CN116926001A - 血清替代物及其制备方法与应用 - Google Patents

血清替代物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血清替代物及其制备方法与应用，所述血清替代物含有胎牛或新生牛来源的血小板裂解物和血浆，可以通过对胎牛或新生牛来源的血小板血浆进行血小板裂解来制备。

Description

血清替代物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及血清替代物，及其制备方法与应用。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞是干细胞家族的成员之一，存在于多种组织，如毛囊、脐带、宫膜、脂肪等，具有多向分化潜力。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞，如成骨、成软骨及成脂肪细胞等，或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能以及免疫调节和抗炎作用的功能。
血液由液体成分血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合称为全血。离体的血液经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体即为血浆。血浆可以视为是血液的细胞外基质，主要作用为运载血细胞，运输维持生命活动所需的物质和体内产生的废物等。离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体即为血清，血清中去除了血浆中的纤维蛋白原及某些凝血因子；其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子等。一般来说，血浆与血清的区别主要在于血浆含有纤维蛋白原。血小板是血液主要的有形成分之一，在止血过程中发挥重要作用。此外，在血小板激活脱颗粒过程中，大量因子释放，参与炎性反应、组织修复。
干细胞的高效率培养一直是本领域希望解决的问题，而在细胞培养的过程中就离不开培养基。作为干细胞培养基的主要成分之一，动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要的作用。在动物血清中，牛血清的应用又是最为广泛的，所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。牛血清按采血的时期可分为胎牛血清(Fetal bovineserum)、新生牛血清(New born calf serum)、小牛血清(Calf serum)及成牛血清(Adult bovine serum)。然而，动物血清不仅价格昂贵，而且质量不可控，不同批次之间的稳定性差距较大。故越来越多的研究者开始研发血清替代物，如公布号为“CN107384856A”的专利公布了一种血小板裂解液的制备方法；公布号为“CN101486996A”的专利公布了一种非动物源性细胞培养血清替代物。已知的血清替代物均是来源于人，并且得量较少。因此，急需开发来源广泛、得率较高且安全稳定的血清替代物。
发明内容
本发明采用可控的牛血来源，保证其可追溯，执行严格的质量控制标准。并且，采用本发明提供的血清替代物制备工艺，可获得优质、安全、稳定的血清替代物产品。本发明的血清替代物产品符合《中华人民共和国药典》(2020年版)通则中新生牛血清的质量控制标准。
内容之一，本发明提供了一种血清替代物，含有血小板裂解物和血浆，所述血小板裂解物和血浆来源于胎牛或新生牛。一些实施方式中，所述血清替代物由胎牛或新生牛来源的血小板裂解物和血浆组成。优选地，所述血清替代物用本发明制备血清替代物的方法制得。
另一方面，本发明提供了一种制备血清替代物的方法，所述方法包括对胎牛或新生牛来源的血小板血浆进行血小板裂解。
一些实施方式中，所述方法还包括由胎牛全血或新生牛全血分离去除血小板之外的血细胞以获得所述血小板血浆；以及，可选地，在血小板裂解之后包括除菌级过滤步骤。
