CN115404209A - 一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 - Google Patents
一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115404209A CN115404209A CN202211156916.7A CN202211156916A CN115404209A CN 115404209 A CN115404209 A CN 115404209A CN 202211156916 A CN202211156916 A CN 202211156916A CN 115404209 A CN115404209 A CN 115404209A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cells
- extracellular vesicles
- extracellular
- polyamino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 114
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 title claims description 34
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 29
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 25
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 abstract description 31
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract description 14
- 230000005012 migration Effects 0.000 abstract description 12
- 238000013508 migration Methods 0.000 abstract description 12
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 8
- 230000009818 osteogenic differentiation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013329 compounding Methods 0.000 abstract 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091054442 EV proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000007959 normoxia Effects 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 1
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101000836492 Dictyostelium discoideum ALG-2 interacting protein X Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001134621 Homo sapiens Programmed cell death 6-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 1
- 230000024121 nodulation Effects 0.000 description 1
- 230000004072 osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001694 thigh bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。本发明将骨髓间充质干细胞进行低氧处理(1％O2)，然后对骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的收集，并将其应用于促进成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，以及利用细胞外囊泡与一种聚氨基酸温敏水凝胶复合用于治疗颅骨缺损。本发明中应用的低氧条件极大提高了骨髓间充质干细胞释放囊泡的能力，解决了细胞外囊泡在临床转化应用中产量低的难题。另外，低氧处理还优化了囊泡内容物的表达，有利于在骨缺损模型中发挥高效的修复作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。
背景技术
病理性骨吸收及缺损是临床上非常常见的一类病理现象，由于其吸收过程缓慢且无临床不适症状，通常不能及时引起人们的关注及干预。骨组织缺损在临床中主要通过移植骨进行修复，而移植骨的来源及免疫原性是治疗过程中医生和患者难以克服的障碍。研究人员尝试开发各种生物支架材料来满足临床移植骨的需求，将生物支架材料与干细胞共培养，评估其生物相容性，制备具有主动诱导作用的支架是当前热门的研究思路。然而，由于干细胞在体外生存条件严苛、不同来源干细胞免疫原性具有差异及干细胞在生物支架中存活率不稳定等因素，极大地限制了干细胞及生物支架材料在临床中的转化应用。
随着干细胞研究的进展和生物检测技术的进步，研究者们发现旁分泌机制在干细胞促进组织修复过程中发挥了重要作用，其中细胞外囊泡的作用受到极大关注。细胞外囊泡是一类由细胞主动释放的纳米级脂质双分子层囊泡，与细胞具有相似的生物学特性，在生理和病理环境中均可以分泌，通过运输蛋白质和多种RNA成分参与调控细胞内外平衡及细胞间通讯。已有大量研究表明，来源于间充质干细胞的细胞外囊泡能缓解心血管疾病的症状、修复缺损的软骨及皮肤损伤，作为一种安全性更高的非细胞药物，其治疗效果及安全性受到了肯定。骨组织修复需要动员骨髓内的间充质干细胞，而这些干细胞在体内长期处于生理性低氧环境中，与常规体外培养的常氧环境不一致，这些问题和限制因素都导致细胞层面和动物水平的研究成果无法实现临床转化。
