CN111172106B

CN111172106B - 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法

Info

Publication number: CN111172106B
Application number: CN202010056742.1A
Authority: CN
Inventors: 夏黎明; 王亮; 万阳
Original assignee: Guangzhou Jnumeso Biotechnology Inc; Guangzhou Yiyang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Jnumeso Biotechnology Inc; Guangzhou Yiyang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-16
Filing date: 2020-01-16
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2040-01-16
Also published as: CN111172106A

Abstract

本发明提供了一种从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法。该方法可有效缩短间充质干细胞原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次间充质干细胞原代培养，操作简便，实用性强，因此本发明在间充质干细胞原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。在此基础上，发明人还提供了一种纯化间充质干细胞的培养方法，可将细胞纯度提高到99％。本发明还公开了一种提取间充质干细胞分泌物的方法，建立了相关的质量控制与评价实验，使得间充质干细胞分泌物能有效地在化妆品、保健品等行业进行应用。本发明不仅适用于人和小鼠等间充质干细胞培养，同时也适用于骨髓或脂肪来源的干细胞、癌旁组织等细胞培养。

Description

一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法

技术领域

本发明涉及干细胞及其分泌物提取技术，特别是一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法。

背景技术

干细胞，是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞及组织，具有免疫调节、再生修复等生物学功能。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，在体内或体外特定的诱导条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉及神经细胞等，且具有促进组织修复、免疫调节和支持造血的功能，免疫原性低，所以MSCs是再生医学和免疫调节治疗最具应用前景的组织工程种子细胞。干细胞分泌物，是干细胞经过特殊培养后分泌出的多种活性物质，包括蛋白质、细胞因子、多肽等等，在抗衰老、美容、细胞修复等方面具有功效。

间充质干细胞相对于其他干细胞，其来源广泛，目前已经从骨髓、脂肪、肌肉、心脏、脐带血、脐带、胎盘等组织中相应找到。

目前，间充质干细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块贴壁法。不同分离方法获得的间充质干细胞的纯度不等，这极大地影响了治疗效果的稳定性，且MSCs的不同亚群在疾病治疗方面有着不同的作用。

本发明提供了一种从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法。该方法在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良：采用少量多次加液方式，使小组织也能达到优良的贴壁效果；同时使用自主研发的间充质干细胞选择性选择性完全培养基，使间充质干细胞原代细胞快速爬出生长，且纯度在95％以上；在此基础上，发明人还提供了一种纯化间充质干细胞的培养方法，可将细胞纯度提高到99％。同时，本发明公开了一种提取间充质干细胞分泌物的方法，设计了一系列相关的质量控制与评价实验，使得间充质干细胞分泌物能有效地在化妆品、保健品等行业进行应用。本发明提供的方法可有效缩短间充质干细胞原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次间充质干细胞原代培养，操作简便，实用性强，因此本发明在间充质干细胞原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。本发明不仅适用于人和小鼠等间充质干细胞原代细胞培养，同时也适用于骨髓来源干细胞、脂肪来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。

发明内容

为了解决现有技术中存在的种种缺陷，本发明在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良，旨在提供一种从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，在保证细胞活率高的同时，有效提高贴壁率，缩短获得稳定高纯度细胞所需要的原代培养时间。具体地，本发明提供了以下技术方案，以实现上述目的：

第一方面，本发明提供了一种从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，包括以下步骤：

步骤(1)：胎盘或脐带收集：

1.1根据评判标准：符合是健康产妇(病毒检测结果阴性、遗传病检查项目阴性等)，足月婴儿，剖腹产等条件的胎盘或脐带方能收集)进行筛选，根据样本收集标准进行胎盘或脐带收集操作；

1.2将胎盘或脐带装入无菌容器中，无菌容器内保存液(含庆大霉素的生理盐水)必须浸没过胎盘或脐带，密封容器并在4℃条件下8小时内运送回洁净实验室。

步骤(2)、原代细胞处理：

2.1胎盘处理：

2.1.1超净工作台内打开装有新鲜胎盘的无菌容器，使用已高压灭菌的手术剪去掉胎盘外膜，取内部暗红的组织块，使用生理盐水(需添加肝素钠，500ml生理盐水加入2支肝素钠，12500IU/支)洗净组织中的血液，最后使用不含肝素钠的生理盐水再清洗一遍。使用手术剪将组织块剪碎(越碎越好)，收集到装有生理盐水(不含肝素)的50ml离心管中，1200rpm，10min离心；

