CN109392891B - 一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用 - Google Patents

一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，包括以下步骤：(1)脐带羊膜组织的分离及冻存；(2)脐带血管组织的分离及冻存；(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存。本发明还提供了脐带的复苏方法。本发明的冻存方法，将脐带羊膜、血管、华通氏胶组织，按照结构层次依此剥离，再经过处理，放入液氮中冻存，分别保存脐带的三种组织，根据每种组织的特异性采取不同的冻存及复苏方法，有利于提高冻存复苏活性和细胞得率。本发明提供了一套系统的保存完整脐带各类组织的方法，为脐带来源的干细胞研究提供了重要的生物资源，可以用于组建脐带来源的组织或细胞资源样本库。本发明为完善脐带来源的人类遗传资源库奠定了坚实的基础和依据。

Description

一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用
技术领域
本发明涉及一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用，属于生命科学技术领域。
背景技术
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，外层为羊膜，内有两条动脉和一条静脉 组成，在其间隙中可以看到疏松、胶状的间充质，充满华通氏胶组织，可分离制备出多种干 细胞，是一种丰富的组织资源库。
羊膜组织可分离得到人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cell,hAEC)，具有 表达多种胚胎干细胞标记物的特点和较全面的多向分化潜能。除表达胚胎干细胞表面抗原： SSSEA-3和SSSEA-4，肿瘤抗性基因TRA 1-60和TRA 1-81之外，近来发现hAECs还表达多潜 能干细胞的转录因子，例如Oct-4、Sox-2、Nanog和REX-1等及其他抗原，例如上皮钙黏蛋 白、整合素α6和β、肝细胞生长因子结合受体(c-met)等。不表达CD34(造血干细胞及 内表干细胞表面标记)、SSSEA-1、CD133(造血干细胞、内皮细胞及恶性胶质瘤细胞表面标记)， 弱表达c-kit(CD117)和CC趋化因子受体(CRR4)。
脐动脉和脐静脉中均可分离血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)，是一种单层 扁平上皮细胞，通过产生和分泌多种血管活性物质在维持血管输缩、抗凝血及血管构建方面 起重要作用，表达第Ⅷ因子关连抗原(von willebrand factor,VWF)，Weibel-Palade小体、可溶 性细胞粘附分子(ICAM-1)、血栓调节蛋白(TM)等，同时分泌内皮素、血管紧张素Ⅱ、血 栓素A2等内皮依赖收缩因子，与多种疾病研究相关。
脐带中的华通氏胶(Wharton’s Jelly)组织可分离得到间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSC)，脐带来源的MSC具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性 低等优点，每15～20g脐带华通氏胶组织可以分离得到约107原代MSC。MSC目前发现的可 阳性表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90(Thy-1)、CD105(endoglin)和CD166，但 不表达CD14、CD34、CD38和CD45。2006年国际细胞治疗协会已制定并发布了MSC应具 有形态学、免疫表型和诱导分化3个生物学特征指标。已证实，MSC是一类可分化成中胚层 多种组织的多能成体干细胞，而且已被证实MSC能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等，而且它在体内和体外还具有调节和抑制免疫反应的能力。目前在临床对多种疾病具有一定的 效果，因此储存MSC可为医学提供大量的素材。
目前，行业内脐带的保存主要是利用华通氏胶制备MSC，而羊膜、脐动脉、脐静脉等均 丢弃，且保存MSC做法是：从华通氏胶中分离得到MSC，再经过20天左右扩增培养到一定数 量细胞，然后进行深低温保存。该方法周期长，制备成本高，而且脐带中的其他类型的组织 和剩余的华通氏胶组织都将被作为废弃物丢弃，造成了样本资源浪费。因此，研发一种能够 依据结构层次，快速、完整、系统的保存脐带各组织的方案显得十分重要。