目前，细胞外囊泡在实验室的研究及应用中均表现出卓越的修复效果。但是，其提取步骤复杂和产量低严重制约了其临床转化潜能，成为本领域研究人员亟待解决的难题。研究人员往往无法通过简单的处理同时提高细胞外囊泡的产量和质量。因此，开发一种实用的，能有效促进细胞外囊泡释放，同时不影响或者提高囊泡治疗质量的策略至关重要，有望加速细胞外囊泡临床应用转化的进程。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用。本发明将骨髓间充质干细胞进行低氧处理(1％O2)，然后对骨髓间充质干细胞细胞外囊泡(也简称为“细胞外囊泡”)的收集，并将其应用于促进成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，以及利用细胞外囊泡与一种聚氨基酸温敏水凝胶复合用于治疗颅骨缺损。本发明中应用的低氧条件极大提高了骨髓间充质干细胞释放囊泡的能力，解决了细胞外囊泡在临床转化应用中的产量低的难题。另外，低氧处理还优化了囊泡内容物的表达，有利于在骨缺损模型中发挥高效的修复作用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，包括以下步骤：
(1)骨髓间充质干细胞的低氧处理：将骨髓间充质干细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中进行培养，得到成熟的骨髓间充质干细胞，后处理后将成熟的骨髓间充质干细胞置于含无外泌体血清的细胞培养基，进行低氧培养；
(2)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液的获取：收集步骤(1)中低氧培养后的上清液，离心弃沉淀以去除残留的细胞和细胞碎片，得到骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液；
(3)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取：将步骤(2)得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液离心弃沉淀以去除杂质蛋白；进一步离心弃上清获得粗细胞外囊泡；将粗细胞外囊泡用PBS重悬，离心弃上清获得纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述骨髓间充质干细胞为扩增到P3～P5代的骨髓间充质干细胞。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基；
含无外泌体血清的细胞培养基为含2％无外泌体血清的细胞培养基。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，低氧处理过程中置于体积分数为1％的O2培养箱中，培养温度为37℃，培养时间为48h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，将纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡用PBS重悬后于-80℃下保存。
本发明的第二个目的是提供一种通过上述方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
本发明的第三个目的是提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入预冷的聚氨基酸温敏水凝胶中，混匀得到负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
本发明的第四个目的是提供一种通过上述方法制备得到的负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
本发明的第五个目的是提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶在制备治疗颅骨缺损药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，包括以下步骤：
(1)颅骨成骨细胞的增殖：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨成骨细胞中，进行增殖培养；
(2)颅骨成骨细胞的迁移：将培养后的颅骨成骨细胞接种于Transwell小室上层，下层加入骨髓间充质干细胞细胞外囊泡，进行迁移培养；
(3)颅骨成骨细胞的成骨分化：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨成骨细胞中，进行成骨诱导。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg；
步骤(2)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg；
步骤(3)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg。
在本发明的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡在治疗颅骨缺损中的应用，包括以下步骤：
(1)将预冷的聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡混匀，得到混合物；
(2)利用注射器将步骤(1)获得的混合物注射到大鼠颅骨缺损区以治疗颅骨缺损。
