CN107502587A

CN107502587A - Cd29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途

Info

Publication number: CN107502587A
Application number: CN201710895137.1A
Authority: CN
Inventors: 唐静
Original assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JILIN TUO HUA BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明公开了一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途。所述CD29⁺人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。本发明的CD29⁺人脐带源间充质干细胞可在大鼠体内转化成成骨细胞参与骨折愈合，且CD29⁺人脐带源间充质干细胞免疫源性低，可作为组织工程骨的细胞来源，再配合传统的手术治疗方案，能够达到很好的治疗效果，具有广阔的应用前景。

Description

CD29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途

技术领域

本发明涉及间充质干细胞领域，具体是一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途。

背景技术

骨损伤是临床中最普遍的问题，由外伤、感染、肿瘤切除，无菌性植入物松动导致的大面积骨缺损，因再生过程中需要的骨量大，常常超出自身愈合的潜力。目前已经建立的骨重建的方法包括牵张成骨、自体/异体骨移植、骨替代品或生长因子干预等方法都有特定的适应症和局限性，严重影响该类患者的生活质量。因此，探索新的治疗途径来提高大面积骨缺损患者的愈合效果已成为当务之急。以干细胞为基础的骨组织工程已被确认为既美观又能重建骨功能的有前途的治疗方法，但这些方法大多还处于探索阶段。因此，有必要探索归巢及成骨分化方面生物学特性高的干细胞种类，进而针对不同类型骨缺损，配合传统的手术治疗方案，达到完成骨解剖及组织学重建的目的。

理想的骨组织工程种子细胞应具有以下几个特点：取材容易，对机体的损伤小；体外扩增能力强；易定向分化为成骨细胞；植入体内后能很好地适应受区生理、病理和应力等环境并保持成骨活性。当前研究的骨组织工程种子细胞基本上有三种类型：局部的，系统的和祖/干细胞的。局部的可用细胞包括成纤维细胞，骨膜成骨细胞、表皮细胞、脂肪细胞和毛囊细胞。全身细胞是存在于血液或骨髓中的细胞，如骨髓间充质干细胞或体外培养的胚胎干细胞（ES）。但是这些细胞的采集都受到供体年龄，伴随疾病，局部病理生理条件的限制。其它因素，如骨膜成骨细胞体外培养表型易丧失，无法大量扩增，而且获取骨膜成骨细胞会给机体造成很大创伤，违反组织工程的基本原则，实际应用意义不大。因此，有必要寻找可供广泛移植同源或免疫原性低的异源细胞作为组织工程骨可能的细胞来源。

发明内容

本发明提供了一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途，以丰富应用组织工程学方法治疗骨损伤这一治疗方法领域的多样性。

本发明是按照以下技术方案实施的。

一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。

一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途。

进一步的，所述CD29⁺人脐带源间充质干细胞在大鼠体内转化成成骨细胞参与骨折愈合。

本发明获得了如下有益效果。

本发明提供了一种治疗骨损伤的理想的骨组织工程种子细胞。本发明的CD29⁺人脐带源间充质干细胞可在大鼠体内转化成成骨细胞参与骨折愈合，且CD29⁺人脐带源间充质干细胞免疫源性低，可作为组织工程骨的细胞来源，再配合传统的手术治疗方案，能够达到很好的治疗效果，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明人脐带间充质干细胞刚刚帖壁时形态图；