一些实施方式中，采用离心法分离去除血小板之外的血细胞，优选差速离心，优选在低温条件下进行。
一些实施方式中，血小板裂解采用冻融法。
本发明还提供了本发明血清替代物在培养干细胞中的应用，以及在诱导干细胞分化中的应用。所述干细胞例如间充质干细胞，例如人毛囊间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人宫膜间充质干细胞等。本发明的血清替代物相比现有动物血清能够显著提高干细胞例如间充质干细胞的增殖能力和分化潜能。
附图说明
图1显示了含有胎牛血清和含本发明胎牛血清替代物的培养基分离培养原代脐带间充质干细胞获得的细胞收获量。
图2显示了含有胎牛血清和含本发明胎牛血清替代物的培养基分离培养原代毛囊间充质干细胞获得的细胞收获量。
图3显示了含有胎牛血清和含本发明胎牛血清替代物的培养基中诱导的毛囊间充质干细胞成脂分化。
具体实施方式
本文中，除非特别指定，本文述及的各项技术特征，例如含量、步骤、条件参数等等，它们的组合方式不限于本文具体描述的各个实施方式和实施例，它们其他的任意组合方式同样属于本发明的范围。
本文中，除非特别指定，以两端值表示的数值范围视同具体公开了两端值之间的所有实数及其两两组合而成的数值范围。此外，除非特别指定，当对同一参数具体描述了多个可选数值范围或数值时，这些端值和数值可以任意组合，由此得出的范围只要包含在具体描述的最大连续范围之内则均属于本发明的范围。
本文中，除非特别指定，所述数值或数值范围不论是否带有前行词“约”均涵盖相关领域技术人员能够理解的与该数值或数值范围等同的约略范围，例如该数值或端值±10％的范围，亦可是±5％、±3％、±2％、±1％或±0.5％的范围。
本文中，除非特别指定，所有科学和技术术语的含义均符合本领域、尤其干细胞、间充质干细胞、培养基领域公知或已知的含义，例如教科书、试验手册或现有技术文献中记载的含义。
本文中，“含有”之类开放式表达表示不排除未写明的元素，例如就组合物而言的其他组分和就方法而言的其他步骤；“由……组成”之类封闭式表达表示仅包括写明的元素，但是，就组合物而言，可以带有以通常含量存在的杂质，就方法而言可以包括没有写明但实质性必然发生的步骤。开放式表达方式涵盖且视为具体公开了以封闭式表达来限定的情形。
本文中，以数字或字母例如“a”、“b”、…，“I”、“II”、…，“(第)一(1)”、“(第)二(2)”编排的特征例如步骤，除非特别指明，没有排序的意义，仅有区分或计数的意义。
本文中，除非特别说明，除非要素间不可兼容，连词“或”与“和/或”同义，表示允许包括并列事项或情形中的一项或多项。例如，本文中，“胎牛或新生牛来源”表示既可以是胎牛来源、也可以是新生牛来源，包括两种来源同时存在的情形。
本发明提供了一种血清替代物，其含有胎牛或新生牛来源的血小板裂解物和血浆。
本文中，胎牛或者新生牛的认定是本领域技术人员所熟知的，通常根据牛的年龄及是否进食来界定。例如，胎牛可为怀孕母牛体中5-8月龄的牛胚胎，新生牛可为出生14小时内且未进食的牛仔。此外，小牛可为出生1岁以内的牛，成年牛则可为1岁以上的牛。
一些实施方式中，血清替代物由血小板裂解液和血浆组成，但不排除以通常含量存在的杂质。
优选地，所述血清替代物用后文所述本发明制备血清替代物的方法制得，即，所述血清替代物可由胎牛或者新生牛来源的血小板血浆经血小板裂解制得。
为此，本发明提供了一种制备血清替代物的方法以及由此制得的血清替代物，所述方法包括对胎牛或新生牛来源的血小板血浆进行血小板裂解。
本发明中，“血小板血浆”指含有血小板而不含其他血细胞例如红细胞和白细胞的血浆，包括例如富血小板血浆和浓缩血小板等。例如，血小板血浆可以通过从全血分离去除血小板之外的血细胞例如红细胞和白细胞来制取。
本发明中，用于制备血小板血浆的全血优选可采自胎牛或新生牛。在采集牛血前，可在采集容器中加入常规抗凝剂使得牛血不凝固。本领域中，常用的抗凝剂有草酸盐、肝素、枸缘酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等。在一个优选的实施方式中，所述抗凝剂为肝素钠。在采集牛血时，应注意采用部位需要进行消毒，采血所用的注射器和试管必须保持清洁干燥。
