CN111202751A - 间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用 - Google Patents

间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用 Download PDF

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盛剑秋
任芳丽
王银银
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Abstract

本发明公开了间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用。本发明保护间充质干细胞或其细胞制剂在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。所述细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备脐带间充质干细胞，得到细胞制剂，制备过程中采用低血清培养基。本发明提供的细胞制剂适用于类风湿性关节炎及其相关疾病的细胞治疗。所述类风湿性关节炎相关疾病的并发症及发病机理相似的疾病包括类风湿性血管炎、肺炎、骨关节炎、类风湿性心脏病、强直性脊柱炎、痛风、眼病、肾病、泌尿系统感染、柯兴氏综合征、口腔溃疡等。本发明对于类风湿性关节炎及其相关疾病的治疗具有重大的应用价值。

Description

间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用
技术领域
本发明涉及间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用，具体涉及人脐带沃顿区间充质干细胞制剂在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节的滑膜炎和关节软骨侵蚀破坏为主要特征的全身性自身免疫性疾病，在全球范围内的发病率约为1％，我国的抽样调查结果约为0.8％；其主要的病理表现有免疫功能异常、关节滑膜增生、关节软骨及骨组织被破坏三个方面。关节的病变主要表现为炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成、软骨和滑膜的损伤等；血管翳从关节软骨边缘处的滑膜逐渐向软骨面伸延，最终覆盖在关节软骨面上，从而阻断软骨细胞与滑膜液的接触，进而影响了软骨组织接收营养；另外，滑膜的过度增生、反复发作，可引发剧烈的炎症反应，导致关节软骨和骨组织被破坏、关节功能障碍，严重者终致病人残废。
随着分子生物学、免疫病理学、基因工程技术等技术的发展，RA的病因及发病机理的研究随之深入。到目前为止，RA的具体发病机理至今仍无定论；遗传因素、免疫细胞、细胞因子等可能在RA的发病过程中起重要作用。由于RA的发病机制并不十分明确，因此尚无根治之法。目前，治疗还是以延缓病情发展、减轻发病程度，以提高患者的生活质量为主。在治疗RA的方法中，以药物治疗为最常用手段，目前，用于治疗RA的药物主要分为改善症状类抗风湿药、改善病情类抗风湿药、糖皮质激素及植物药等。此外还有基因治疗和外科手术等方法。
发明内容
本发明的目的是提供间充质干细胞或细胞制剂的新用途。
本发明首先保护间充质干细胞在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
上述应用中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。所述以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用低血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。所述传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。
本发明还保护细胞制剂在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
上述应用中，所述细胞制剂的制备方法包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备得到脐带间充质干细胞，制备过程中采用低血清培养基。
所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。
所述原代脐带间充质干细胞的制备方法依次包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养脐带沃顿区组织块，直至有细胞爬出；
(2)采用低血清培养基培养细胞；
(3)收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞。
所述传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。所述传代的方法具体可为：将脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养细胞，收集细胞，胰酶消化，收集细胞。
进一步的，所述细胞制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；
(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用低血清培养基培养细胞至80％汇合度；
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P1代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述P2代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为所述细胞制剂。
以上任一所述细胞制剂为CD126阳性的细胞制剂，CD126的阳性率在95％以上，优选为99％以上。以上任一所述细胞制剂为CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上的细胞制剂，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率优选在95％以上，进一步优选在99％以上。以上任一所述细胞制剂的CD31和CD34的阳性率低于10％，优选低于7％。以上任一所述细胞制剂的CD45和HLA-DR阳性率均低于5％，优选低于3％，进一步优选低于1％。CD126、CD29、CD44、CD90和CD105均为鉴定间充质干细胞常用的表面标志物，CD126、CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率高说明细胞制剂是间充质干细胞且其纯度很高。CD31是内皮祖细胞的标志物、CD45是白细胞的标志物和CD34是造血干细胞的标志物，CD31、CD45以及CD34的三个指标的阳性率低，说明细胞制剂纯度很高。HLA-DR是移植排斥相关的标志物，HLA-DR阳性率低说明细胞制剂应用时不容易发生移植排斥。
本发明还保护一种用于治疗类风湿性关节炎的药物。
本发明保护的用于治疗类风湿性关节炎的药物的活性成分为间充质干细胞或上述细胞制剂。
上述药物中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用低血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代3-5代的脐带间充质干细胞。
以上任一所述低血清培养基为含3-5％(体积百分比)血清的细胞培养基。
以上任一所述低血清培养基的组成如下：人上皮生长因子10ng/mL、人碱性成纤维生长因子10ng/mL、重组人胰岛素样生长因子5μg/mL、血小板衍生因子10ng/mL、肝素5μg/mL、氢化可的松1μg/mL、抗坏血酸10μg/mL、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L、胎牛血清4％(体积百分比)、青霉素50U/mL、链霉素50μg/mL，余量为DMEM高糖培养基。
非必需氨基酸溶液中含有Glycine 10mM、L-Alanine 10mM、L-Asparagine 10mM、L-Aspartic acid 10mM、L-Glutamic Acid 10mM、L-Proline 10mM、L-Serine 10mM。
本发明中采用低血清培养基来进行培养。在间充质干细胞培养方面，通常使用10％(体积百分数)的胎牛血清，有的血清浓度高达20％(体积百分比)。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、碳水化合物、生长因子、激素等。血清成分复杂，每批血清之间都有差别，不能保证其成分一致。另外，虽然血清内含有很多利于细胞生长的成分，但不可避免的含有一些对细胞有伤害的成分，如补体、抗体、内毒素等。因此，高浓度血清培养出的细胞不适合于临床应用，会增加了临床过敏的风险。本发明的发明人发现，血清浓度为3-5％(体积百分比)的低血清培养基对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。
免疫治疗常用的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。与常用的骨髓间充质干细胞(MSCs)相比，脐带沃顿区间充质干细胞具有来源丰富、对供体无影响、易于采集和运输、致癌性可能性小、病毒污染概率低、免疫源性弱、无社会、伦理和法律方面争议等诸多优点。更重要的是从脐带沃顿区分离的间充质干细胞含量高、增殖能力高于骨髓MSCs，免疫原性低于骨髓MSCs。
细胞治疗是通过直接影响患者的免疫系统，从细胞和体液免疫的角度，调节患者的免疫平衡，从而达到治疗类风湿性关节炎的目的。本发明提供的细胞制剂，适用于类风湿性关节炎及其相关疾病的细胞治疗。所述类风湿性关节炎的相关疾病包括类风湿性关节炎的并发症及发病机理相似的疾病，如类风湿性血管炎、肺炎、骨关节炎、类风湿性心脏病、强直性脊柱炎、痛风、眼病、肾病、泌尿系统感染、柯兴氏综合征、口腔溃疡等。
本发明对于类风湿性关节炎及其相关疾病的治疗具有重大的应用价值。
附图说明
图1为间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105和CD126)的结果。
图2为造血干细胞及内皮细胞标志物(CD31、CD45和CD34)的结果。
图3为移植排斥相关的标志物(HLA-DR)的结果。
图4为关节炎小鼠表型观察的结果。
图5为小鼠关节病理检测的结果。
图6为小鼠血清炎症因子IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所使用的各试剂的配方或来源：
