CN111826343A - 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用 - Google Patents

一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111826343A
CN111826343A CN202010715295.6A CN202010715295A CN111826343A CN 111826343 A CN111826343 A CN 111826343A CN 202010715295 A CN202010715295 A CN 202010715295A CN 111826343 A CN111826343 A CN 111826343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell culture
culture solution
enhancing
platelet
cartilage differentiation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010715295.6A
Other languages
English (en)
Inventor
修冰水
李帅民
宋娅莉
史秀珍
刘世红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Zhongwei Medical Zheng Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Zhongwei Medical Zheng Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Zhongwei Medical Zheng Technology Co ltd filed Critical Beijing Zhongwei Medical Zheng Technology Co ltd
Priority to CN202010715295.6A priority Critical patent/CN111826343A/zh
Publication of CN111826343A publication Critical patent/CN111826343A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3852—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用。采用临床废弃的胎盘血进行血小板裂解物的提取和制备，来源广泛，且成本低廉。本发明获得的间充质干细胞可稳定贴壁生长，同常规培养方法得到的细胞特征相似，显微镜下细胞为典型的梭形漩涡状；相比常规方法培养能有效激活细胞体内软骨分化标记基因SOX9、COL2A1的表达，体外诱导后成软骨的数量和强度具有明显提高，表现出更强的成软骨细胞分化能力。

Description

一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用
技术领域
本发明属于软骨组织工程技术领域，涉及一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用。
背景技术
软骨损伤是造成骨关节炎和关节功能障碍的重要原因。关节软骨缺损修复一直以来都是骨科学研究的难点和热点，传统的关节软骨保护性治疗方法治疗效果差异较大，长期满意度较低；对于严重的软骨损伤造成的功能障碍只能通过手术关节置换解决，费用高、疼感重，部分患者需要再次置换。
近年来软骨组织工程学的发展为人们提供了软骨缺损修复的更多思路。其中，脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSCs)，作为软骨组织工程的种子细胞应用于软骨缺损修复有着广阔的前景。研究发现脐带间充质干细胞具有成软骨功能，能在体内微环境作用下主动迁移至受损部位进行软骨修复，促进退变软骨细胞的恢复和新生软骨细胞的生成，且可分泌多种生物活性分子，具有调节免疫和抗炎作用，目前国内外已有治疗骨关节炎的间充质干细胞(MSCs)产品的研制和临床应用。
上述研究通常采用的是常规的培养技术，即以收获一定数量的干细胞为主要目的，在培养过程中缺少对其成软骨功能的诱导和增强，必然使上述干细胞产品在特异性针对软骨修复能力方面功能较差。
发明内容
针对现有技术中诱导间充质干细胞转化软骨细胞存在诱导率低，功能差等缺陷，本发明提供了一种能够获得更高成软骨分化的EC-MSC(Enhenced chondrogenesis MSC，EC-MSC)细胞培养液产品、方法及应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，包括硫酸氨基葡萄糖和甘油磷酸钠，所述的硫酸氨基葡萄糖在细胞培养液中的质量浓度为0.5～1.5％，所述的甘油磷酸钠在细胞培养液中的浓度为0.5～1μM。
本发明提供的细胞培养液添加了两种软骨诱导剂，一种是硫酸氨基葡萄糖，该物质是关节软骨中氨基葡萄糖和透明质酸的基本物质，能促进软骨修复；另一种是甘油磷酸钠，通过磷的参与骨质的形成，并增加软骨的形成率和钙化率。本发明将两者共同使用，通过两种不同的机制协同增效，能够加强干细胞软骨特需物质的合成能力，更有效的促进间充质干细胞向成软骨细胞分化。
优选地，所述细胞培养液中还包括青霉素/链霉素双抗，所述的青霉素/链霉素双抗在细胞培养液中的浓度为100U/mL。
优选地，所述细胞培养液中还包括胎盘血富血小板裂解物血浆PBPL，所述的PBPL在细胞培养液中的体积浓度为5～10％。
更优选地，所述的PBPL通过以下方法制备：
(1)取100～200mL胎盘血至采血袋中，2000～5000UI的肝素钠作为抗凝剂，吸取胎盘血分装至50ml无菌离心管中，1500～2500rpm，4～30℃离心10～15min，收集上清。
(2)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，1200～2000rpm，10～15min离心后，弃上层3/4上清液及底层红细胞，剩下中间层在旋涡振荡器上轻振荡使混匀，即为胎盘血富血小板血浆。
(3)将上一步骤收集的富血小板血浆采用三次冻融法制备血小板裂解物。
(4)将上一步骤收集的血小板裂解物8000～12000rpm，4～30℃离心20～30min，弃去沉淀，上清液即为胎盘血富血小板裂解物血浆(PBPL)。
优选地，步骤(3)中，三次冻融法又包括将富血小板血浆置于-80℃/37℃反复冻融三次，每次间隔10～15分钟。
本发明建立的PBPL血小板裂解物中富含细胞生长和存活所必需的各种细胞因子和生长因子，如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、CSF、GM-CSF、IL-6、IL-3、促巨核细胞生成素、EPO等，具有刺激细胞生长、增殖，血管生成，组织再生和胶原合成的作用，对受损的骨组织和软骨组织具有修复和再生的作用。
优选地，所述的细胞培养液中采用的基础培养基包括DMEM培养基或IMDM培养基。
本发明还提供了增强诱导软骨细胞分化的间充质干细胞的技术方法，包括：加入成软骨诱导培养基后，置于37℃，含体积分数为5％CO2和饱和湿度的孵箱内培养，成软骨诱导分化培养基：DMEM/F12培养基中添加100μM地塞米松，10％(v/v)FBS，1μM抗坏血酸+甘油磷酸钠(1.5μM)。
具体为，对人脐带间充质干细胞传代培养至第4代后，以(1.0～2.0)×107L-1接种于24孔板内，待细胞融合率达到80％左右，弃去培养液及未贴壁细胞，PBS清洗细胞1次，用移液枪吸取残余的PBS液后，加入成软骨诱导培养基2ml，每三～四天换液1次。
本发明建立了一种无动物血清、无异体蛋白的间充质干细胞培养体系，采用通常作为废弃物的胎盘血中提取的血小板裂解物代替胎牛血清进行细胞的培养。来源广泛，且成本低廉。
本发明又提供了上述细胞培养液在间充质干细胞制备中的应用。
本发明的有益效果如下：
为了避免常规UC-MSCs培养体系中胎牛血清可能带来的过敏和动物源性疾病风险。本发明建立了一种无动物血清的间充质干细胞培养体系，采用了通常作为废弃物的胎盘血中提取的血小板裂解物代替胎牛血清进行细胞的培养。
血小板裂解物富含细胞生长和存活所必需的各种细胞因子和生长因子，如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、CSF、GM-CSF、IL-6、IL-3、促巨核细胞生成素、EPO等，具有刺激细胞生长、增殖，血管生成，组织再生，和胶原合成的作用，对于受损的软组织和软骨组织同样具有修复和再生的作用。但常规血小板裂解物依赖于健康人群献血来源，数量有限，成本昂贵。本发明采用临床废弃的胎盘血进行血小板裂解物的提取和制备，来源广泛，且成本低廉。
本发明获得的间充质干细胞可稳定贴壁生长，同常规培养方法得到的细胞特征相似，显微镜下细胞为典型的梭形漩涡状；相比常规方法培养能有效激活细胞体内软骨分化标记基因SOX9、COL2A1的表达，体外诱导后成软骨的数量和强度具有明显提高，表现出更强的成软骨细胞分化能力。
附图说明
图1为本发明获得的间充质干细胞的倒置显微镜下图片。
图2为阿利新蓝染色实验结果图，A.EC-MSC诱导分化培养组，B.常规诱导分化培养对照组。
图3为成软诱导分化过程中SOX9、COL2A1相对表达量示意图，A.SOX9，B.COL2A1；1.常规诱导分化培养对照组，2.EC-MSC诱导分化培养组。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
一、胎盘血血小板裂解物血浆(PBPL)的制备
1.取200mL胎盘血至采血袋中，2000UI的肝素钠作为抗凝剂。吸取胎盘血分装至50ml无菌离心管中。2000rpm，4℃离心10～15min。收集上清。
2.将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，1500rpm，10min离心后，弃上层3/4上清液及底层红细胞，剩下中间层在旋涡振荡器上轻振荡使混匀，即为胎盘血富血小板血浆。
3.将上一步骤收集的富血小板血浆采用三次冻融法制备血小板裂解液。即将富血小板血浆置于-80℃/37℃反复冻融三次，每次间隔10～15分钟。
4.将上一步骤收集的血浆裂解物10000rpm，4℃离心20min，弃去沉淀，上清液即为胎盘血富血小板裂解物血浆(PBPL)。
二、脐带来源间充质干细胞的分离和原代细胞的培养
无菌条件下，取新生儿脐带10～20cm，脐带组织采集自足月剖宫产的健康产妇，采集之前与产妇及其家属均签署知情同意书，方案经医院医学伦理会批准。
1.用含青霉素/链霉素双抗(浓度为100U/mL)的生理盐水漂洗脐带2次，去除残留血液。剪成小段，剔除血管和外膜，生理盐水洗净，将中间沃顿胶(Wharton jelly，WJ)分离出来，无菌条件下剪碎成0.2～2.0mm3大小的组织块，剪碎的组织块均匀平铺于T75无菌培养瓶中。放置于二氧化碳培养箱内培养，培养箱内温度为37℃，CO2浓度为5％。进行原代细胞的爬出。
2. 5d后首次全量换液，采用EC-MSC培养基(常规培养基为对照)，弃去未贴壁细胞，每3～4d换液一次。待细胞游出后，细胞达到70～90％融合后，将细胞培养液收集，1200rpm离心后，吸取上清液备用。培养瓶中的细胞用生理盐水冲洗两次，用0.25％胰蛋白酶37℃消化2～4min，待细胞变圆并逐步脱离培养瓶底部后，将上述备用细胞培养上清液倒入消化的培养瓶中，终止胰酶反应；用移液管轻轻吹打消化后的脐带间充质干细胞并收集至50ml无菌离心管中，1200rpm离心5min，弃去上清，重悬底部细胞，即为原代人脐带间充质干细胞。