在本发明的一个实施方式中，所述聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，置于冰上进行操作。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次采用体积分数为1％的O2浓度的低氧培养箱培养骨髓间充质干细胞，证明骨髓间充质干细胞能够耐受低氧。在不影响细胞活性的同时还可以促进细胞分泌囊泡，获得的低氧囊泡治疗效果更好。这个方法简单且实用，极大提高了细胞外囊泡的产量和质量，克服了以往细胞外囊泡产量低、质量不稳定的问题。而且细胞外囊泡来源广泛，易于储存，通过低氧处理有望加速其临床应用转化的进程。
本发明采用聚氨基酸温敏水凝胶负载低氧细胞外囊泡，具有温度敏感性高、可注射和填补不规则缺损的特征。临床上的骨缺损常为不规则缺损，移植物来源受限且难以自愈。本发明设计的低氧细胞外囊泡结合水凝胶应用于大鼠颅骨缺损治疗，取得了非常好的效果；可以推广至其它应用领域，加速无细胞治疗技术的临床转化。
附图说明
图1为大鼠骨髓间充质干细胞培养图。
图2为骨髓间充质干细胞表面标记物流式鉴定图。
图3为低氧条件下骨髓间充质干细胞生长图。
图4为常氧和低氧细胞外囊泡纳米颗粒跟踪分析图。
图5为常氧和低氧细胞外囊泡颗粒数统计图。
图6为常氧和低氧细胞外囊泡蛋白量统计图。
图7为常氧和低氧细胞外囊泡透射电镜扫描图。
图8为细胞外囊泡Western blot鉴定表面标记物的结果图。
图9为低氧细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞增殖的细胞染色图。
图10为低氧细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞迁移的结果图。
图11为低氧细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞分化的结果图。
图12为聚氨基酸温敏水凝胶缓释细胞外囊泡的结果图。
图13为聚氨基酸温敏水凝胶负载低氧细胞外囊泡治疗颅骨缺损的结果图。
具体实施方式
本发明提供一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，包括以下步骤：
(1)骨髓间充质干细胞的低氧处理：将骨髓间充质干细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中进行培养，得到成熟的骨髓间充质干细胞，后处理后将成熟的骨髓间充质干细胞置于含无外泌体血清的细胞培养基，进行低氧培养；
(2)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液的获取：收集步骤(1)中低氧培养后的上清液，离心弃沉淀以去除残留的细胞和细胞碎片，得到骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液；
(3)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取：将步骤(2)得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液离心弃沉淀以去除杂质蛋白；进一步离心弃上清获得粗细胞外囊泡；将粗细胞外囊泡用PBS重悬，离心弃上清获得纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述骨髓间充质干细胞为扩增到P3～P5代的骨髓间充质干细胞。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基；
含无外泌体血清的细胞培养基为含2％无外泌体血清的细胞培养基。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，低氧处理过程中置于体积分数为1％的O2培养箱中，培养温度为37℃，培养时间为48h。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，将纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡用PBS重悬后于-80℃下保存。
本发明提供一种通过上述方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
本发明提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入预冷的聚氨基酸温敏水凝胶中，混匀得到负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
在本发明的一个实施方式中，聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
本发明提供一种通过上述方法制备得到的负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
本发明提供一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶在制备治疗颅骨缺损药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡促进颅骨成骨细胞增殖、迁移和成骨分化，包括以下步骤：
(1)颅骨成骨细胞的增殖：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨成骨细胞中，进行增殖培养；
(2)颅骨成骨细胞的迁移：将培养后的颅骨成骨细胞接种于Transwell小室上层，下层加入骨髓间充质干细胞细胞外囊泡，进行迁移培养；
(3)颅骨成骨细胞的成骨分化：将骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入培养的颅骨成骨细胞中，进行成骨诱导。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg；
步骤(2)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg；