低血清培养基：人上皮生长因子10ng/mL、人碱性成纤维生长因子10ng/mL、重组人胰岛素样生长因子5μg/mL、血小板衍生因子10ng/mL、肝素5μg/mL、氢化可的松1μg/mL、抗坏血酸10μg/mL、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L、胎牛血清4％(体积百分比)、青霉素50U/mL、链霉素50μg/mL，余量为DMEM高糖培养基。
人上皮生长因子(hEGF)：GenScript公司，产品全称为EGF Recombinant HumanProtein，货号为Z00333。
人碱性成纤维生长因子(b-FGF)：GenScript公司，货号为Z03116。
重组人胰岛素样生长因子(IGF)：GenScript公司，货号为Z03017。
血小板衍生因子(PDGF)：GenScript公司，货号为Z02529。
鸡II型胶原蛋白：Chondrex公司，货号为20012。
弗氏完全佐剂：Chondrex公司，货号为7001。
弗氏不完全佐剂：Chondrex公司，货号为7002。
肝素：迈晨公司。
氢化可的松：迈晨公司。
抗坏血酸：迈晨公司。
青霉素：GIBCO公司。
链霉素：GIBCO公司。
非必需氨基酸溶液为GibcoTM MEM Non-Essential Amino Acids Solution，(100X)，货号为11140050。网址如下：https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.165.html。该产品中具有七种氨基酸，组成如下：Glycine 10.0mM、L-Alanine 10.0mM、L-Asparagine 10.0mM、L-Aspartic acid10.0mM、L-Glutamic Acid 10.0mM、L-Proline 10.0mM、L-Serine 10.0mM。
DBA/1J小鼠：北京维通利华有限公司。
实施例1、脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备
一、胎儿脐带的获取
取足月、无先天性疾病的新生儿的离体脐带；该产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意。
二、脐带沃顿区间充质细胞的获取
1、脐带的预处理
在无菌实验台内，将脐带用生理盐水反复冲洗，洗去残余血液。用无菌手术器械将脐带剪成2-3cm的小段，将脐带纵向剖开，去除脐动脉、脐静脉和羊膜，取沃顿区，剪成0.5-1mm3左右的小块。
2、原代脐带间充质细胞的获得
采用组织块培养法获得原代脐带间充质细胞，具体步骤如下：
(1)将步骤1得到的沃顿区组织块均匀的铺在直径为10cm的无菌培养皿内，覆盖60-70％皿底面积，倒置放入37℃培养箱15min；翻转培养皿，轻轻加入10mL低血清培养基，在37℃，5％CO2的培养箱内培养7-10天，此时组织块下均匀爬出细胞。
(2)完成步骤(1)后，取培养皿，用PBS缓冲液清洗2次，弃除组织块(此时细胞已贴壁生长)，每皿加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞，又称P0代脐带间充质细胞。
3、P3代脐带间充质细胞的获得
(1)将步骤2获得的P0代脐带间充质细胞平均分到两个直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(2)完成步骤(1)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞。
(3)完成步骤(2)后，将P1代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(4)完成步骤(3)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞。
(5)完成步骤(4)后，将P2代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(6)完成步骤(5)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P3代脐带间充质细胞(又称P3细胞制剂)。
实施例2、P3细胞制剂的鉴定
供试品为实施例1制备的P3细胞制剂。
用流式细胞术检测供试品中CD29、CD44、CD90、CD105、CD126、CD31、CD45、CD34及HLA-DR的表达，具体步骤如下：将细胞(供试品)分别与相应抗体共同孵育后，洗去多余的抗体，用PBS缓冲液重悬细胞，利用BD公司的LSR Fortessa仪器检测各指标的阳性率。
间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105和CD126)的检测结果见图1。造血干细胞标志物(CD31、CD45和CD34)的检测结果见图2。移植排斥相关的标志物(HLA-DR)的检测结果见图3。结果表明，供试品高表达间充质干细胞的标志物(阳性率均在97％以上)，低表达造血干细胞及内皮细胞标志物(阳性率均低5％)，基本不表达移植排斥相关的标志物(阳性率为0.1％)。
实施例3、P3细胞制剂对类风湿性关节炎的治疗效果
一、制备模型和给药
供试小鼠：6-8周，DBA/1J小鼠，进行适应饲养一周(清洁级动物饲养房，自由摄取食水)。采用鸡II型胶原蛋白及弗氏佐剂对小鼠进行致敏诱导关节炎模型。根据是否给药及给药的不同分为如下各组：
正常对照组(5只)：用0.1mL生理盐水对每只小鼠尾根部进行皮下注射。3周后，用0.1mL生理盐水对每只小鼠尾根部进行皮下注射。从第二次注射当天开始，每周尾静脉注射一次生理盐水(每只每次注射100μL)。
细胞治疗组(8只)：用0.1mL乳化好的抗原佐剂混悬液(将浓度为2mg/mL的鸡II型胶原蛋白溶液与弗氏完全佐剂等体积混合得到的)对每只小鼠尾根部进行皮下注射(第一次免疫)。3周后，用0.1mL乳化好的抗原佐剂混悬液(将浓度为2mg/mL的鸡II型胶原蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混匀得到的)对每只小鼠尾根部进行皮下注射(第二次免疫)。从第二次免疫当天开始，每周尾静脉注射一次实施例1制备的P3细胞制剂(每只每次注射2×106个细胞，体积为100μL)。
模型组(8只)：用0.1mL乳化好的抗原佐剂混悬液(将浓度为2mg/mL的鸡II型胶原蛋白溶液与弗氏完全佐剂等体积混匀得到的)对每只小鼠尾根部进行皮下注射(第一次免疫)。3周后，用0.1mL乳化好的抗原佐剂混悬液(将浓度为2mg/mL的鸡II型胶原蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混匀得到的)对每只小鼠尾根部进行皮下注射(第二次免疫)。从第二次免疫当天开始，每周尾静脉注射一次生理盐水(每只每次注射100μL)。
从第一次免疫当天开始算起，42天后，处死小鼠，收集样本。
二、表型观察
试验第42天，对各组小鼠的脚爪进行拍照，评估小鼠爪子的肿胀情况。
结果见图4(A为正常对照组，B为模型组，C为细胞治疗组)。与模型组相比，细胞治疗组小鼠的爪子肿胀情况显著减轻，即细胞制剂对于类风湿性关节炎具有显著的治疗作用。
三、小鼠关节病理检测
试验第42天，取小鼠的膝关节，制作石蜡切片(切片厚度为4μm)，然后进行苏木素-依红染色。
结果见图5(A为正常对照组，B为模型组，C为细胞治疗组)。正常对照组小鼠的关节腔清晰，软骨组织光滑，无任何损坏痕迹。模型组小鼠的关节腔变得狭窄，滑膜增生明显，可见大量的炎症细胞浸润，部分软骨和骨组织遭到损坏。细胞治疗组小鼠的关节腔较为正常，滑膜增生不明显，可见少量的炎症细胞浸润，软骨和骨组织基本完整。
四、血液生化及免疫学指标检测
试验第42天，小鼠眼后毛细静脉丛采血，收集血清。检测血清中IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平。用于检测IL-17的试剂盒为eBioscience公司的产品，货号为85-88-7170。用于检测IFN-γ的试剂盒为eBioscienc公司的产品，货号为85-88-7314。用于检测IL-6的试剂盒为eBioscience公司的产品，货号为85-88-7064。用于检测TNF-α的试剂盒为eBioscience公司的产品，货号为85-88-7340。
IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ的检测结果见图6。与正常对照组相比，模型组小鼠血清中炎症因子IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均显著升高。与模型组相比，细胞治疗组小鼠血清中IL-17、TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均显著降低。

Claims (10)

1.间充质干细胞在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。
4.细胞制剂在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的应用；
所述细胞制剂的制备方法包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备得到脐带间充质干细胞，制备过程中采用低血清培养基。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述脐带间充质干细胞为原代脐带间充质干细胞或传代后的脐带间充质干细胞。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述细胞制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；
(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用低血清培养基培养细胞至80％汇合度；
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P1代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述P2代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为所述细胞制剂。
7.一种用于治疗类风湿性关节炎的药物，其活性成分为间充质干细胞。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。
10.一种用于治疗类风湿性关节炎的药物，其活性成分为权利要求4-6中所述的细胞制剂。
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