2.1.2离心后，吸弃上清液，按1∶1混合胰酶-EDTA和IV型胶原酶，加入30ml到离心管中与组织块混匀，于37℃恒温水浴摇床中消化1-1.5h；

2.1.3消化完毕后，添加3-5倍生理盐水稀释，反复振荡均匀，然后使用电动移液枪吸取过100μm孔径细胞筛网以形成单细胞悬液；

2.1.3单细胞悬液经1600rpm、10min离心后去上清，选择性完全培养基重悬，制成细胞密度为5-8×10⁴个细胞/ml的原代胎盘间充质干细胞悬液，接种于相应数量的6孔板中，置于5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养；

2.2脐带处理：

2.2.1将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2cm/段；

2.2.2用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液；

2.2.3将脐带组织切成3.0～5.0mm³小块，用不含肝素的生理盐水清洗干净，尽量控干水。

2.2.4加一滴选择性培养基润湿上述组织小块，在37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养0.5-1h。然后，补加选择性培养基至没过皮肤组织块，置于5％CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养；

2.2.5每24h加入1ml选择性完全培养基，至72h全量换液为止，之后每周换液2次，直至获得原代脐带间充质干细胞。

步骤(3)、细胞培养与鉴定：

3.1细胞传代培养：

3.1.1待细胞汇合度达85％～95％时，即进行消化传代；

3.1.2传代至P3～P5进行换液，换成分泌培养基进行培养，待细胞汇合度达85％～95％时收集分泌液，细胞做冻存和鉴定处理；

3.2.细胞鉴定与检测：

3.2.1通过流式细胞仪进行细胞细胞表面标记物鉴定：

人间充质干细胞应具有CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面标记表达呈阳性，而CD14、CD34、CD45及T或B淋巴细胞等表面标记表达均为阴性；

3.2.2无菌检测：换液培养操作完成后，每瓶细胞培养瓶取少量液体汇集至离心管中，混匀后进行无菌检测实验且留样，3-5天后可观察得结果。

步骤(4)、超滤浓缩：

4.1将上述3.1.2中收集的分泌液通过超滤系统进行浓缩，一般浓缩倍数在10-20倍之间，再过滤除菌得到间充质干细胞分泌液备用，后续可做冻干等相应处理；

4.2对上述浓缩后的干细胞分泌液进行质控，包含但不仅限于外观、生物学活性的测定、生物芯片法检测细胞因子含量、PH值、水分含量测定等。

优选地，在上述从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法中，步骤(1)至(4)中所述的选择性完全培养基组成分为，包含不仅限于青霉素-链霉素溶液、促干细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的干细胞选择性选择性完全培养基。

优选地，在上述从胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法中，步骤(2)：胎盘处理尽可能把胎盘外膜处理干净，胎盘组织尽可能取血管密集部位的组织，尽可能剪碎便于消化完全；脐带处理务必把脐带外皮、脐带内3条血管剔除干净，脐带组织块尽可能剪成小块，以便于单个细胞快速分离。提前使用选择性完全培养基润湿组织块，在37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养0.5-1h。然后，缓慢补加选择性完全培养基至没过皮肤组织块，注意不要在补液的时候吹起组织块，使得组织块不能贴壁培养。值得说明的是，刚加一滴培养液润湿组织块后，立马放到培养箱静置的0.5-1h，期间必须静置；换而言之，在此期间切忌移动培养皿以免影响细胞的贴壁。

第二方面，本发明提供了一种纯化间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

a.根据权利要求1～5中所述的一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法制得间充质干细胞原代细胞；

b.待步骤a中制得的间充质干细胞原代细胞的汇合度达到85％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，PBS洗涤原代细胞，PBS弃去。用质量百分比浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶-EDTA液进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；加入新鲜选择性完全培养基停止消化，把细胞悬液吸出，得到间充质干细胞；

c.离心，弃上清，用选择性完全培养基重悬细胞并接种到新培养皿/瓶培养，细胞汇合度达85％～95％时得到更高纯度的间充质干细胞。

优选地，在上述一种纯化间充质干细胞的培养方法，步骤(b)至(c)中所述的选择性完全培养基组成为，含促干细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的细胞培养基。

