CN113952514A - 脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞再生医学技术领域，具体地说，涉及脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法。其包括以下步骤：脐带间充质干细胞的分离；细胞增殖能力的检测；体外诱导分化能力检测；细胞表面分子标志检测；菲力磁标记的的制备；普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响；菲力磁标记的脐带间充质干细胞灌装；移植肝脏机械灌注前经门静脉予以一次性无菌注射器注射。

Description

脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法
技术领域
本发明涉及干细胞恢复技术领域，具体地说，涉及脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法。
背景技术
器官移植是终末期器官衰竭患者现阶段最有效的治疗方法之一。近年来，随着供体保存、受者选择、外科技巧和术后管理等方面的改进及完善，患者的生存率和生活质量得到了明显提高和改善。慢性排斥反应是影响受者长期生存的最大障碍，且排斥反应会导致移植物功能不全，长期使用免疫抑制剂也会导致慢性感染和恶性肿瘤的高发。迄今为止，没有免疫抑制剂能够完全有效抑制器官移植后的排斥反应。移植免疫耐受的诱导是目前解决器官移植排斥反应较为理想的方法。干细胞疗法作为一种新兴的治疗免疫排斥及抗免疫炎症的生物治疗手段逐渐成为国内外研究的重点之一。间充质干细胞是一群来源于中胚层的多能干细胞，除了具有自我复制和多向分化潜能之外，它还具有低免疫原性和免疫调节作用的生物学特性，研究表明间充质干细胞能抑制异基因移植物抗宿主病发生、诱导免疫耐受并改善移植物功能及存活时间。间充质干细胞对T细胞、B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞等具有多种作用，通过发挥独特的免疫调节特性显著降低排斥反应的发生。因此间充质干细胞是一种理想的外源性修复种子细胞，不存在伦理、道德及应用安全性等方面的争议体外克隆技术也较成熟所以其在作为种子细胞修复肝脏损伤方面的研究具有广泛的发展潜力。
同时有研究表明通过机械灌注保存供肝能够减少供肝的缺血再灌注损伤。从而改善肝移植的效果。常温机械灌注 能够通过补充氧和营养物质，减少ATP丢失，促进保护性蛋白的产生，从而改善边缘供肝移植手术的疗效。然而，单纯常温机械灌注保存虽然能够提供能量但并不能修复肝窦内皮细胞等的损伤。
因此本发明拟用机械灌注前经门静脉注射脐带间充质干细胞来改善并修复常温机械灌注对移植肝脏的损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供了脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，包括以下步骤：
S1、无菌操作，取脐带华通胶，剪碎成1-2mm2组织块，用无血清培养液混匀组织块，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中进行培养，细胞贴壁后，每隔3-4d换液，融合至80%-90%传代培养，加入胰酶消化，按比例传代至175cm2培养瓶中；
S2、取原代、2、4、6代细胞，加入无血清培养液制成细胞悬液，接种于6孔板内，第3天起，每间隔1天消化和统计细胞数量；
S3、细胞融合80%时收集细胞，接种于24孔板中，每孔加入无血清培养液0.8ml，3孔重复；细胞再次汇合至50%时分别加入干细胞成脂、成骨、成软骨诱导培养基，每3天更换一次培养液，第 14 天和第 21 天，分别用油红O染色，钙盐染色液染色和苏木素-伊红染色鉴定分化；
S4、将培养所得的3、4代细胞制成细胞悬液，加入各类抗人抗体试剂各5μl，鼠IgG1为阴性对照，4℃反应30min，流式细胞仪检测；