步骤(3)中，培养后的颅骨成骨细胞与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为5×104个：2.5μg-10μg。
在本发明的一个实施方式中，骨髓间充质干细胞细胞外囊泡在治疗颅骨缺损中的应用，包括以下步骤：
(1)将预冷的聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡混匀，得到混合物；
(2)利用注射器将步骤(1)获得的混合物注射到大鼠颅骨缺损区以治疗颅骨缺损。
在本发明的一个实施方式中，所述聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，置于冰上进行操作。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂；所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
实施例1
本实施例公开了本发明的骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定的方法，具体为：
1.骨髓间充质干细胞的分离、培养
1)提前配置50mL含1％双抗的PBS缓冲液，50mL含10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％双抗的α-MEM细胞培养基待用；
2)选取6周龄(200g左右)的雄性SD大鼠处死，在75％酒精中浸泡10min，解剖分离股骨和胫骨，保留两端骨骺；
3)刮掉骨头表面的软组织和血块，将步骤2)收集的股骨和胫骨浸泡在预冷且含1％双抗的PBS缓冲液中；
4)在超净工作台中冲洗股骨和胫骨10次，冲洗时骨头垂直夹住，从上往下冲洗。然后剪开两端的骨骺，用5mL注射器吸取细胞培养基插入骨髓腔上端冲洗，冲出的液体收集到培养皿中，反复冲洗至流出液体为透明即可；
5)冲洗流出的骨髓经过200目的滤网过滤，1000g转速离心5min，弃上清，细胞培养基重悬沉淀后接种至10cm培养皿，补充细胞培养基至10mL，小心存放于37℃，5％CO2培养箱；
6)两天后更换新鲜培养基，待细胞汇合至80％～90％时用PBS清洗3次，加入1mL的0.25％胰酶消化约1min。待细胞变圆后加入1mL完全培养基终止消化，吹打分散细胞，转移入15mL离心管中。以1000g的转速离心3min，去除上清液，加入细胞培养基，按1：3传代，每隔3天更换一次培养基；
2.骨髓间充质干细胞表面标记物的鉴定
1)将汇合至80％～90％的细胞用0.25％胰酶消化，以1000g的转速离心3min，去除上清，加入1mL PBS重悬，吹打混匀，制备单细胞悬液，浓度为1x106个/mL；
2)将其分装于4个1.5mL的EP管中，每管浓度为1x105个/mL；
3)分别在EP管中加入5uL的CD45、CD29和CD90抗体，空白对照组不加入抗体，吹打混匀，4℃避光孵育30min；
4)以1000g的转速离心3min，加入含2％FBS的PBS缓冲液洗涤，再次离心后去除上清液；
5)加入500μL PBS缓冲液，吹打混匀，上机检测。
结果发现，骨髓间充质干细胞在3天后开始贴壁，逐渐向周围生长，细胞呈长梭形(图1)，其余杂细胞经过传代后逐渐死亡。该细胞生长速度快，按照1：3的接种比例，每隔3天需要传代一次。流式细胞术结果显示细胞高表达CD29(99.30％)和CD90(95.25％)，几乎不表达CD45(0.11％)，符合间充质干细胞的鉴定标准(图2)。
实施例2
本实施例公开了低氧处理骨髓间充质干细胞的最佳条件及细胞外囊泡提取方法。具体步骤如下：
1.低氧处理骨髓间充质干细胞的最佳条件
1)选取P3～P5代骨髓间充质干细胞，以5x105个的密度接种到10cm培养皿中，加入10mL含10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％双抗的α-MEM细胞培养基，在常氧(5％CO2和21％O2)培养箱中培养24h；
2)弃去上清液，使用PBS清洗2次，加入6mL含2％无外泌体血清的培养基，在低氧(5％CO2和1％O2)培养箱中继续培养48h；
3)收集上清液，以300g的转速离心10min，去除残留的细胞，再次以2000g的转速离心10min，去除残留的死细胞和细胞碎片。获得的上清液为骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液，提取液可在-80℃条件下保存；
2.细胞外囊泡的提取方法
1)将上述获得的低氧处理细胞的上清液以10000g的转速离心30min，去除杂质蛋白，获得的上清液转移到超速离心管中(Beckman)，以100000g的转速离心70min；
2)去除离心上清，沉淀为细胞外囊泡，加入10mL预冷的PBS重悬沉淀，吹打混匀后经0.22μm滤器过滤除菌；
3)再次以100000g的转速离心70min，获得的沉淀为细胞外囊泡颗粒；
4)去除上清液，加入50μL预冷的PBS重悬囊泡，可在-80℃条件下保存；
结果发现：骨髓间充质干细胞在低氧条件下生长良好，与常氧组细胞相比，形态未发生明显变化，增殖活性未受影响(图3)。说明骨髓间充质干细胞能耐受低氧环境，可作为常规细胞培养的条件，用于收集上清液。
实施例3
本实施例公开了细胞外囊泡表面标记物鉴定及颗粒分析方法，具体步骤如下：
1.通过纳米流式分析细胞外囊泡的粒径分布及数量
1)将分离获得的细胞外囊泡使用PBS稀释，分别为1：100、1：500和1：1000；
2)将稀释后的囊泡转移到200μL的低黏附EP管中，按照纳米流式仪器程序上机检测，获得纳米颗粒的浓度和粒径分布图。
结果如图4显示，低氧组颗粒和常氧组颗粒大小接近，粒径主要为90nm左右。经过对同等体积上清液提取的囊泡颗粒数进行分析，发现低氧组囊泡颗粒数显著高于常氧组，P＜0.05(图5)。另外BCA蛋白定量结果显示，低氧组囊泡蛋白浓度高于常氧组，P＜0.05(图6)，以上结果说明低氧的确能促进骨髓间充质干细胞分泌细胞外囊泡。
2.透射电子显微镜观察细胞外囊泡的形态