优选地，在上述一种纯化间充质干细胞的培养方法，步骤a-c中包括：使用自主研发的间充质干细胞选择性完全培养基可以提高细胞生长速度，增加细胞生长的竞争优势，并且抑制杂细胞生长，从而获得纯度更高的间充质干细胞。

具体实施方式

[实施例1]

步骤(1)：选取小鼠脱臼处死，体积分数75％乙醇浸泡5min。将后肢皮毛剥除，用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨，剔除骨头表面肌肉，PBS溶液冲洗两遍；

步骤(2)：从中间剪断股骨和胫骨，暴露骨髓腔，将装有PBS溶液的1ml注射器反复冲洗，200目滤器过滤后收集单细胞悬液到15ml离心管内；

步骤(3)：1300rpm，5min离心收集骨髓细胞，用选择性完全培养基重悬细胞，混匀后接种于10cm培养皿中，放入37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

步骤(4)：三天更换一次新鲜的选择性完全培养基，继续培养，直至获得小鼠骨髓间充质干细胞原代细胞；

步骤(5)：待步骤(4)中制得的原代细胞的汇合度达到85％～95％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤原代细胞，把PBS弃去，用质量百分比浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶液-EDTA进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；接着加入选择性完全培养基终止消化，把细胞悬液吸出，得到小鼠骨髓间充质干细胞；离心，弃上清，用新鲜的选择性完全培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养。

在本案例中，第3天开始出现梭形贴壁细胞，并于培养后的第10天细胞汇合度达85％～95％。P0细胞的纯度达到95％，P3细胞的纯度达到99％。

[实施例2]

步骤(1)：从广东省广州市三甲医院妇产科获得足月、剖腹产、健康母体(母体经HIV、HBV、HCV等病毒检测结果阴性、地中海贫血等遗传病检查项目阴性)来源的脐带，将脐带装入无菌容器中，密封容器并在4℃条件下立即运送回洁净实验室进行处理；

步骤(2)：将脐带从无菌容器中取出放置于一次性平皿中，使用手术剪将脐带剪成约2cm/段，用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液。

步骤(3)：将脐带组织切成3.0～5.0mm³小块，用不含肝素的生理盐水清洗干净；

步骤(4)：加一滴选择性培养基润湿上述组织小块，在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养0.5-1h。最后，补加选择性培养基至没过皮肤组织块，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中培养。

步骤(5)：第一天、第二天各加入1ml选择性完全培养基，第三天全量换液，之后每3-4天进行一次换液，第九天能看到原代脐带间充质干细胞从组织块爬出；

步骤(6)：待步骤(5)中制得的原代细胞的汇合度达到85％～95％后，进行传代培养：先把培养液上清去掉，用PBS洗涤原代细胞，把PBS弃去，用质量百分比浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶液-EDTA进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；接着加入选择性完全培养基终止消化，把细胞悬液吸出，得到人脐带来源的间充质干细胞；离心，弃上清，用新鲜的选择性完全培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养；

在本案例中，组织块于第九天开始爬出间充质干细胞，并于培养后的第12天细胞汇合度达85％～95％。P0细胞的纯度达到95％，P3细胞的纯度达到99％。

[实施例3]

步骤(1)：[实施例2]中，脐带间充质干细胞培养至P4时，换分泌培养基进行培养，待细胞汇合度达85％～95％时收集得到500ml左右分泌液，细胞消化冻存和鉴定处理；

步骤(2)：分泌液采用截留分子量3KD的膜包进行超滤浓缩，0.22μm滤器过滤，得到50ml左右的间充质干细胞分泌液，对其做外观、PH值、总蛋白含量检测；

步骤(3)：细胞冻存，计算细胞数量及活率，部分细胞悬液进行流式细胞仪检测CD14、CD34、CD45、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105八个表面标志物，细胞成骨、成脂诱导分化及鉴定，细胞上清液做无菌检测；