常规培养基的配制：DMEM/F12培养基加入胎牛血清(FBS)(体积浓度为10％)、青霉素/链霉素双抗(浓度为100U/mL)。
EC-MSC培养基的配制：DMEM/F12培养基中加入上述提取的PBPL(体积浓度为10％)、青霉素/链霉素双抗(浓度为100U/mL)、甘油磷酸钠(0.75μM)、硫酸氨基葡萄糖(1.0％)。
三、细胞传代培养
将获得的原代细胞置于新的培养液中进行传代培养，待细胞长至70％～90％融合时，用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；按照1:3～1:4的比例传代培养(本实施例中按照1:4的比例)，并使用同样方法重复进行第二代到第三代传代人脐带间充质干细胞的培养。培养温度为37℃，环境空气为5％CO2。镜下观察细胞形态呈梭形，旋涡状贴壁生长，符合间充质干细胞的细胞学特性，如图1所示。
四、成软骨诱导试验及阿利新蓝染色
1.人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导：对人脐带间充质干细胞传代培养至第4代后，以(1.0～2.0)×107L-1(本实施例中按照1.0×107L-1)接种于24孔板内。待细胞融合率达到80％左右，弃去培养液及未贴壁细胞，PBS清洗细胞1次，用移液枪吸取残余的PBS液后，加入成软骨诱导培养基2ml，每三～四天换液1次。
成软骨诱导分化培养基：DMEM/F12培养基中添加100μM地塞米松，10％(v/v)FBS，1μM抗坏血酸+甘油磷酸钠(1.5μM)，置于37℃，含体积分数为5％CO2和饱和湿度的孵箱内培养。
2.诱导3周后按试剂盒操作说明进行阿利新蓝染色。
(1)准备阿利新蓝染色液试剂盒Alcian酸化工作液(Alcian酸化液：蒸馏水＝1:2的比例配制)；
(2)吸去成软骨定向诱导分化培养液，加入PBS清洗2～3遍，4％多聚甲醛固定10分钟；
(3)吸去多聚甲醛，加入PBS清洗3遍；
(4)2mL Alcian染色液浸染30分钟，PBS清洗3遍；
(5)Alcian酸化工作液1.5mL快速清洗一遍，PBS清洗3遍；
(6)用滤纸吸干多余的Alcian酸化工作液，PBS清洗3遍；
(7)用放大40倍的倒置显微镜观察记录染色结果，与常规对照组(B)相比，经EC-MSC诱导分化培养基培养的间充质干细胞经诱导染色后染色成深蓝色，显著高于常规对照组。如图2所示。
五、实时荧光定量PCR检测COL2A1、SOX9 mRNA表达
SOX9和COL2A1与软骨组织的形成关系密切，是软骨表达标志基因。
成软骨诱导后总RNA的提取和定量PCR分析：
1.成软骨诱导培养21d后，根据TRIZOL试剂盒说明书提取细胞的总RNA，微量分光光度仪测定RNA的浓度和纯度，各RNA样本(A260/A280)均在1.7-2.1。
2.以Oligo dT为引物，根据反转录试剂盒说明书将RNA逆转录生成cDNA。
3.实时荧光定量PCR进行软骨标志基因COL2A1、SOX9 mRNA的表达水平的检测。以GAPDH为内参，引物序列见表1。
表1.软骨标志基因引物序列
Figure BDA0002597957140000061
实时荧光定量-PCR反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，35个循环；90℃15s；60℃1min。
4.重复3次实验，取平均值。实验数据以均数±标准差
Figure BDA0002597957140000062
表示，GAPDH作为管家基因，组间差异比较用t检验。
结果表明，用EC－MSC诱导分化培养基培养的细胞SOX9 mRNA表达量明显高于常规培养对照组(P<0.05)；用EC-MSC的细胞COL2A1 mRNA表达量明显高于常规培养对照组(P<0.05)，如图3所示。

Claims (7)

1.一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，包括硫酸氨基葡萄糖和甘油磷酸钠，所述的硫酸氨基葡萄糖在细胞培养液中的质量浓度为0.5～1.5％，所述的甘油磷酸钠在细胞培养液中的浓度为0.5～1μM。
2.根据权利要求1所述的一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中还包括青霉素/链霉素双抗，所述的青霉素/链霉素双抗在细胞培养液中的浓度为100U/mL。
3.根据权利要求1所述的一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，其特征在于，所述细胞培养液中还包括胎盘血富血小板裂解物血浆PBPL，所述的PBPL在细胞培养液中的体积浓度为5～10％。
4.根据权利要求3所述的一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，其特征在于，所述的PBPL通过以下方法制备：
(1)取100～200mL胎盘血至采血袋中，2000～5000UI的肝素钠作为抗凝剂，吸取胎盘血分装至50ml无菌离心管中，1500～2500rpm，4～30℃离心10～15min，收集上清；
(2)将上一步骤收集的上清转移至新的50ml离心管中，1200～2000rpm，10～15min离心后，弃上层3/4上清液及底层红细胞，剩下中间层在旋涡振荡器上轻振荡使混匀，即为胎盘血富血小板血浆；
(3)将上一步骤收集的富血小板血浆采用三次冻融法制备血小板裂解物；
(4)将上一步骤收集的血小板裂解物8000～12000rpm，4～30℃离心20～30min，弃去沉淀，上清液即为胎盘血富血小板裂解物血浆PBPL。
5.根据权利要求1所述的一种增强诱导软骨分化的细胞培养液，其特征在于，所述的细胞培养液中采用的基础培养基包括DMEM培养基或IMDM培养基。
6.一种增强诱导软骨细胞分化的间充质干细胞的方法，其特征在于，加入成软骨诱导培养基后，置于37℃，含体积分数为5％CO2和饱和湿度的孵箱内培养，所述成软骨诱导分化培养基为：DMEM/F12培养基中添加100μM地塞米松，10％v/vFBS，1μM抗坏血酸+甘油磷酸钠1.5μM。
7.权利要求1-5任意一项所述的一种增强诱导软骨分化的细胞培养液在间充质干细胞制备中的应用。
CN202010715295.6A 2020-07-23 2020-07-23 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用 Pending CN111826343A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010715295.6A CN111826343A (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010715295.6A CN111826343A (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111826343A true CN111826343A (zh) 2020-10-27

Family

ID=72924956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010715295.6A Pending CN111826343A (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111826343A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112370573A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种软骨膜片及其制备方法
CN113509594A (zh) * 2021-05-28 2021-10-19 四川大学 诱导msc细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用
CN114574436A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法

Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020119952A1 (en) * 1998-09-09 2002-08-29 Petrus Edward J. Composition and method of treating arthritis
US20040162269A1 (en) * 1998-09-09 2004-08-19 Petrus Edward J. Composition and method of treating arthritis
CN101215314A (zh) * 2007-12-27 2008-07-09 黄晓东 Ii型软骨胶原的制备方法
CN101343294A (zh) * 2008-08-20 2009-01-14 厦门蓝湾科技有限公司 一种硫酸氨基葡萄糖的制备方法
CN101531688A (zh) * 2009-04-18 2009-09-16 厦门蓝湾科技有限公司 一种硫酸氨基葡萄糖钙盐及其制备方法
CN102000110A (zh) * 2009-09-02 2011-04-06 北京赛而生物药业有限公司 一种用于预防或治疗骨和关节疾病的组合物及其制备方法
CN102925408A (zh) * 2012-10-31 2013-02-13 川北医学院第二临床医学院 诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法
CN103352026A (zh) * 2013-07-24 2013-10-16 黑龙江天晴干细胞有限公司 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法
US20130337080A1 (en) * 2011-01-10 2013-12-19 Esm Technologies, Llc Dietary Supplements For Promotion of Growth, Repair and Maintenance of Bone and Joints
WO2014078579A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 International Stem Cell Corporation Differentiation of human fibroblast cells
CN104988117A (zh) * 2015-07-03 2015-10-21 深圳中基恒润投资有限公司 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN105524878A (zh) * 2016-01-21 2016-04-27 深圳市第二人民医院 一种人脐带间质干细胞分离并诱导为软骨细胞的培养方法
CN105693822A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 王宏田 一种促进软骨组织修复的多肽、多肽衍生物
CN105687239A (zh) * 2016-01-22 2016-06-22 苏州佰通生物科技有限公司 一种脂肪干细胞组合物及其制备方法
CN105866431A (zh) * 2016-05-11 2016-08-17 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 用于鉴定脂肪间充质干细胞的试剂盒
CN106282104A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法
CN106350483A (zh) * 2016-10-14 2017-01-25 中卫华医（北京）生物科技有限公司 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN106367386A (zh) * 2016-10-14 2017-02-01 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法
CN106635968A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
CN108531448A (zh) * 2018-03-06 2018-09-14 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法
CN108865986A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 马琳 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN109456939A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 北京太东生物科技有限公司 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基
CN109675108A (zh) * 2019-02-18 2019-04-26 上海交通大学医学院附属第九人民医院 利用脂肪组织和支架材料直接再生肥大软骨组织的方法
CN109825469A (zh) * 2019-03-09 2019-05-31 和携科技(北京)有限公司 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN110292038A (zh) * 2018-03-23 2019-10-01 北京世纪劲得生物技术有限公司 间充质干细胞的冷冻保护液及其制备方法
CN111088224A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 广东唯泰生物科技有限公司 促进脐带间充质干细胞向成软骨定向分化的方法
CN112107731A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 武汉理工大学 一种可注射双层载药骨软骨修复水凝胶支架及其制备方法
CN112680408A (zh) * 2019-10-18 2021-04-20 东莞市恩联干细胞生物科技研究院 一种诱导人间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法
WO2021145436A1 (ja) * 2020-01-17 2021-07-22 Ｋａｒｙｄｏ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉＸ株式会社 目的とする既知の薬剤又はその等価物質の新たな適応症の予測方法、予測装置、及び予測プログラム
CN113249317A (zh) * 2021-06-17 2021-08-13 北京国卫生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的分离培养扩增方法及系统

Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020119952A1 (en) * 1998-09-09 2002-08-29 Petrus Edward J. Composition and method of treating arthritis
US20040162269A1 (en) * 1998-09-09 2004-08-19 Petrus Edward J. Composition and method of treating arthritis
CN101215314A (zh) * 2007-12-27 2008-07-09 黄晓东 Ii型软骨胶原的制备方法
CN101343294A (zh) * 2008-08-20 2009-01-14 厦门蓝湾科技有限公司 一种硫酸氨基葡萄糖的制备方法
CN101531688A (zh) * 2009-04-18 2009-09-16 厦门蓝湾科技有限公司 一种硫酸氨基葡萄糖钙盐及其制备方法
CN102000110A (zh) * 2009-09-02 2011-04-06 北京赛而生物药业有限公司 一种用于预防或治疗骨和关节疾病的组合物及其制备方法
US20130337080A1 (en) * 2011-01-10 2013-12-19 Esm Technologies, Llc Dietary Supplements For Promotion of Growth, Repair and Maintenance of Bone and Joints
CN102925408A (zh) * 2012-10-31 2013-02-13 川北医学院第二临床医学院 诱导的多潜能干细胞分化为软骨细胞的方法
WO2014078579A1 (en) * 2012-11-15 2014-05-22 International Stem Cell Corporation Differentiation of human fibroblast cells
CN104781392A (zh) * 2012-11-15 2015-07-15 国际干细胞公司 人成纤维细胞的分化
US20150299660A1 (en) * 2012-11-15 2015-10-22 International Stem Cell Corporation Differentiation of human fibroblast cells
CN103352026A (zh) * 2013-07-24 2013-10-16 黑龙江天晴干细胞有限公司 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法
CN104988117A (zh) * 2015-07-03 2015-10-21 深圳中基恒润投资有限公司 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN105524878A (zh) * 2016-01-21 2016-04-27 深圳市第二人民医院 一种人脐带间质干细胞分离并诱导为软骨细胞的培养方法
CN105687239A (zh) * 2016-01-22 2016-06-22 苏州佰通生物科技有限公司 一种脂肪干细胞组合物及其制备方法
CN105693822A (zh) * 2016-03-21 2016-06-22 王宏田 一种促进软骨组织修复的多肽、多肽衍生物
CN105866431A (zh) * 2016-05-11 2016-08-17 天津普瑞赛尔生物科技有限公司 用于鉴定脂肪间充质干细胞的试剂盒
CN106282104A (zh) * 2016-07-29 2017-01-04 中卫华医（北京）生物科技有限公司 从脐带组织中高效获取间充质干细胞的方法
CN106350483A (zh) * 2016-10-14 2017-01-25 中卫华医（北京）生物科技有限公司 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN106367386A (zh) * 2016-10-14 2017-02-01 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带间充质干细胞因子冻干粉的制备方法
CN106635968A (zh) * 2016-10-14 2017-05-10 中卫华医（北京）生物科技有限公司 人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
CN108531448A (zh) * 2018-03-06 2018-09-14 安徽瑞杰赛尔生物科技有限公司 一种人间充质干细胞成软骨诱导分化培养基及制备方法
CN110292038A (zh) * 2018-03-23 2019-10-01 北京世纪劲得生物技术有限公司 间充质干细胞的冷冻保护液及其制备方法
CN108865986A (zh) * 2018-06-29 2018-11-23 马琳 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN109456939A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 北京太东生物科技有限公司 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化的培养方法，以及该方法所用的培养基
CN109675108A (zh) * 2019-02-18 2019-04-26 上海交通大学医学院附属第九人民医院 利用脂肪组织和支架材料直接再生肥大软骨组织的方法
CN109825469A (zh) * 2019-03-09 2019-05-31 和携科技(北京)有限公司 一种促进人源脐带间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导方法
CN112680408A (zh) * 2019-10-18 2021-04-20 东莞市恩联干细胞生物科技研究院 一种诱导人间充质干细胞成软骨分化培养基及其制备方法
CN111088224A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 广东唯泰生物科技有限公司 促进脐带间充质干细胞向成软骨定向分化的方法
WO2021145436A1 (ja) * 2020-01-17 2021-07-22 Ｋａｒｙｄｏ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉＸ株式会社 目的とする既知の薬剤又はその等価物質の新たな適応症の予測方法、予測装置、及び予測プログラム
CN112107731A (zh) * 2020-09-24 2020-12-22 武汉理工大学 一种可注射双层载药骨软骨修复水凝胶支架及其制备方法
CN113249317A (zh) * 2021-06-17 2021-08-13 北京国卫生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的分离培养扩增方法及系统

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YOUNG WOO EOM 等: "Rapid Isolation of Adipose Tissue-Derived Stem Cells by the Storage of Lipoaspirates", 《YONSEI MED J》 *
刘瑾春 等: "体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展", 《中国修复重建外科杂志》 *
刘瑾春: "诱导骨髓间充质干细胞软骨定向分化的关键因子筛选 及体外诱导方案优化", 《中国优秀博士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
孙亚如 等: "培养体系对维持人脐带间充质干细胞特性及其体外扩增效率的影响", 《中国组织工程研究》 *
孙立胜 等: "硫酸氨基葡萄糖对ATDC5 细胞分化和细胞外基质基因表达的影响", 《江苏医药》 *
王慧建: "负载TGF-β、BMP-2缓释微球的DBM诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）》 *
王群芳: "氨基葡萄糖功能化水凝胶的构建及介导BMSCs成软骨分化的研究", 《中国优秀博士学位论文全文数据库（电子期刊）工程科技I辑》 *
魏晴 等主编: "《现代临床输血指南》", 31 May 2019, 华中科技大学出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112370573A (zh) * 2020-11-04 2021-02-19 陕西佰傲干细胞再生医学有限公司 一种软骨膜片及其制备方法
CN112370573B (zh) * 2020-11-04 2023-06-23 山东佰傲干细胞生物技术有限公司 一种软骨膜片及其制备方法
CN113509594A (zh) * 2021-05-28 2021-10-19 四川大学 诱导msc细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用
CN113509594B (zh) * 2021-05-28 2022-05-10 四川大学 诱导msc细胞向软骨方向分化的仿生材料、制备方法及应用
CN114574436A (zh) * 2022-05-06 2022-06-03 深圳汉盛汇融再生医学科技有限公司 一种治疗膝关节退行性病变的干细胞制剂及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111826343A (zh) 一种增强诱导软骨分化的细胞培养液、方法及应用
CN104958320A (zh) 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法
CN111849882A (zh) 间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
CN110050780B (zh) 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用
CN108865986B (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN108685948B (zh) 一种医用细胞修复剂的制备方法
CN104099294A (zh) 基于干细胞分泌因子的培养基及其制备和使用方法
CN110898078B (zh) 一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用
CN108588017B (zh) 一种脐带间充质干细胞的扩增方法及其在关节炎上的应用
CN114874982B (zh) 一种增强脐带间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的培养方法
Chen et al. Effect of suction pressures on cell yield and functionality of the adipose-derived stromal vascular fraction
CN111840646B (zh) 一种胸部脂肪填充用干细胞组合物及其应用
JP6890549B2 (ja) 間葉系幹細胞の製造方法
CN112262211A (zh) 一种诱导或改善间充质干细胞的创伤愈合性质的方法
CN104707140A (zh) 治疗骨关节炎的组合物
CN103223194A (zh) 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法
CN104673748A (zh) 一种从人脐带中提取间充质干细胞的方法
CN113943699B (zh) 对抗高糖损伤的脐带间充质干细胞诱导液、方法及应用
CN111346051A (zh) 一种用于治疗脑梗死的脐带间充质干细胞注射液制备方法
CN110935010A (zh) 一种干细胞制剂和生长因子组合物及其制备方法和应用
CN111202751A (zh) 间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用
CN109652368B (zh) 从脐带组织中获取原代间充质干细胞的方法
CN106978395B (zh) 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN116474000B (zh) 脐带间充质干细胞制剂、制备方法及其在治疗膝骨关节炎中的应用
CN107142243A (zh) 一种增强人脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination