CN113057937A

CN113057937A - 干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113057937A
Application number: CN202110307321.6A
Authority: CN
Inventors: 王卓实; 张明琦; 赵艳; 郑玉强; 阴正勤
Original assignee: Shenyang Eye Industry Technology Research Institute Co ltd; Shenyang Heshi Eye Industry Group Co ltd; Shenyang Yuanchu Technology Co ltd; Liaoning He's Medical College
Current assignee: Shenyang Eye Industry Technology Research Institute Co ltd; Shenyang Heshi Eye Industry Group Co ltd; Shenyang Yuanchu Technology Co ltd; Liaoning He's Medical College
Priority date: 2021-03-23
Filing date: 2021-03-23
Publication date: 2021-07-02

Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用。本发明提供的干细胞静脉注射剂中间充质干细胞的直径为8～12微米，并且通过培养基的驯化使得移植的细胞结团率低，低表达黏附因子ICAM‑1，因此降低了间充质干细胞被肺部毛细管的截留细胞量，从而促进更多的间充质干细胞达到靶器官进行组织修复治疗。此外，研究发现本发明方法制备的细胞体外增殖能力要比常规培养的细胞增殖快，降低了细胞的体外制备时间，提高了生物制剂的生产效率，且更有利于提高疗效。

Description

干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用。

背景技术

人间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)是一类特殊的间充质干细胞，其具有组织修复、免疫调节和多向分化的潜能，已广泛应用于多种疾病的临床治疗研究。例如，临床前和临床试验均表明间充质干细胞具有修复和治疗视网膜变性疾病的作用，而视网膜变性疾病作为一种难治性眼部疾病，其病因是视网膜光感受器细胞的损伤或退行性病变，此前临床上尚无有效治疗方式。

目前全球有十余种干细胞产品上市，其中半数以上均为间充质干细胞产品，由此可见间充质干细胞作为一种重要的疾病治疗新药，备受全世界关注。目前间充质干细胞的移植方式主要是全身移植和局部移植，全身移植主要是静脉注射和动脉注射，局部移植主要是靶器官移植注射。静脉注射由于操作方便，创伤性小的植入方式，因此成为最常用的移植方式。

但研究表明体外扩增的hMSC静脉注射1小时后，约50％～60％的间充质干细胞被肺组织截留，并且截留在肺部组织中的hMSC不久便死亡，这种情况造成静脉输入的间充质干细胞到达靶器官的数量极少，到达肝、肾、胃肠和淋巴结细胞不足1％，能到达位于循环末梢的组织的间充质干细胞数量就更少，极大影响间充质干细胞的治疗效果。

因此，减少体外注射间充质干细胞的肺部截留，促进更多的间充质干细胞到达靶器官，发挥组织修复的作用，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供肺部截留低的干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用。

本发明提供的干细胞静脉注射剂，由间充质干细胞、白蛋白和生理盐水组成；其中，间充质干细胞的粒径为8μm～12μm。

本发明所述的干细胞静脉注射液中，间充质干细胞的密度为1.0×10⁶cells/ml；白蛋白的质量分数为1％～5％。

一些实施例中，本发明所述的干细胞静脉注射液中，间充质干细胞的密度为1.0×10⁶cells/ml；白蛋白的质量分数为3％。

本发明中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胚胎干细胞诱导分化而来的间充质干细胞和/或多能诱导干细胞诱导分化而来的间充质干细胞。

一些具体实施例中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

本发明实施例中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括：

将脐带间充质干细胞以含有1wt％BSA的α-MEM培养液重悬后，经过滤取直径为8～12μm的细胞；

将直径为8～12μm的细胞以培养基A培养，然后以培养基B培养；

其中，培养基A包括98vol％α-MEM、2vol％血清替代物和2～20μg/mlmethimazole。

培养基B包括95vol％α-MEM、5vol％血清替代物和2～20μg/ml methimazole。

一些实施例中，培养基A包括98vol％α-MEM、2vol％血清替代物和20μg/mlmethimazole

培养基B包括95vol％α-MEM、5vol％血清替代物和20μg/ml methimazole。

即本发明所述的培养基A或培养基B中，methimazole的浓度为2～20μg/ml。其为在液体组分中添加methimazole配制获得。所述液体组分由α-MEM培养液和血清替代物组成，在培养基A中，α-MEM培养液的体积分数为98％，血清替代物的体积分数为2％。在培养基B中，α-MEM培养液的体积分数为95％，血清替代物的体积分数为5％。