1)将常氧和低氧细胞外囊泡使用俄酸染色3min，滴加到铜网上，静置；
2)待细胞外囊泡干燥后于显微镜下观察，拍照。
结果如图7所示，两组颗粒形态均为典型的茶杯托状，粒径主要在30～180nm之间，与文献里报道的细胞外囊泡形态相似。
3.蛋白质印记法(Western blot)检测细胞外囊泡表面的标记物
1)取细胞外囊泡悬液与4x SDS loading buffer按照4：1的比例混合，使得细胞外囊泡蛋白的终浓度为1μg/μL，调整常氧组和低氧组囊泡总蛋白浓度一致。
2)SDS-PAGE胶电泳，选择10％浓度的预制胶，加入1x电泳液，拔出梳子，吹孔。每个泳道加入30μg蛋白，右侧加入蛋白Marker，其余空的孔道加入平衡液；
3)电泳条件为100V恒压，电泳60min；
4)转膜：裁剪大小适宜的PVDF膜(0.45μm)，经甲醛活化15s，浸泡在转膜液中。去除电泳夹板中的胶，切去多余的部分，在转膜夹上依次放海绵、3张滤纸、胶、PVDF膜、3张滤纸、海绵，夹紧转膜夹，放入转膜槽中，倒入预冷的转膜液，放冰袋，按照电压300V，电流300mA条件转膜80min；
5)一抗孵育：取出PVDF膜，放在抗体孵育盒中，加入10mL 5％脱脂奶粉封闭，摇床上封闭45min。TBST洗膜，加入一抗后放于4℃摇床上过夜；
6)二抗孵育和显影：TBST洗膜3次，每次15min，加入二抗，室温孵育1小时。TBST洗膜3次，每次5min，加入显影液，上机显影，采集照片；
检测结果如图8所示，常氧和低氧细胞外囊泡表面标记蛋白CD63、CD9、CD81、Alix表达阳性，Calnexin表达阴性，而细胞裂解液的表达则相反，说明细胞外囊泡提取成功。
实施例4
不同浓度的低氧细胞外囊泡对颅骨成骨细胞增殖活性的影响
1)将来源于新生大鼠的颅骨成骨细胞接种于24孔板，每孔5x104个细胞，加入500μL细胞培养基，放于37℃，5％CO2培养箱中24h。
2)去除细胞培养基，加入提取的低氧细胞外囊泡，终浓度为5μg/mL和20μg/mL，空白对照组仅加入细胞培养基。
3)在培养3d后去除培养基，PBS清洗3次，按照试剂商说明书加入细胞染色液，放于37℃孵育20min；
4)去除染色液，加入含2％FBS的PBS液冲洗3次，倒置显微镜下观察，拍照。结果如图9所示，三组细胞均生长良好，形态为典型的梭形。其中，加入低氧囊泡组细胞数量多于空白对照组，结果表明低氧细胞外囊泡能促进成骨细胞增殖。
实施例5
不同浓度的低氧细胞外囊泡对颅骨成骨细胞迁移的影响
1)将颅骨成骨细胞接种于Transwell小室上层(8μm孔径)，每孔5x104个细胞，培养小室下层加入600μL细胞培养基，同时将不同浓度(5μg/mL和20μg/mL)的低氧细胞外囊泡加入下层，放于37℃，5％CO2培养箱中24h；
2)取出培养小室上层，用棉签擦掉上层未迁移的细胞，PBS清洗3次，放于4％的PFA固定15min；
3)去除固定液后PBS清洗3次，加入结晶紫染色液染色5min，PBS清洗3次，晾干后显微镜下观察迁移的细胞个数；
结果显示，低氧细胞外囊泡能促进成骨细胞迁移，其中，加入20μg/mL低氧囊泡组促迁移作用最好(图10)。
实施例6
不同浓度的低氧细胞外囊泡对颅骨成骨细胞成骨分化及矿化的影响
1)将颅骨成骨细胞接种于12孔板，每孔1x105个细胞，加入1mL培养基，放于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
2)去除上清液，更换为含2％无外泌体血清的成骨诱导液，同时加入不同浓度(5μg/mL和20μg/mL)的低氧细胞外囊泡，每三天更换一次成骨诱导液及补充细胞外囊泡；
3)分别在成骨诱导7d和21d后检测碱性磷酸酶表达和矿化结节；
结果如图11所示，低氧组细胞外囊泡明显促进了细胞碱性磷酸酶表达和矿化结节形成，且20μg/mL组促成骨分化和矿化作用最强。
实施例7
聚氨基酸温敏水凝胶缓释细胞外囊泡的结果
将200μL聚氨基酸水凝胶液体与100μg低氧细胞外囊泡混合放入24孔板中，于37℃静置2min，待凝胶成胶后加入200μL预热的PBS，放于培养箱中，分别在固定时间点吸取200μL上清液，同时补充等量新鲜PBS。使用BCA试剂盒测量上清液中释放出来的囊泡蛋白浓度，计算累积释放量；
结果如图12所示，聚氨基酸水凝胶缓慢释放出囊泡，其中前8天内释放速度较快，且释放时间超过了21d。说明聚氨基酸水凝胶能够持续缓释细胞外囊泡，适合应用于修复期较长的模型。
实施例8
聚氨基酸温敏水凝胶负载低氧细胞外囊泡对大鼠颅骨缺损的治疗作用
1)大鼠颅骨缺损模型构建
选取6周龄的SD大鼠，所有动物实验均得到复旦大学实验动物科学部伦理委员会的批准，适应性饲养一周后再进行实验操作；
2)2％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，碘伏消毒后制备直径为5mm的全层颅骨缺损，止血；
3)配置含20μg/mL细胞外囊泡的水凝胶悬液，注射到颅骨缺损区，缝合；
4)术后12周，取材拍摄MicroCT，进行颅骨三维重建后分析骨修复情况。
结果如图13所示，空白对照组缺损区几乎没有新生骨形成，单纯注射水凝胶组缺损边缘有少量新生骨形成。水凝胶负载细胞外囊泡组均观察到大量的新生骨，其中负载低氧囊泡组修复效果最好。以上结果说明低氧细胞外囊泡对骨缺损的修复效果最佳。证明了低氧处理有益于获得更多、治疗质量更高的细胞外囊泡，为目前细胞外囊泡研究领域的难点提供了解决方案，有助于无细胞治疗领域的发展。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)骨髓间充质干细胞的低氧处理：将骨髓间充质干细胞置于含胎牛血清的细胞培养基中进行培养，得到成熟的骨髓间充质干细胞，后处理后将成熟的骨髓间充质干细胞置于含无外泌体血清的细胞培养基，进行低氧培养；
(2)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液的获取：收集步骤(1)中低氧培养后的上清液，离心弃沉淀以去除残留的细胞和细胞碎片，得到骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液；
(3)骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取：将步骤(2)得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的提取液离心弃沉淀以去除杂质蛋白；进一步离心弃上清获得粗细胞外囊泡；将粗细胞外囊泡用PBS重悬，离心弃上清获得纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述骨髓间充质干细胞为扩增到P3～P5代的骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，含胎牛血清的细胞培养基为含10％胎牛血清的细胞培养基；
含无外泌体血清的细胞培养基为含2％无外泌体血清的细胞培养基。
4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(1)中，低氧处理过程中置于体积分数为1％的O2培养箱中，培养温度为37℃，培养时间为48h。
5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的获取方法，其特征在于，步骤(3)中，将纯骨髓间充质干细胞细胞外囊泡用PBS重悬后于-80℃下保存。
6.一种通过权利要求1-5任一所述的方法制备得到的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡。
7.一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求6所述的骨髓间充质干细胞细胞外囊泡加入预冷的聚氨基酸温敏水凝胶中，混匀得到负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
8.根据权利要求7所述的一种负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，聚氨基酸温敏水凝胶与骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的用量比为1mL：20μg。
9.一种通过权利要求7或8任一所述方法制备得到的负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶。
10.一种如权利要求9所述的负载骨髓间充质干细胞细胞外囊泡的聚氨基酸温敏水凝胶在制备治疗颅骨缺损药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211156916.7A CN115404209A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211156916.7A CN115404209A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115404209A true CN115404209A (zh) | 2022-11-29 |
Family
ID=84166878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211156916.7A Pending CN115404209A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115404209A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116769725A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 苏州大学附属第二医院 | 一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111603441A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-09-01 | 瑞希(重庆)生物科技有限公司 | 一种两亲性聚氨基酸共聚物/泊洛沙姆温敏凝胶及其制备方法 |
| US20200376037A1 (en) * | 2018-02-12 | 2020-12-03 | Soochow University | Stem cell preparation resisting hypoxia injury, preparation method therefor, and use thereof in preparation of medicament for treating acute myocardial infarction |
| CN114939128A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 尧舜泽生物医药(南京)有限公司 | 骨髓间充质干细胞外泌体在修复关节软骨缺损中的应用 |
-
2022
- 2022-09-21 CN CN202211156916.7A patent/CN115404209A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200376037A1 (en) * | 2018-02-12 | 2020-12-03 | Soochow University | Stem cell preparation resisting hypoxia injury, preparation method therefor, and use thereof in preparation of medicament for treating acute myocardial infarction |
| CN111603441A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-09-01 | 瑞希(重庆)生物科技有限公司 | 一种两亲性聚氨基酸共聚物/泊洛沙姆温敏凝胶及其制备方法 |
| CN114939128A (zh) * | 2022-06-02 | 2022-08-26 | 尧舜泽生物医药(南京)有限公司 | 骨髓间充质干细胞外泌体在修复关节软骨缺损中的应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| SHUN-PEI HUNG ET AL: "Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potentials of human mesenchymal stem cells", 《J ORTHOP RES》, vol. 30, no. 2, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 1 * |
| SHUN-PEI HUNG ET AL: "Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potentials of human mesenchymal stem cells", 《J ORTHOP RES》, vol. 30, no. 2, pages 1 * |
| 干细胞者说: "聚焦行业发展：对干细胞低氧培养的总结和反思", 《健康界》, 2 June 2021 (2021-06-02), pages 2 * |
| 干细胞者说: "聚焦行业发展：对干细胞低氧培养的总结和反思", 《健康界》, pages 2 * |
| 张殿亮: "温度敏感聚氨基酸水凝胶的制备与抗肿瘤应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 January 2019 (2019-01-15) * |
| 陈亭;周燕;张治萍;谭文松;: "间充质干细胞在低氧环境下的增殖、代谢与成骨分化:胎盘羊膜及骨髓来源间充质干细胞的对比", 中国组织工程研究与临床康复, no. 06 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116769725A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-19 | 苏州大学附属第二医院 | 一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020103192A1 (zh) | 外泌体的提取方法 | |
| WO2019161591A1 (zh) | 间充质干细胞的分离培养方法及冻存、复苏方法 | |
| CN112280734A (zh) | 一种外泌体的制备方法及含有外泌体的干细胞增殖试剂 | |
| CN104958320A (zh) | 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 | |
| CN110478528B (zh) | 一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用 | |
| JP2009523438A (ja) | 細胞の富化 | |
| CN108685948B (zh) | 一种医用细胞修复剂的制备方法 | |
| CN112206356A (zh) | 一种可注射型含人脐带间充质干细胞外泌体骨修复水凝胶及其制备方法 | |
| CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN115404209A (zh) | 一种骨髓间充质干细胞细胞外囊泡及其获取与应用 | |
| CN110613737A (zh) | 一种子宫内膜干细胞制剂的制备方法及其应用 | |
| CN108486039B (zh) | 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法 | |
| CN112755052A (zh) | 人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的应用 | |
| CN106606512B (zh) | 一种用于治疗心肌梗死的混合细胞制剂及制备方法与应用 | |
| CN112011508A (zh) | 一种小鼠骨髓树突状细胞诱导纯化方法 | |
| CN115399312A (zh) | 间充质干细胞上清液中外泌体常温保存保护剂的制备方法 | |
| KR101719743B1 (ko) | 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법 | |
| JP2004129549A (ja) | 脂肪由来細胞群からの間葉系幹細胞の選択的増殖方法 | |
| CN110951685A (zh) | 一种应用于间充质干细胞成骨分化的单核细胞源外泌体制剂 | |
| CN115478048A (zh) | 培养脂肪间充质干细胞制备外泌体 | |
| RU2545993C2 (ru) | Способ восстановления костных дефектов трубчатых костей критической величины | |
| US20240091407A1 (en) | Cartilage tissue engineering complex and use thereof | |
| CN111172106B (zh) | 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法 | |
| RU2570034C1 (ru) | Способ наращивания объема костной ткани в зонах дефекта альвеолярного отростка челюсти |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |