作。

因此，我们选择人脐带胎盘来源的间充质干细胞治疗肝硬化，开发用于治疗肝组织损伤的干细胞制剂及其制备方法具有非常重要的临床意义和广阔的应用前景。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (7)

1.一种用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述的干细胞制剂是由人脐带胎盘来源的干细胞与含体积比浓度0.5-5％血清白蛋白的生理盐水及50-70IU/ml低分子肝素钠配制而成。

2.根据权利要求1所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述每100ml干细胞制剂中人脐带胎盘来源的干细胞按(0.5～5)×10⁶个细胞/kg体重，与0.5-5ml血清白蛋白和95-99.5ml生理盐水及5000-7000IU低分子肝素钠配制而成。

3.根据权利要求1或2所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白BSA或人血清白蛋白HAS。

4.据权利要求1所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述的干细胞制剂由人脐带胎盘来源的干细胞经体外培养而成。

5.根据权利要求4所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述人脐带胎盘来源的干细胞制剂是由从人脐带胎盘分离得到的间充质干细胞制成的细胞制剂。

6.根据权利要求5所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞群表达CD29、CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD45、HLA-DR。

7.根据权利要求5所述的用于治疗肝硬化的干细胞制剂，其特征在于，所述的人脐带胎盘来源的间充质干细胞是按以下方法制备：将检测合格的脐带胎盘经过机械切割后，经过II型胶原酶消化为单细胞悬液，洗涤去除胶原酶残留，将细胞悬液接种在含胎牛血清的DMEM/F12培养基的培养瓶或培养板中，待成纤维状细胞达到70-80％融合时，进行消化、传代，依此法反复传代，达到纯化和扩增间充质干细胞的目的，收集第3-5代细胞冻存、复苏，备用。

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