本发明通过降低粒径改善间充质干细胞在肺部的截留，并且所述间充质干细胞培养过程中采用的培养基中添加黏附因子抑制剂等方法从而更有效降低hMSCs在肺部截留问题。

本发明中，所述脐带间充质干细胞为体外贴壁培养的第三代脐带间充质干细胞。

一些实施例中，所述培养基A培养的培养皿为低吸附培养皿，培养7天；

所述培养基B培养的培养皿为涂布有纤维连接蛋白的培养皿，培养至细胞80％汇合。

所述涂布有纤维连接蛋白的培养皿的制备包括：将培养皿以纤维连接蛋白溶液处理，所述纤维连接蛋白溶液中，纤维连接蛋白溶液的质量分数为1％。

本发明所述干细胞静脉注射液的制备方法包括：将间充质干细胞重悬于生理盐水中然后加入白蛋白。

本发明干细胞静脉注射液在制备治疗疾病的药物中的应用。

本发明提供的干细胞静脉注射液能够最大限度的减少在毛细血管中的阻滞，从而能够不被具有丰富毛细血管网的器官截留。因此，该注射液能够用于治疗具有丰富的毛细血管网的器官的疾病，所述器官为眼、肝、肾、胃、肠和/或淋巴结。

一些具体实施例中，所述疾病为视网膜变性疾病。

本发明还提供了一种疾病的治疗方法，其为给予本发明所述的干细胞静脉注射液。所述给予的方法为静脉注射。

本发明提供的干细胞静脉注射剂中间充质干细胞的直径为8～12微米，并且通过培养基的驯化使得移植的细胞结团率低，低表达黏附因子ICAM-1，因此降低了间充质干细胞被肺部毛细管的截留细胞量，从而促进更多的间充质干细胞达到靶器官进行组织修复治疗。此外，研究发现本发明方法制备的细胞体外增殖能力要比常规培养的细胞增殖快，降低了细胞的体外制备时间，提供了生物制剂的生产效率，且更有利于提高疗效。

附图说明

图1光镜下细胞及直径比较；

图2不同直径细胞增殖能力比较；

图3细胞周期比较；

图4间充质干细胞尾静脉注射示踪图片；

图5注射后视网膜动作电位变化分析；

图6注射后RCS大鼠视网膜HE切片结果。

具体实施方式

本发明提供了干细胞静脉注射剂及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、间充质干细胞静脉注射剂的制备

1.1间充质干细胞悬液制备：

体外贴壁培养的第三代脐带间充质干细胞用0.05％胰酶37℃消化2分钟，用10ml细胞培养基进行终止培养，1200rpm离心5分钟，弃上清，收集沉淀，沉淀用含有1wt％BSA的α-MEM培养液重悬，制得细胞悬液。

1.2目的细胞的过滤分离：

将步骤1中制备的细胞悬液中细胞密度调整为0.5×10⁶～0.75×10⁶个细胞/ml，无菌胶头吸管吸取2ml细胞悬液加入滤径为10μm的过滤装置中，约2min后收集管内滤过细胞(经检测直径为8～12μm)，并收集未通过滤片的细胞(经检测直径为14～22μm)，然后将分离的细胞分别进行扩增培养。每个过滤装置最多可过滤2ml细胞悬液，

1.3细胞扩增培养：

分别对不同直径的细胞进行培养，共培养三种细胞，分别为：

组A未经过滤分离的间充质干细胞；

组B直径为8～12μm的间充质干细胞；

组C直径为14～22μm的间充质干细胞。

组A的细胞采用培养基C进行常规培养，培养基C组成为：90％α-MEM+10％胎牛血清。

组B和组A的细胞培养包括如下步骤：

1)分离后细胞以3D微球形培养，细胞按照3000个细胞/cm²种植于9厘米低吸附培养皿中，加入5ml培养基A。培养基A组成：98vol％α-MEM、2vol％血清替代物、20μg/mlmethimazole(MMI)。连续培养7天后收集分离的细胞。

2)细胞悬液调整成1.0×10⁶/ml，种植于1％Fibronectin纤维连接蛋白处理的培养皿中，加入培养基B。培养基B组成为：95vol％α-MEM,5vol％血清替代物(UltraGRO,Helios Bioscience)，20μg/ml methimazole(MMI)。待细胞80％汇合时用0.05％胰酶37℃消化2分钟，用10ml细胞培养基进行终止培养，1200rpm离心5分钟，收集沉淀。进行光镜检测，结果如图1。由图可见，组A常规方法培养的间充质干细胞，细胞直径大小不一致；B为直径8～12μm的间充质干细胞经扩增后的检测图，可见细胞直径大小一致，显著小于常规培养间充质干细胞。

2、细胞检测

2.1细胞增殖能力比较分析：将上述方法分离获得的8～12μm的脐带间充质干细胞，分别与大直径脐带间充质干细胞(直径14-22μm)、常规培养方法(90％α-MEM+10％胎牛血清)培养的脐带间充质干细胞进行增殖能力比较。方法：将三组细胞分离按照每孔3000个细胞种植于96孔板中，加入200μl相对应的培养基，每隔24h检测各组细胞生长增殖能力。结果见图2，由图可见，直径为8～12μm的间充质干细胞增殖能力最快。(图2)

2.2细胞周期比较分析：三组培养状态的间充质干细胞进行细胞周期分析，结果表明：直径为8～12μm的脐带间充质干细胞处于S期的较多，证明细胞增殖能力强；增殖系数分析显示直径为8～12μm的间充质干细胞细胞增殖能力显著高于大直径的B组细胞和混合的A组细胞。(图3)

2.3细胞表面特异性标志物分析：流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标志物，CD73,CD90，CD105,CD45,CD34,HLA-DR。

表1细胞表面标志物表达比较

CD73

CD90

CD105

CD45

CD34

HLA-DR

A组细胞

99.18％

98.73％

99.58％

0.38％

0.73％

0.45％

B组细胞

99.7％

99.99％

99.75％

0.13％

0.21％

0.32％

C组细胞

99.48％

99.88％

99.72％

0.13％

0.09％

0.29％

结果表明，三组间充质干细胞均符合间充质干细胞鉴定标准，标志物水平表达相似。

实施例2

1、静脉注射剂制备：

将实施例1制备扩增培养获得的组A～C的细胞制备成为注射剂，分别记为a～c组：

a组制剂，取A组细胞，重悬于2ml生理盐水中，至细胞密度为1.0×10⁶cells/ml，然后加入人血白蛋白至人血白蛋白的质量分数为3％。

b组制剂，取B组细胞，重悬于2ml生理盐水中，至细胞密度为1.0×10⁶cells/ml，然后加入人血白蛋白至人血白蛋白的质量分数为3％。

c组制剂，取C组细胞，重悬于2ml生理盐水中，至细胞密度为1.0×10⁶cells/ml，然后加入人血白蛋白至人血白蛋白的质量分数为3％。

2、制剂检测

2.1间充质干细胞制剂在体静脉移植观察肺部截留情况

将a～c组的细胞制剂，添加Dil红色荧光染料至5μg/ml对细胞进行示踪，然后取0.5ml细胞悬液分别进行C57小鼠尾静脉注射，注射后48h观察肺部细胞截留情况。(图4)，结果显示，b组制剂尾静脉注射48h肺部细胞无显著细胞截留；a组细胞制剂经尾静脉注射后48h有大量细胞截留于肺部。

2.2间充质干细胞尾静脉注射视网膜变性鼠，观察修复治疗作用

视网膜变性模型鼠RCS大鼠，于出生后第2周开始接受尾静脉注射实施例2制备的静脉注射制剂。实验分为三组，分别注射a～c组的细胞制剂。

移植后每隔两周进行电生理检测，6周取视网膜组织进行切片观察，观察治疗修复效果。结果证明，本专利方法制备和分离的间充质干细胞能够促进视网膜组织的修复，治疗后外核层显著增厚，且视网膜电传导作用显著增加，证明治疗后视网膜变性鼠的视功能显著提高。第4周，第6周注射b组注射剂的RCS大鼠的视觉电位与其它两组相比显著提高(图5)，且其视网膜外核层组显著增厚(图6)，细胞排列紧密。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.干细胞静脉注射剂，其特征在于，由间充质干细胞、白蛋白和生理盐水组成；其中，间充质干细胞的粒径为8μm～12μm。

2.根据权利要求1所述的干细胞静脉注射剂，其特征在于，其中，

间充质干细胞的密度为1.0×10⁶cells/ml；

白蛋白的质量分数为1％～5％。

3.根据权利要求1或2所述的干细胞静脉注射剂，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、胚胎干细胞诱导分化而来的间充质干细胞和/或多能诱导干细胞诱导分化而来的间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的干细胞静脉注射剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括：

其中，培养基A包括98vol％α-MEM、2vol％血清替代物和2～20μg/ml methimazole；

5.根据权利要求4所述的干细胞静脉注射剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞为体外贴壁培养的第三代脐带间充质干细胞。

6.根据权利要求4所述的干细胞静脉注射剂，其特征在于，

所述培养基A培养的培养皿为低吸附培养皿，培养7天；

7.权利要求1～6任一项所述的干细胞静脉注射液的制备方法，其特征在于，包括：将间充质干细胞重悬于生理盐水中然后加入白蛋白。

8.权利要求1～6任一项所述的干细胞静脉注射液在制备治疗疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为具有丰富的毛细血管网的器官的疾病，所述器官为眼、肝、肾、胃、肠和/或淋巴结。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病为视网膜变性疾病。