S5、取对数生长期的脐带间充质干细胞机械吹打成单细胞以5×105的密度接种到含有菲力磁的培养基中孵育；
S6、普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；
S7、透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；
S8、检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响；
S9、鉴定合格的菲力磁标记的脐带间充质干细胞显微镜下观察细胞汇合至80%，消化收集细胞，离心洗涤重复3遍，加入生理盐水调整细胞密度为1-2×107个/ml滴加体积比为0.1%的人血白蛋白，灌装至一次性无菌注射器中；
S10、移植肝脏机械灌注前经门静脉予以一次性无菌注射器注射。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，取脐带时检测产妇抗 HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、抗HCV抗体、HBV抗原、ALT、抗巨细胞病毒抗体的指标均为阴性；产妇留取脐带知情同意后，常规结扎处理好脐带，轻轻挤净脐血管内的血液，然后用生理盐水将脐带冲洗干净后放入盛有特制保存液的容器中密封保存；另采集产妇静脉血5ml。
作为本技术方案的进一步改进，所述S5中，培养基的铁离子浓度为16.8μg/ml，5%二氧化碳，并将脐带间充质干细胞在37℃下培养48h。
作为本技术方案的进一步改进，所述S6的具体步骤为：取菲力磁标记后的部分脐带间充质干细胞做普鲁士蓝染色，细胞贴壁1天后，使用4%多聚甲醛固定，磷酸缓冲盐溶液洗3次，2%铁氰化钾和6%氯化氢孵育30min，l%核固红复染，显微镜下观察染色结果。
作为本技术方案的进一步改进，所述S7的具体步骤为：收集菲力磁标记后的部分细胞调节细胞数为5×l07/ml，将细胞连同培养基一起置于2ml塑料小指管，1000r/min离心10min，用Hanks液清洗3次去上清，沿管壁加2%-3%戊二醛轻轻吹打使细胞混悬于固定液，4℃固定30min，用小铝片将细胞团块铲离管底翻面，继续用新固定液固定40min，1000r/min离心5min去上清液，4℃磷酸缓冲盐溶液冲洗2h离心后去上清液，离心管内加入0.5ml、2%-4%的琼脂糖两手搓离心管使细胞和琼脂糖混匀，室温下冷却形成细胞琼脂糖凝胶预包埋块，将预包埋块切成1mm3，在4℃下用多聚甲醛和戊二醛固定24h，磷酸缓冲盐溶液反复漂洗，30%、50%、70%、90%、95%浓度的酒精脱水2次，每次15min，然后50%、70%、90%浓度的丙酮脱水各1次，每次10-15min，100%丙酮脱水3次，每次30min，环氧树脂812渗透包埋超薄切片，醋酸双氢铀及构椽酸铅双重染色，H600型透射电镜75KV观察拍片。
作为本技术方案的进一步改进，所述S8的具体步骤为：对菲力磁标记后的脐带间充质干细胞绘制生长曲线，铁离子浓度为16.8ug/ml的标记培养基培养脐带间充质干细胞5-7天后离心、机械吹打成单细胞，部分细胞以5×104/ml接种到25ml培养瓶中进行传代培养5-7天，传代1次同时以未用菲力磁标记的正常脐带间充质干细胞做空白对照MTT法检测细胞的增殖生长情况描绘生长曲线，部分细胞行向肝细胞分化的实验分别在脐带间充质干细胞与肝细胞共培养的第8天和第16天时，分别行甲胎蛋白及白蛋白免疫细胞化学染色在光镜下对阳性染色的脐带间充质干细胞进行计数，每组4个盖玻片，在每个盖玻片随机选择10个高倍视野计数判断菲力磁标记的脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
该脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法中，DCD供体在心脏停跳过程中不可避免要经历低血压、休克、缺氧等热缺血损伤，长时间的热缺血损伤会导致原发性移植肝无功能、肝动脉血栓形成、缺血性胆管病变等严重并发症，本发明意在减轻甚至修复DCD来源的肝脏损伤，并利用菲立磁法确定干细胞的定植，为临床提供有效的数据基础。
附图说明
图1为本发明中实施例1的整体流程框图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，包括：
1、脐带间充质干细胞的分离：取脐带时检测产妇抗 HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、抗HCV抗体、HBV抗原、ALT、抗巨细胞病毒抗体的指标均为阴性；产妇留取脐带知情同意后，常规结扎处理好脐带，轻轻挤净脐血管内的血液，然后用生理盐水将脐带冲洗干净后放入盛有特制保存液的容器中密封保存；另采集产妇静脉血5ml；无菌操作，取脐带华通胶，剪碎成1-2mm2组织块，用无血清培养液混匀组织块，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中进行培养，细胞贴壁后，每隔3-4d换液，融合至80%-90%传代培养，加入胰酶消化，按比例传代至175cm2培养瓶中；
2、细胞增殖能力的检测：取原代、2、4、6代细胞，加入无血清培养液制成细胞悬液，接种于6孔板内，第3天起，每间隔1天消化和统计细胞数量；
3、体外诱导分化能力检测：细胞融合80%时收集细胞，接种于24孔板中，每孔加入无血清培养液0.8ml，3孔重复；细胞再次汇合至50%时分别加入干细胞成脂、成骨、成软骨诱导培养基，每3天更换一次培养液，第 14 天和第 21 天，分别用油红O染色，钙盐染色液染色和苏木素-伊红染色鉴定分化；
4、细胞表面分子标志检测：将培养所得的3、4代细胞制成细胞悬液，加入各类抗人抗体试剂各5μl，鼠IgG1为阴性对照，4℃反应30min，流式细胞仪检测；
5、菲力磁标记的的制备：取对数生长期的脐带间充质干细胞机械吹打成单细胞以5×105的密度接种到含有菲力磁的培养基中孵育，培养基的铁离子浓度为16.8μg/ml，5%二氧化碳，并将脐带间充质干细胞在37℃下培养48h；
6、普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞：取菲力磁标记后的部分脐带间充质干细胞做普鲁士蓝染色，细胞贴壁1天后，使用4%多聚甲醛固定，磷酸缓冲盐溶液洗3次，2%铁氰化钾和6%氯化氢孵育30min，l%核固红复染，显微镜下观察染色结果；
7、透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞：收集菲力磁标记后的部分细胞调节细胞数为5×l07/ml，将细胞连同培养基一起置于2ml塑料小指管，1000r/min离心10min，用Hanks液清洗3次去上清，沿管壁加2%-3%戊二醛轻轻吹打使细胞混悬于固定液，4℃固定30min，用小铝片将细胞团块铲离管底翻面，继续用新固定液固定40min，1000r/min离心5min去上清液，4℃磷酸缓冲盐溶液冲洗2h离心后去上清液，离心管内加入0.5ml、2%-4%的琼脂糖两手搓离心管使细胞和琼脂糖混匀，室温下冷却形成细胞琼脂糖凝胶预包埋块，将预包埋块切成1mm3，在4℃下用多聚甲醛和戊二醛固定24h，磷酸缓冲盐溶液反复漂洗，30%、50%、70%、90%、95%浓度的酒精脱水2次，每次15min，然后50%、70%、90%浓度的丙酮脱水各1次，每次10-15min，100%丙酮脱水3次，每次30min，环氧树脂812渗透包埋超薄切片，醋酸双氢铀及构椽酸铅双重染色，H600型透射电镜75KV观察拍片；
8、检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响：对菲力磁标记后的脐带间充质干细胞绘制生长曲线，铁离子浓度为16.8ug/ml的标记培养基培养脐带间充质干细胞 5-7天后离心、机械吹打成单细胞，部分细胞以5×104/ml接种到25ml培养瓶中进行传代培养5-7天，传代1次同时以未用菲力磁标记的正常脐带间充质干细胞做空白对照MTT法检测细胞的增殖生长情况描绘生长曲线，部分细胞行向肝细胞分化的实验分别在脐带间充质干细胞与肝细胞共培养的第8天和第16天时，分别行甲胎蛋白及白蛋白免疫细胞化学染色在光镜下对阳性染色的脐带间充质干细胞进行计数，每组4个盖玻片，在每个盖玻片随机选择10个高倍视野计数判断菲力磁标记的脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力；
9、菲力磁标记的脐带间充质干细胞灌装：鉴定合格的菲力磁标记的脐带间充质干细胞显微镜下观察细胞汇合至80%，消化收集细胞，离心洗涤重复3遍，加入生理盐水调整细胞密度为1-2×107个/ml滴加体积比为0.1%的人血白蛋白，灌装至一次性无菌注射器中；
10、移植肝脏机械灌注前经门静脉予以一次性无菌注射器注射。
本发明脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法中，DCD供体在心脏停跳过程中不可避免要经历低血压、休克、缺氧等热缺血损伤，长时间的热缺血损伤会导致原发性移植肝无功能、肝动脉血栓形成、缺血性胆管病变等严重并发症，本发明意在减轻甚至修复DCD来源的肝脏损伤，并利用菲立磁法确定干细胞的定植，为临床提供有效的数据基础。
试验例1
采用热缺血方法制备大鼠模型，应用脐带间充质干细胞联合机械灌注平台对其进行治疗，通过检测肝功能，观察肝脏病理情况，对其治疗作用进行评估；
制备动物模型：大鼠单笼饲养，术前禁食12h以上，动物5％水合氯醛腹腔麻醉后，开腹充分暴露肝脏，下腔静脉注射0.4ml肝素生理盐水，分离韧带，结扎膈下、食管等小静脉以及肝固有动脉，分离出门静脉、下腔静脉及胆总管，快速打开胸腔，夹闭胸主动脉，计时45min，45min结束时快速进行门静脉、下腔静脉以及胆总管插管，门静脉连接到膜肺的出口，下腔静脉连接到膜肺的入口，本实验将压力控制在5.5mmHg并保持平稳，灌注速度4ml/min，灌注液是含有10%胎牛血清的DMEM.F12培养液+1%青霉素和链霉素双抗混合液以及5%的自体血液；
实验分组：肝损伤实验分组大鼠27只随机分为3组：正常组、模型组、溶剂对照组(机械灌注前通过门静脉向模型大鼠注射500μl的生理盐水)、治疗组(机械灌注前通过门静脉向模型大鼠注射浓度为2×106个/ml的菲力磁标记的干细胞悬液500μL)，机械灌注4h后收集肝脏标本；
通过门静脉途径将菲力磁标记的脐带间充质干细胞移植到肝脏，采用MRI技术SE-T2WI序列成像对移植前2h、移植后4h的肝脏进行扫描并比较分析，试验结果如表1：
表1
Figure 402401DEST_PATH_IMAGE001
根据表1所示，模型组和溶剂对照组与正常组比较，ALT、AST和MDA水平明显升高，SOD活性明显下降，治疗组与模型组和溶剂对照组相比较，ALT、AST和MDA水平明显降低，SOD活性上升，因此可以说明本发明脐带间充质干细胞恢复机械灌注中肝脏损伤的方法是修复肝脏损伤的较好方法。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、无菌操作，取脐带华通胶，剪碎成1-2mm2组织块，用无血清培养液混匀组织块，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳培养箱中进行培养，细胞贴壁后，每隔3-4d换液，融合至80%-90%传代培养，加入胰酶消化，按比例传代至175cm2培养瓶中；
S2、取原代、2、4、6代细胞，加入无血清培养液制成细胞悬液，接种于6孔板内，第3天起，每间隔1天消化和统计细胞数量；
S3、细胞融合80%时收集细胞，接种于24孔板中，每孔加入无血清培养液0.8ml，3孔重复；细胞再次汇合至50%时分别加入干细胞成脂、成骨、成软骨诱导培养基，每3天更换一次培养液，第 14 天和第 21 天，分别用油红O染色，钙盐染色液染色和苏木素-伊红染色鉴定分化；
S4、将培养所得的3、4代细胞制成细胞悬液，加入各类抗人抗体试剂各5μl，鼠IgG1为阴性对照，4℃反应30min，流式细胞仪检测；
S5、取对数生长期的脐带间充质干细胞机械吹打成单细胞以5×105的密度接种到含有菲力磁的培养基中孵育；
S6、普鲁士蓝染色鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；
S7、透射电镜鉴定菲力磁标记的脐带间充质干细胞；
S8、检测菲力磁标记对脐带间充质干细胞存活、增殖、分化的影响；
S9、鉴定合格的菲力磁标记的脐带间充质干细胞显微镜下观察细胞汇合至80%，消化收集细胞，离心洗涤重复3遍，加入生理盐水调整细胞密度为1-2×107个/ml滴加体积比为0.1%的人血白蛋白，灌装至一次性无菌注射器中；
S10、移植肝脏机械灌注前经门静脉予以一次性无菌注射器注射。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于：所述S1中，取脐带时检测产妇抗 HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、抗HCV抗体、HBV抗原、ALT、抗巨细胞病毒抗体的指标均为阴性；产妇留取脐带知情同意后，常规结扎处理好脐带，轻轻挤净脐血管内的血液，然后用生理盐水将脐带冲洗干净后放入盛有特制保存液的容器中密封保存；另采集产妇静脉血5ml。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于：所述S5中，培养基的铁离子浓度为16.8μg/ml，5%二氧化碳，并将脐带间充质干细胞在37℃下培养48h。
4.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于：所述S6的具体步骤为：取菲力磁标记后的部分脐带间充质干细胞做普鲁士蓝染色，细胞贴壁1天后，使用4%多聚甲醛固定，磷酸缓冲盐溶液洗3次，2%铁氰化钾和6%氯化氢孵育30min，l%核固红复染，显微镜下观察染色结果。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于：所述S7的具体步骤为：收集菲力磁标记后的部分细胞调节细胞数为5×l07/ml，将细胞连同培养基一起置于2ml塑料小指管，1000r/min离心10min，用Hanks液清洗3次去上清，沿管壁加2%-3%戊二醛轻轻吹打使细胞混悬于固定液，4℃固定30min，用小铝片将细胞团块铲离管底翻面，继续用新固定液固定40min，1000r/min离心5min去上清液，4℃磷酸缓冲盐溶液冲洗2h离心后去上清液，离心管内加入0.5ml、2%-4%的琼脂糖两手搓离心管使细胞和琼脂糖混匀，室温下冷却形成细胞琼脂糖凝胶预包埋块，将预包埋块切成1mm3，在4℃下用多聚甲醛和戊二醛固定24h，磷酸缓冲盐溶液反复漂洗，30%、50%、70%、90%、95%浓度的酒精脱水2次，每次15min，然后50%、70%、90%浓度的丙酮脱水各1次，每次10-15min，100%丙酮脱水3次，每次30min，环氧树脂812渗透包埋超薄切片，醋酸双氢铀及构椽酸铅双重染色，H600型透射电镜75KV观察拍片。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞再生修复机械灌注中肝脏损伤的方法，其特征在于：所述S8的具体步骤为：对菲力磁标记后的脐带间充质干细胞绘制生长曲线，铁离子浓度为16.8ug/ml的标记培养基培养脐带间充质干细胞 5-7天后离心、机械吹打成单细胞，部分细胞以5×104/ml接种到25ml培养瓶中进行传代培养5-7天，传代1次同时以未用菲力磁标记的正常脐带间充质干细胞做空白对照MTT法检测细胞的增殖生长情况描绘生长曲线，部分细胞行向肝细胞分化的实验分别在脐带间充质干细胞与肝细胞共培养的第8天和第16天时，分别行甲胎蛋白及白蛋白免疫细胞化学染色在光镜下对阳性染色的脐带间充质干细胞进行计数，每组4个盖玻片，在每个盖玻片随机选择10个高倍视野计数判断菲力磁标记的脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力。
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