在本案例中，间充质干细胞分泌液肉眼观察为无色澄清透明的液体，使用精密PH计测得分泌液PH值在6.6～7.6之间，BCA法检测总蛋白含量可达200mg以上；P4脐带间充质干细胞培养数量可达1.5×10⁸以上，细胞活率达99％以上，细胞表面标志物CD14、CD34、CD45三个阴性表面标志物阳性率均在1％以下，CD29、CD44、CD73、CD90、CD105五个阳性表面标志物阳性率均达99％以上；茜素红和油红O染色均呈阳性反应，证实细胞具有在诱导条件下可以向成骨、成脂细胞分化的特性，无菌检测结果：血平板无菌落生长、硫乙醇和胰酪大豆胨液体培养基结果均为阴性。

上述实施例均为本发明较佳的实施方式，但本例发明不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的原理下所做的改变、替代、简化等，均应为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将胎盘或脐带装入无菌容器中，无菌容器内保存液必须浸没过胎盘或脐带，密封容器并在4℃条件下8小时内运送回实验室；

步骤(2)：胎盘处理：使用已高压灭菌的手术剪去掉胎盘外膜，取内部暗红的组织块，使用含肝素钠的生理盐水洗净组织中的血液，最后使用生理盐水再清洗一遍；脐带处理：使用已高压灭菌的手术剪将脐带剪成约2cm/段，用含肝素钠的生理盐水洗净血液，纵向剪破脐带，去除3条血管及外皮，洗净内部的血液，将脐带组织切成3.0~5.0mm³小块，生理盐水洗净；

步骤(3)：胎盘组织处理：胎盘组织使用混合酶消化法于37℃恒温水浴摇床中消化1-1.5h，消化完毕后，稀释过滤离心，选择性完全培养基重悬接种于相应数量的6孔板或一次性平皿中，放置培养箱中培养；脐带组织处理：加一滴选择性完全培养基润湿组织块，在37℃、5％CO ₂的培养箱中静置培养0.5-1h，然后，补加选择性完全培养基至没过组织块，放置培养箱中培养，所述混合酶为胰酶-EDTA和IV型胶原酶1∶1混合使用；

步骤(4)：待细胞汇合度达85％～95％时，即进行消化传代，传代至P3~P5更换为分泌培养基进行培养，待细胞汇合度达85％～95％时收集分泌液，细胞做冻存和鉴定处理；

步骤(5)：通过流式细胞仪进行细胞表面标记物鉴定；冻存前取少量细胞上清液进行无菌检测；

步骤(6)：将上述分泌液通过超滤系统进行浓缩，再过滤除菌得到间充质干细胞分泌原液备用，后续可做冻干处理得到间充质干细胞分泌物冻干粉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)至(6)中所述的胎盘或脐带符合是健康产妇，足月婴儿，剖腹产等条件的胎盘或脐带方能收集使用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)至(6)中所述的组织块培养方法同时适用骨髓来源干细胞、脂肪来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)所述的含肝素钠的生理盐水为500ml生理盐水加入2支肝素钠，12500IU/支；

步骤(3)所述的稀释过滤离心，稀释为添加3-5倍生理盐水稀释，过滤为100μm孔径筛

过滤，离心为1600rpm、10min离心后去上清；

步骤(3)-（4）所述的培养均是置于5%CO₂、37℃、饱和湿度的培养箱中培养；

步骤(5)所述的细胞表面标记物鉴定应具有CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等表面标记表达呈阳性，而CD14、CD34、CD45及T或B淋巴细胞等表面标记表达均为阴性；

步骤(5)所述的无菌检测至少应做硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、血平板等接种培养检测；

步骤(6)所述的浓缩为采用截留分子量3KD的膜包进行超滤浓缩；

步骤(6)所述的过滤除菌为使用0.22μm的滤器进行过滤；

步骤(6)所述的分泌原液优先选择浓缩至步骤(4)得到的分泌液体积的1/10~1/15。

5.由权利要求1所述方法制备得到的间充质干细胞分泌物冻干粉在制备化妆品、保健品中应用。