中国发明专利CN201610108280.7(公开号105766890A)公开了一种脐带组织的低温保存 及获得其衍生干细胞的方法，包含下列步骤：(a)施加张力至一脐带片段，以扩张该脐带片段 中三条脐带血管之间的空隙；(b)在各该脐带血管之间的空隙沿着平行于该脐带血管长度的纵 向切割该脐带片段，以获得一条状脐带组织，其中该条状脐带组织包含该脐带血管与华通氏 胶(Wharton's jelly)，该华通氏胶来自于一血管周边区域、一血管间区域及一羊膜下层区域； (c)将该条状脐带组织与一低温组成物进行混合培养(incubating)；以及(d)低温保存含有该 华顿氏胶的该条状脐带组织与该低温组成物。该方法保存脐带组织条，且各成分统一冻存。 研究表明，不同的组织、甚至不同的细胞应适用特有的冰冻方式才能有好的冻存效果，所以 脐带的各类组织应分别、独立采用不同的冰冻方式，才能得到较好的冻存效果。因此本发明 拟提供一套系统的各脐带组织的保存方法，以解决脐带各有价值的组织长期保存及应用问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法和应用， 是针对人脐带全部组织(羊膜组织、血管组织、华通氏胶组织)的冻存及复苏方法，该方法 是以冻存组织的形式来保存其来源的多种干细胞。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，包括以下步骤：
(1)脐带羊膜组织的分离及冻存：用生理盐水洗涤脐带2～3次，剪去(用组织剪)脐带两头，再用生理盐水涮洗2次，撕取或剪下表面羊膜组织(尽量保持羊膜组织完整)；用生理盐水冲洗羊膜组织，将羊膜折叠或平放于冻存袋中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心(4℃，1300rpm离心5min)去除平衡液，然后加入预冷至4℃～10℃ 的玻璃化冻存液Ⅰ，转移至液氮冷冻保存；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加15～25wt％的乙二醇(指添加后所 占的质量百分比，下同)，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加40～60wt％的甘油、10～ 20wt％的海藻糖、8～15wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
所述脐带，通过以下方式获得：选取无传染病、无产科并发症的健康脐带，经产妇同意 并签署知情同意书，正常采集，将采集到的脐带24小时内运送至实验室，并进行各种必要的 检测，如病毒等传染病检测，细菌污染检测等；
进一步地，所述取下的羊膜组织，每块不小于10cm2；
(2)脐带血管组织的分离及冻存：将上述已经剥离羊膜的脐带的动脉血管和静脉血管分 离下，用生理盐水清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，然后将血管剪成长2～4cm的小 段；将血管小段转移至离存管中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离 心去除平衡液，再转移至冻存管(2ml)中，加入预冷至4℃～10℃玻璃化冻存液Ⅱ，每1条 血管小段加入1ml的玻璃化冻存液Ⅱ，分五步导入玻璃化冻存液，导入量依次为：50μl、150μl、 150μl、200μl、450μl，每步之间平衡90s；导入完成后快速封口，转移至液氮冷冻保存；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加15～25wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅱ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜(DMSO)、 15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存：用生理盐水充分洗涤上述剥离羊膜和血管的脐带， 转移至离心管(50ml)中，剪碎成1～2cm3的组织块；加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平 衡5～10min，低温离心，去除上清，再将组织块转移至冻存管中(2ml)(便于后续复苏)， 加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅲ，转入程控降温仪，按照设定的降温程序降温至 -90℃，转移至液氮冷冻保存；
所述降温程序为：在4℃保持8min；以1℃/min速率继续降至-10℃，保持5min；以1.5℃ /min速率继续降至-40℃保持6min；以3℃/min速率继续降至-80℃保持10min；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加15～25wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅲ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜(DMSO)、 8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基。
上述脐带羊膜、血管、华通氏胶组织，按照结构层次依此剥离，再经过处理成合适大小， 装入冻存容器中，经过处理，放入液氮中冻存，每份样本均给予唯一的识别码，各组织均分 别标明名称、序号，便于后续复苏使用。
对脐带进行上述冻存操作后，可在有需要时进行复苏，包括以下步骤：
(1)冻存的脐带羊膜组织的复苏：将冻存的脐带羊膜组织从液氮中取出，将冻存袋迅 速放入37℃～42℃水浴锅中快速溶解45s～90s(约80％溶解)，然后快速转移至生物安全柜 中，打开冻存袋，用镊子轻轻取出羊膜，置入离心管(50ml)中，加入复苏液Ⅰ(提前室温平衡)，混匀，低温离心，去除上清液；再加入复苏液Ⅱ(提前室温平衡)，混匀，低温离心， 去除上清液，备用；
所述复苏液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为 0.6mol/L，即得；
所述复苏液Ⅱ，同基础液(含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基)；
复苏后的羊膜，仍然能够保留冻存前的组织结构与细胞活性，可用于分离羊膜上皮细胞、 间充质细胞等，也可用于外伤术后组织防黏连恢复，可以有效促进伤口愈合；
(2)冻存的脐带血管组织的复苏：将冻存的脐带血管组织从液氮中取出，于气相中平 衡5min，然后将冻存管置于37℃～42℃水浴锅中快速溶解45s～90s(约80％溶解)，快速移 入生物安全柜中，打开冻存管，将血管组织吸入离心管(50ml)中，分5步洗脱：先加入复苏液Ⅲ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅰ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅳ，平衡60s， 取出，再加入复苏液Ⅱ，平衡60s，取出，最后加入生理盐水，平衡，备用；
所述复苏液Ⅲ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为 1.2mol/L，即得；
所述复苏液Ⅳ，为含40wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
复苏后的脐带血管组织可用于制备血管内皮细胞，其在抗凝血及血管构建方面起重要作 用，对医学有重要研究价值；
(3)冻存的脐带华通氏胶组织的复苏：将脐带华通氏胶组织在液氮中取出，迅速将冻存 管放入37℃～42℃水浴锅中摇晃溶解45s～90s(约80％溶解)，快速移入生物安全柜中，打 开冻存管，将华通氏胶组织吸入离心管(50ml)中，加入复苏液Ⅰ，低温离心，去除上清； 再加入复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清；再加入复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清，备用。
复苏后的脐带华通氏胶组织可以培养制备获得大量间充质干细胞，对多种疾病具有一定 的效果。
本发明的一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，可以用于组建脐带来源的组织或 细胞资源样本库。本发明为完善脐带来源的人类遗传资源库奠定了坚实的基础和依据。
本发明的一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，具有以下有益效果：
(1)将脐带依据结构层次依次分离羊膜组织、血管组织、华通氏胶组织，提供了一套系 统的保存完整脐带各类组织的方法，为脐带来源的干细胞研究提供了重要的生物资源。
(2)分别保存脐带的三种组织，根据每种组织的特异性采取不同的冻存及复苏方法，与 现有的统一保存方式不同，有利于提高冻存复苏活性和细胞得率。
(3)将脐带羊膜组织成片保存、血管组织分段保存，尽量保持完整性，与目前常用的统 一剪成1～2cm3小块不同，除用于制备细胞外，还可用于组织工程、血管修复等方面，为医学 应用提供素材。
附图说明
图1示出了冻存复苏后的羊膜间充质干细胞流式检测结果。
图2示出了新鲜血管组织HE染色高倍显微镜(放大倍数10*40倍)下观察的结果。
图3示出了冻存3个月后的血管组织HE染色低倍显微镜(放大倍数10*40倍)下观察的 结果。
图4示出了MSC成脂分化结果(放大倍数10*40倍)，其中，A：复苏后的MSC诱导脂肪后油红染色图；B：新鲜培养的MSC成脂结果图。
图5示出了MSC成骨分化结果(放大倍数10*40倍)，其中，A：复苏后MSC成骨诱导钙结节图片；B：新鲜培养的MSC成骨诱导钙结节图片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常 规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测 方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1人脐带组织的冻存
步骤如下：
(1)用生理盐水洗涤脐带3次，用组织剪剪去脐带两头，再用生理盐水涮洗2次，撕取表面羊膜组织(尽量保持羊膜组织完整)，取下的羊膜组织，每块不小于10cm2；用生理盐水冲洗羊膜组织，将羊膜折叠或平放于冻存袋中，加入预冷至4℃的平衡液，平衡8min，4℃，1300rpm离心5min，去除平衡液，然后加入预冷至4℃的玻璃化冻存液Ⅰ，转移至液氮冷冻 保存；
所述冻存液，包括1)基础液：含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；2)平衡液：基础液中添加20wt％的乙二醇；3)玻璃化冻存液：基础液中添加55wt％甘油、15wt％的海藻糖、10wt％ 1,2-丙二醇。
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加20wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加55wt％的甘油、15wt％的海 藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
为验证冻存效果，本发明进行了对比实验，对比方案及实验结果如表1所示。表1中的 “程控降温”的具体程序为：在4℃保持5min；以1.5℃/min速率继续降至-40℃，保持5min； 以2℃/min速率继续降至-80℃保持10min；
通过表1可以看出，冻存液采用本发明的玻璃化冻存液Ⅰ，冻存方式采用玻璃化冻存， 效果最佳。
表1
Figure BDA0001842731190000061
所述脐带，通过以下方式获得：选取无传染病、无产科并发症的健康脐带，经产妇同意 并签署知情同意书，正常采集，将采集到的脐带24小时内运送至实验室，并进行各种必要的 检测，如病毒等传染病检测，细菌污染检测等。
(2)脐带血管组织的分离及冻存：将上述已经剥离羊膜的脐带的动脉血管和静脉血管分 离下，用生理盐水清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，然后将血管剪成长2～4cm的小 段；将血管小段转移至离存管中，加入预冷至4℃的平衡液，平衡8min，4℃，1300rpm离心 5min，去除平衡液，再转移至冻存管(2ml)中，加入预冷至4℃的玻璃化冻存液Ⅱ，每1条 血管小段加入1ml的玻璃化冻存液Ⅱ，分五步导入玻璃化冻存液，导入量依次为：50μl、150μl、 150μl、200μl、450μl，每步之间平衡90s；导入完成后快速封口，转移至液氮冷冻保存；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加20wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅱ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜(DMSO)、 8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％(重量百分数)人血白蛋白的α-MEM培养基。
为验证冻存效果，本发明进行了对比实验，对比方案及实验结果如表2所示。
通过表2可以看出，分五步的导入方式效果最佳，每步之间平衡90s效果最佳。
表2
Figure BDA0001842731190000071
(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存：用生理盐水充分洗涤上述剥离羊膜和血管的脐带， 转移至离心管(50ml)中，剪碎成1～2cm3的组织块；加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平 衡8min，低温离心(4℃，1300rpm离心5min)，去除上清，再将组织块转移至冻存管中(2ml) (便于后续复苏)，加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅲ，转入程控降温仪，按照设定的 降温程序降温至-90℃，转移至液氮冷冻保存；
所述降温程序为：在4℃保持8min；以1℃/min速率继续降至-10℃，保持5min；以1.5℃ /min速率继续降至-40℃保持6min；以3℃/min速率继续降至-80℃保持10min；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加20wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅲ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜(DMSO)、 8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基。
为验证保证华通氏胶组织冻存效果，本发明进行了对比实验，对比方案及实验结果如表 3所示。
通过表3可以看出，冻存液采用本发明的玻璃化冻存液Ⅲ，冻存方式采用本发明的程控 降温，效果最佳。
表3
Figure BDA0001842731190000081
上述羊膜、血管、华通氏胶组织按照先后顺序依次从胎脐带中剥离、处理成合适大小， 再装入冻存管或冻存袋等容器中保存，容器上标好带有组织名称的特异性编码，放入液氮容 器特定位置长期储存，样本特异性编码用于复苏时查找样本。
实施例2：脐带冻存后的复苏
按照实施例1的方法冻存3个月后，进行复苏，并诱导分离间充质干细胞，步骤如下：
(1)冻存的脐带羊膜组织的复苏：将冻存的脐带羊膜组织从液氮中取出，将冻存袋迅 速放入37℃水浴锅中快速溶解80s(约80％溶解)，然后快速转移至生物安全柜中，打开冻存 袋，用镊子轻轻取出羊膜，置入离心管(50ml)中，加入复苏液Ⅰ(提前室温平衡)，混匀，低温离心，去除上清液；再加入复苏液Ⅱ(提前室温平衡)，混匀，低温离心，去除上清液， 备用；
所述复苏液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为 0.6mol/L，即得；
所述复苏液Ⅱ，同基础液(含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基)。
复苏后，将羊膜剪碎，用含0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶消化3次，生理盐水或PBS缓 冲液冲洗，再加入0.85mg/ml胶原酶I，37℃，低速旋转震荡消化2h，至组织完全消化，过细胞筛过滤，收集消化后的滤液，1500r/min离心10min，细胞沉淀加入α-MEM完全培养基，接种于175培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，原代细胞爬出后，传代，收集细胞进行细胞活率检测、流式检测，细胞活率为92％，流式检测结果如图1，阳性表达CD44和CD105、不表达CD34和CD45。