图2是本发明人脐带间充质干细胞帖壁后4h形态图；

图3是本发明人脐带间充质干细胞扩增培养48h形态图；

图4是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD73的表达图；

图5是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD90的表达图；

图6是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD105的表达图；

图7是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD45的表达图；

图8是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物HLA-DR的表达图；

图9是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD29的表达图；

图10是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成脂图（200X）；

图11是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成骨图（400X）；

图12是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成软骨图（100X）；

图13是本发明对照组对骨不连SD大鼠骨折愈合影响图；

图14是本发明实验组对骨不连SD大鼠骨折愈合影响图；

图15是本发明对照组SD大鼠胫骨骨不连处1个月免疫荧光检查图（100X）；

图16是本发明对照组SD大鼠胫骨骨不连处2个月免疫荧光检查图（100X）；

图17是本发明对照组SD大鼠胫骨骨不连处1个月免疫荧光检查图（400X）；

图18是本发明对照组SD大鼠胫骨骨不连处2个月免疫荧光检查图（400X）。

具体实施方式

以下参照附图及实施例对本发明进行进一步的技术说明。

实施例1 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的分离

1.1将2ul抗人CD29抗体（R&D Systems，US）在4℃与多聚赖氨酸(Sigma)1mg混匀，平铺于直径90mm培养皿（上海晶安生物科技有限公司），4℃过夜备用。

1.2无菌操作，PBS（Gibco）洗涤脐带至无血迹变白。

1.3用眼科剪将组织剪成小段，纵向剖开，去除血管和脐带外皮后将华尔通胶剪成小片。

1.4将小片脐带组织放在50ml离心管里剪碎成泥状后加入0.1%的胶原酶IV（Gibco）, 37℃消化2小时，加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM（Gibco）培养液混匀，2000g离心10分钟（L-800R江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入上述培养皿中，于5% CO₂培养箱内倒置培养。

1.5 2h后弃掉上清液，添加适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液。

1.6 48小时后弃掉上清，0.25%胰酶消化3分钟，将消化液收集到50ml离心管中，2000g离心10分钟（L-800R 江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入步骤1.1所述培养皿中，添加适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液。

1.7 48小时后弃掉上清，0.25%胰酶消化3分钟，将消化液收集到50ml离心管中，2000g离心10分钟（L-800R 江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入75cm²培养瓶中，每隔3天换一次液。待融合率达85%以上，进行传代培养（试验结果参见图1-3）。

实施例2 人脐带源间充质干细胞的表面标志检查

2.1 取第5代1×10⁶细胞/ml，0.1ml/管于流式检测管中。

2.2 分别加入直接标记的荧光抗体CD29、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105（Biolegend，US）以及相应同型对照抗体进行免疫标记反应。

2.3 4℃孵育20-30分钟后，用PBS洗涤1-2次，离心弃上清。

2.4加入0.5ml PBS缓冲液混悬细胞成单个细胞悬液。

2.5采用FACSCalibur 流式细胞仪Cellquset Software分析软件进行各样本检测。

试验结果如图4-9所示，本发明人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。不表达如下二种细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD45和人白细胞抗原HLA-DR。

实施例3 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成脂分化

3.1选取生长状态良好的脐带源间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%融合时，胰酶消化。

3.2将细胞接种于六孔板中，每孔约2.5×10⁴个细胞，加入2ml/孔完全培养液，分别放入37℃，5% CO₂孵箱和低氧培养箱中培养24h。

3.3 24h后，移去旧的培养液，在上述六孔板中加入脂诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、0.6mM IBMX、12mg/L胰岛素、10^-5M地塞米松和250μM吲哚美辛），诱导21天。

3.4弃掉培养板内的培养基，用PBS冲洗2次，加入4%中性甲醛，固定30min，吸去固定液。

3.5加入现配过滤后的油红O染色液，染色30min，PBS 洗 3次，去除残留的染色液和残渣，光学显微镜下进行脂滴观察。

试验结果如图10所示，可见细胞质内有红色脂肪滴形成。

实施例4 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成骨分化

4.1选取不同个体来源生长状态良好的间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%时，胰酶消化。

4.2 将细胞接种于六孔板中，接种细胞密度1×10⁶个/ml，每孔加入3ml完全培养液，放入37℃，5% CO2孵箱中培养。

4.3 24h后，移去旧的培养液，在上述六孔板中加入成骨诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、10^-8M的地塞米松、15mM的β-甘油磷酸钠、70mg/L的抗坏血酸），空白对照组换上a完全培养基培养（α-MEM培养基添加10%胎牛血清）。此为诱导第1天。

4.4 每三天换液，诱导三周后进行茜素红染色。弃掉六孔板板内的培养基，PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，PBS冲洗3次，加入适量0.1%茜素红，37℃，染色30min，PBS冲洗一次。显微镜下进行观察钙化结节并拍照。

试验结果如图11所示，可见细胞质内有红色钙结节形成。

实施例5 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成软骨分化

5.1选取生长状态良好的脐带源间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%融合时，胰酶消化。

5.2将细胞接种于六孔板中，每孔约2.5×10⁴个细胞，加入2ml/孔完全培养液，分别放入37℃，5% CO₂孵箱和低氧培养箱中培养24h。

5.3 24h后移去旧的培养液，在上述六孔板中加入成软骨诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、60mg/L抗坏血酸、0.3μmol/L地塞米松、15ng/ml TGF-β-1），每隔三天换液一次，诱导21天后进行阿利新蓝染色鉴定。

试验结果如图12所示，可见细胞质蓝染。

实施例6：CD29⁺人脐带源间充质干细胞对骨不连SD大鼠骨折愈合的影响

雄性SD大鼠24只，体重230-270g，在右侧胫骨中段截断,用口腔科粘固粉充填器(3^#或4^#)灼烧骨折断端(包括骨膜),长度0.2mm。然后用0.5 mm克氏针钻入骨髓腔,固定骨折,选用1ml注射器抽取CD29⁺人脐带源间充质干细胞与SD大鼠血浆混悬液0.2ml（5×10⁶个细胞），静止10分钟后，缝合手术切口，术后肌注青霉素钠每公斤体重2万单位，连续3天，防止感染。2个月后经大体标本、病理组织学及放射学检查确定骨不连形成情况。动物分别于术后1、2个月处死，每批6只，处死后取右侧胫骨作大体观察并拍X线平片，拍片后标本采用10%甲醛液固定，5%硝酸脱钙，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，HE染色，供组织学观察。

图13从左至右依次为对照组（血浆移植组）移植后0、1、2个月图，该组移植后X线片见骨折线仍清晰可见。

图14从左至右依次为实验组（MSC+血浆组）移植后0、1、2个月图，该组移植后1个月X线片见骨折线仍清晰可见，2个月X线片见骨折线模糊不清，3个月X线片见骨折线消失已愈合。

实施例7：CD29⁺人脐带源间充质干细胞在骨不连SD大鼠骨折愈合处的转化的影响

雄性SD大鼠24只，体重230-270g，在右侧胫骨中段截断,用口腔科粘固粉充填器(3^#或4^#)灼烧骨折断端(包括骨膜),长度0.2mm。然后用0.5 mm克氏针钻入骨髓腔,固定骨折,选用1ml注射器抽取CD29⁺人脐带源间充质干细胞与SD大鼠血浆混悬液0.2ml（5×10⁶个细胞），静止10分钟后，缝合手术切口，术后肌注青霉素钠每公斤体重2万单位，连续3天，防止感染。2个月后经大体标本、病理组织学及放射学检查确定骨不连形成情况。动物分别于术后1、2个月处死，每批6只，处死后取右侧胫骨作大体观察并拍X线平片，拍片后标本采用10%甲醛液固定，5%硝酸脱钙，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片。切片常规用二甲苯脱蜡3次，每次15min；无水乙醇、90%、80%、70%各级乙醇依次脱水至蒸馏水，毎次2min；分别用兔抗多克隆骨形成蛋白抗体（红色荧光）与鼠抗人抗核抗体（绿色荧光）2μl，4℃孵育过夜，蒸馏水缓慢冲洗；加入抗兔、鼠的抗体30min，中性树脂封片。供组织学观察。

实验结果如图15-18所示，移植后的一个月，实验组（MSC+血浆组）用骨形成蛋白抗体与抗人抗核抗体共同检查发现在骨折愈合处，可见表达双色荧光出现。上述证据表明，脐带源间充质干细胞可以在大鼠体内转化成成骨细胞参与骨折愈合。

Claims

1.一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞，其特征在于：表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。

2.一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途。

3.根据权利要求2所述的一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗骨损伤的骨组织工程种子细胞中的用途，其特征在于：所述CD29⁺人脐带源间充质干细胞在大鼠体内转化成成骨细胞参与骨折愈合。