结果：本发明的冻存、复苏方法可以有效的保持羊膜干细胞的活性，制备后的细胞标记 物符合间充质干细胞的特性。
(2)冻存的脐带血管组织的复苏：将冻存的脐带血管组织从液氮中取出，于气相中平 衡5min，然后将冻存管置于37℃～42℃水浴锅中快速溶解60s(约80％溶解)，快速移入生物 安全柜中，打开冻存管，将血管组织吸入离心管(50ml)中，分5步洗脱：先加入复苏液Ⅲ， 平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅰ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅳ，平衡60s，取出，再 加入复苏液Ⅱ，平衡60s，取出，最后加入生理盐水，平衡，备用；
所述复苏液Ⅲ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为 1.2mol/L，即得；
所述复苏液Ⅳ，为含40wt％人血白蛋白的α-MEM培养基。
脐带血管冻存前，选取新鲜组织放入10％中性福尔马林中固定，送至委托的独立医学实 验室进行HE染色观察，并记录放大10×40倍的染色结果，冻存复苏后再次进行HE染色，比 较冻存组织结构等是否改变，如图2、3所示，冻存前后组织HE染色在高倍镜下观察无异。
(3)冻存的脐带华通氏胶组织的复苏：将脐带华通氏胶组织在液氮中取出，迅速将冻存 管放入37℃～42℃水浴锅中摇晃溶解70s(约80％溶解)，快速移入生物安全柜中，打开冻存 管，将华通氏胶组织吸入离心管(50ml)中，加入复苏液Ⅰ，低温离心，去除上清；再加入 复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清；再加入复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清，备用。
对剥离的华通氏胶组织，预留出1份组织块作为新鲜组织对照实验，培养分离制备间充 质干细胞(MSC)，取第二代细胞，用胰酶消化呈单细胞悬液，接种于6孔板中，进行接种， 每孔加入2ml完全培养基，将细胞于37℃，5％CO2培养箱中进行培养3天全量换液一次，直 到细胞达到60％融合时，分成两组培养基分别更换成脂诱导和成骨诱导培养基。每隔一段时 间用同样的培养基换一次液，成骨诱导组行半量换液，成脂诱导组全量换液。诱导14天后， 对成脂诱导的MSC进行油红O染色观察红色油滴；诱导21天对成骨诱导的MSC进行茜素红染 色，观察钙结节，并记录实验结果。
对冻存复苏的脐带华通氏胶组织同样进行MSC培养，进行成脂和成骨诱导，诱导14天后， 对成脂诱导的MSC进行油红O染色观察红色油滴；诱导21天对成骨诱导的MSC进行茜素红染 色，观察钙结节，并记录实验结果。如图4、5所示，冻存后组织可成功诱导成脂、成骨， 说明本发明所述方法冻存、复苏后的组织特性与新鲜组织无异。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方 案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权 利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这 些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims (7)

1.一种依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)脐带羊膜组织的分离及冻存：用生理盐水洗涤脐带，剪去脐带两头，再用生理盐水涮洗，撕取或剪下表面羊膜组织；用生理盐水冲洗羊膜组织，将羊膜折叠或平放于冻存袋中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心去除平衡液，然后加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅰ，转移至液氮冷冻保存；
所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加15～25wt％的乙二醇，即得；
所述玻璃化冻存液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加40～60wt％的甘油、10～20wt％的海藻糖、8～15wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
所述基础液，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
(2)脐带血管组织的分离及冻存：将上述已经剥离羊膜的脐带的动脉血管和静脉血管分离下，用生理盐水清洗，并冲洗血管以去除血管内滞留血块，然后将血管剪成长2～4cm的小段；将血管小段转移至离存管中，加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心去除平衡液，再转移至冻存管中，加入预冷至4℃～10℃玻璃化冻存液Ⅱ，每1条血管小段加入1ml的玻璃化冻存液Ⅱ，分五步导入玻璃化冻存液，导入量依次为：50μl、150μl、150μl、200μl、450μl，每步之间平衡90s；导入完成后快速封口，转移至液氮冷冻保存；
所述玻璃化冻存液Ⅱ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
(3)脐带华通氏胶组织的分离及冻存：用生理盐水充分洗涤上述剥离羊膜和血管的脐带，转移至离心管中，剪碎成1～2cm3的组织块；加入预冷至4℃～10℃的平衡液，平衡5～10min，低温离心，去除上清，再将组织块转移至冻存管中，加入预冷至4℃～10℃的玻璃化冻存液Ⅲ，转入程控降温仪，按照设定的降温程序降温至-90℃，转移至液氮冷冻保存；
所述玻璃化冻存液Ⅲ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混匀，即得；
所述步骤(3)中的降温程序为：在4℃保持8min；以1℃/min速率继续降至-10℃，保持5min；以1.5℃/min速率继续降至-40℃保持6min；以3℃/min速率继续降至-80℃保持10min。
2.根据权利要求1所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：所述低温离心的具体参数为：4℃，1300rpm离心5min。
3.根据权利要求1所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述取下的羊膜组织，每块不小于10cm2。
4.根据权利要求1所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：所述平衡液，是通过以下方法得到：向基础液中添加20wt％的乙二醇，即得。
5.根据权利要求1所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法，其特征在于：
所述玻璃化冻存液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加55wt％的甘油、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
和/或：所述玻璃化冻存液Ⅱ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、15wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，混匀，即得；
和/或：所述玻璃化冻存液Ⅲ：是通过以下方法得到：向基础液中添加10wt％的二甲基亚砜、8wt％的海藻糖、10wt％的1,2-丙二醇，5wt％的聚乙二醇，混匀，即得。
6.一种脐带组织的复苏方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)冻存的脐带羊膜组织的复苏：将利用权利要求1～5中任一项所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法冻存的脐带羊膜组织从液氮中取出，将冻存袋迅速放入37℃～42℃水浴锅中快速溶解45s～90s，然后快速转移至生物安全柜中，打开冻存袋，用镊子轻轻取出羊膜，置入离心管中，加入复苏液Ⅰ，混匀，低温离心，去除上清液；再加入复苏液Ⅱ，混匀，低温离心，去除上清液，备用；
(2)冻存的脐带血管组织的复苏：将利用权利要求1～5中任一项所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法冻存的脐带血管组织从液氮中取出，于气相中平衡5min，然后将冻存管置于37℃～42℃水浴锅中快速溶解45s～90s，快速移入生物安全柜中，打开冻存管，将血管组织吸入离心管中，分5步洗脱：先加入复苏液Ⅲ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅰ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅳ，平衡60s，取出，再加入复苏液Ⅱ，平衡60s，取出，最后加入生理盐水，平衡，备用；
(3)冻存的脐带华通氏胶组织的复苏：将利用权利要求1～5中任一项所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法冻存的脐带华通氏胶组织在液氮中取出，迅速将冻存管放入37℃～42℃水浴锅中摇晃溶解45s～90s，快速移入生物安全柜中，打开冻存管，将华通氏胶组织吸入离心管中，加入复苏液Ⅰ，低温离心，去除上清；再加入复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清；再加入复苏液Ⅱ，低温离心，去除上清，备用；
所述复苏液Ⅰ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为0.6mol/L，即得；
所述复苏液Ⅱ，为含20wt％人血白蛋白的α-MEM培养基；
所述复苏液Ⅲ，是通过以下方法得到：向基础液中添加海藻糖，添加后海藻糖浓度为1.2mol/L，即得；
所述复苏液Ⅳ，为含40wt％人血白蛋白的α-MEM培养基。
7.脐带来源的组织或细胞资源样本库的建立方法，其特征在于：利用权利要求1～5中任一项所述的依结构层次系统冻存人脐带组织的方法处理人脐带并储存。
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