为了制取血小板血浆，实施方式之一可利用各血细胞和血浆的密度不同，采用离心技术分离不同组分后获得目标组分。在本发明中，采用离心分离制取血小板血浆时，收集离心后的上清液以获取血小板血浆。
常用的离心技术包括沉淀离心、差速离心、密度离心等。差速离心通过分级提高离心转速或高速与低速离心交替进行，使具有不同沉降系数的物质从混合液中分批沉降至管底。一些实施方式中，为了提高产率，可进行多次离心，优选改变转速的差速离心，一次或多次低速离心后对移除了上清的剩余部分再进行一次或多次高速离心，合并收集的上清液。优选地，可采用差速离心的方式分离去除除血小板之外的其他血细胞(后文简称“其他血细胞”)。
优选地，为了避免制备过程中样品失活，优选实施方式之一采用低温离心(例如低温差速离心法)来分离去除其他血细胞。例如，所述低温可以是10℃以下、或者5℃以下，例如为4℃或更低。
离心速度可用不同单位来表示。低速离心时转速常用每分钟旋转次数rpm表示，高速离心时转速则用“g”或“xg”表示。其中，“g”和“xg”均代表重力加速度的倍数，两者同义，可相互替换，例如，1000g与1000xg同义。相对离心力表示离心力与重力的比值，等于“g”或者“xg”之前的数值，例如，离心力1000g或1000xg，即相对离心力为1000。
本发明可采用一次或多次离心速度相同或不同的离心分离去除其他血细胞，离心速度可以是400g～2100g、例如800g～2000g、400g～1000g、1800g～2100g，离心时间可以是10～30分钟、例如15～20分钟、10～25分钟、15～30分钟。一些实施方式中，离心分离去除其他血细胞包括至少一次400g～1000g、时间为10～25分钟的离心分离，优选在低温下进行，例如4℃。
一些实施方式中，采用差速离心来去除其他血细胞。一些实施方式中，所述差速离心包括至少一次低速离心和其后的至少一次高速离心。此类实施方式中，设置一个较低速的离心条件，使得血细胞和血浆初步分离并将保留血小板溶于血浆之中，由此得到保留了血小板的血小板血浆上清层和富集了其他血细胞的沉积层，凡能达到如此效果的离心条件均可作为本发明的“低速离心”条件。例如，所述低速离心的转速可为400g～1000g，时间可为10～25分钟，优选低温下进行，例如4℃。例如，所述离心的转速可为400g、600g、800g、1000g；所述时间可为10分钟、15分钟、20分钟、25分钟。优选实施例之一中，所述低速离心的转速为400g、时间为15分钟、温度为4℃；另一优选实施例中，低速离心的转速为800g、时间为10分钟、温度为4℃。若非立即使用，可将各轮低速离心分离得到的上清液各自或合并后冷冻保存，例如﹣80℃至﹣4℃冷冻保存。
同时，此类实施方式中，设置一个较高速的离心条件，对低速离心后移除上清后的剩余部分进行再离心，使得未分离完全的血浆和血细胞二次分离，凡能达到如此效果的离心条件均可作为本发明的“高速离心”条件。由此可制得完全分离的血浆。通常认为，完全分离的血浆中不含有血小板。
本文中，“不含”某物质的表述包括本领域技术人员能够理解的基本不含该物质的情形，即该物质仅以检测限以下、标准以下和/或不影响该物质所在产品(例如本发明的血清替代物)的目标用途和目标效果的微小量存在。
例如，所述高速离心的转速可以是1800g-2100g，时间可以是15-30分钟，优选低温下进行，例如4℃。例如，所述离心的转速可为1800g、1900g、2000g、2100g；所述时间可为15分钟、20分钟、25分钟、30分钟。优选实施例之一中，高速离心的转速为2000g、时间为20分钟、温度为4℃；另一优选实施例中，高速离心的转速为2100g、时间为15分钟、温度为4℃。若非立即使用，可将各轮高速离心所获得的上清各自或合并后冷冻保存，例如-80℃至﹣4℃冷冻保存。
裂解血小板可采用反复融化和冷冻(冻融)的方式。冻融法可使得溶于血浆中的血小板完全破裂，其内容物流出。冻融循环的次数没有限制，只要能够实现上述完全破裂的效果。冻融循环次数的计数可以从冻存样品的首轮融化后再冷冻起算，也可以从非冻存样品的首轮冷冻后再融化起算。本发明实施方式之一中，冷冻保存的血小板血浆上清取出后，从首轮融化后再冷冻起算，冻融次数为3-7，可为例如3次、4次、5次、6次、7次，优选实施例之一中为6次，另一优选实施例中为4次。
冷冻时，要确保清液完全冷冻，冷冻的时间和温度根据实际情况而定。优选地，所述冷冻的时间不少于8小时。例如冷冻的时间可为8小时、9小时、10小时、12小时、15小时。优选地，冷冻的温度不高于-20℃。例如冷冻的温度可为-20℃、-25℃、-40℃、-45℃、-60℃、-80℃、-100℃、-150℃。优选实施例之一中，所述冷冻的温度为-80℃，另一优选实施例中为-45℃。
优选地，融化时确保瓶中清液形成冰水混合物状态，例如呈现指甲盖大小的碎冰块，且温度不升温。在一个优选的实施方式中，所述融化物的温度为0℃。
本发明中，因反复冻融的目的是裂解血小板，并且低速离心获得的上清液中富含血小板。故，在一个优选的实施例中，将低速离心获得的上清液反复冻融后，再与高速离心获得的上清混合，进行后续操作。为了操作简便，也可将低速离心和高速离心的上清混合后再进行后续操作。故，在另一个优选的实施例，将低速离心和高速离心获得上清液混合后再进行反复冻融。
本发明中，反复冻融后还可以包括除菌级的过滤步骤。除菌级过滤指能够达到除菌效果的过滤，其目标效果和/或实际效果不一定仅限于除菌，例如，还可以包括除去细胞碎片等其他杂质。优选实施例之一选用0.22μm的滤膜进行过滤。
本发明还提供了本发明血清替代物在培养干细胞中的应用。本发明还提供了本发明血清替代物在诱导干细胞分化中的应用。干细胞可包括胚胎干细胞、成体干细胞、(诱导)多能干细胞等。多能干细胞如间充质干细胞，具体地，例如人毛囊间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人宫膜间充质干细胞等。成体干细胞可以是脂肪干细胞、宫膜干细胞、毛囊干细胞或者脐带干细胞。需要说明的是，本发明中术语“干细胞”不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞。在一些实施方式中，诱导干细胞分化例如可为诱导干细胞成脂分化或诱导干细胞成软骨分化。血清替代物在诱导干细胞成脂分化或者成软骨分化中显示出良好的效果。在一些实施方式中，血清替代物在培养基中的含量(体积比)为5％-15％。优选地，血清替代物在培养基中的含量(体积比)为10％。
在一个优选的实施例中，所述干细胞为间充质干细胞，例如人毛囊间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人宫膜间充质干细胞等。
实施例
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。
本文及附图中，“血替”为血清替代物的简称。
实施例1血清替代物的制备
本实施例分别采用胎牛血、新生牛血、小牛血和成牛血制备了胎牛血清替代物、新生牛血清替代物、小牛血清替代物和成牛血清替代物。其中，胎牛血为取怀孕8个月母牛体中胎牛心脏穿刺采集的牛血；新生牛血采自出生未满14小时且未进食的新生牛；小牛血采自6月龄小牛；成牛血采自18月龄成牛。牛血来源可追溯并执行严格质控指标。
牛血的采集与运输
采集牛血前，在500mL血清瓶内加入100mg肝素钠，使得肝素钠的终浓度为200mg/L；采集牛血过程中，缓慢晃动血清瓶，使得牛血和肝素钠混合均匀；采集完成后，将牛血在4℃条件下运输至血清替代物制备实验室。
血清替代物的制备
将采集到的牛血放进生物安全柜内分装；第一轮低速离心：在4℃条件下，以400g转速离心15分钟，从离心机中缓慢取出离心管，此时分为上层清液和下层沉淀，下层沉淀由靠近上层的白细胞层和位于下层的红细胞层组成，收集上层清液至250mL血清瓶中，记为A1，置于﹣80℃冻存；第二轮高速离心：将移除了上层清液的下层沉淀部分在4℃条件下，以2000g转速离心20分钟，小心吸取上层清液置于500mL血清瓶中，并标记为A2，置于﹣80℃冻存。
取出A1在室温下平衡10分钟，后置于37℃恒温水浴锅内，使得水浴锅中的水没过瓶身的三分之二，以80-100转/分钟的速度振荡使之融解，每隔10分钟观察一次，待到瓶内形成冰水混合物状态(0℃)时，立即拿出，结束融化；再次将A1置于﹣80℃超低温冰箱中冻存8小时以上以至其完全冷冻，以此记为1次冻融；如此反复冻融(即融化和冷冻)6次。
待到6次冻融结束后，将A1和A2于37℃恒温水浴锅内分别融解，后在生物安全柜内将A1和A2混合均匀；最后，经0.22μm滤膜过滤后，即制成血清替代物(简称“血替”)；将其分装于新的血清瓶内，置于﹣15℃以下温度条件冻存备用。
实施例2不同来源的血清替代物培养人毛囊间充质干细胞
获得原代人毛囊间充质干细胞
获得完整人毛囊组织，分别放置于装有10mL含牛血替的培养基的10cm培养皿中，所述含牛血替培养基分别为加有按体积计1％(v/v)青霉素/链霉素(购自碧云天生物技术研究所)+10％胎牛血替、新生牛血替、小牛血替或成牛血替的DMEM/F12培养基(购自上海源培生物科技股份有限公司)。其中，胎牛血替、新生牛血替、小牛血替和成牛血替由实施例1所述方法制得。使用显微镜小心将人毛囊组织放置在1.5mL EP管底部，使用移液枪，尽量吸去人毛囊组织携带的培养基，按照每根毛囊8μL加入酶解液。将装有酶解细胞悬液的EP管放入37℃恒温金属浴中酶解3小时，设置转速为600rmp(次/分钟)。
所用酶解液混合以下组分配制：0.05mL 20mg/mL胶原酶Ⅳ(Sigma-Aldrich公司)，0.05mL 40mg/mL DispaseⅡ(Sigma-Aldrich公司)，0.01mL 500mM CaCl2(Sigma-Aldrich公司)，0.89mL HBSS(平衡盐溶液，上海源培生物科技股份有限公司)。
酶解结束后，镜下可见毛囊的外根鞘已完全酶解，毛干部分不能完全酶解。使用20-200μL移液枪轻柔吹打EP管20次，将酶解液完全混合。静置1分钟待未酶解毛干沉入EP管底部，吸取上层酶解悬液，即为原代(P0代)间充质干细胞。加入等量的AO/PI试剂混合均匀，使用Countstar荧光计数仪计数，自动细胞计数仪的使用详见《Countstar Rigel S2型自动细胞计数仪使用标准操作规程》WWSC-0024-CC。
获得第一代人毛囊间充质干细胞
预先分别取出2mL如上所述含10％胎牛血替、新生牛血替、小牛血替或者成牛血替+1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基置于各离心管底部。将细胞筛置于六孔板的孔上方，按照5根毛囊/孔的量吸出5根毛囊对应的40μL酶解后细胞悬液通过100μm细胞筛，后用原枪头分别吸取以上离心管中预先准备好的含各种牛血替的培养基通过细胞筛，重复3次。使用20-200μL移液枪分别吸取200μL以上离心管中预先准备好的含各种牛血替的培养基冲洗EP管后再通过细胞筛，重复3次，最后分别将以上离心管中预先准备好的剩余的含各种牛血替的培养基通过细胞筛。将六孔板放入37℃5％CO2细胞培养箱中培养。静置培养5天之后观察拍照和换液。在第5天和第7天换液。
培养至10-12天，观察六孔板内细胞密度达80％以上即可弃去培养基，在六孔板中加入0.5mL TrypLE后置于常温消化3min。使用移液管向各培养瓶中对应加入0.5mL如上所述分别含有10％胎牛血替、新生牛血替、小牛血替或者成牛血替+1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基终止消化，接种后得到第一代(P1代)人毛囊间充质干细胞。
加入等量的AO/PI试剂混合均匀，使用Countstar荧光计数仪计数，自动细胞计数仪的使用详见《Countstar Rigel S2型自动细胞计数仪使用标准操作规程》WWSC-0024-CC。其中，扩增倍数＝传代收获细胞数/接种数。本实施例中，严格按照5000细胞/cm2的密度进行传代，一个六孔板的面积为10cm2，即一个六孔板每次接种0.5×105个细胞，则扩增倍数计算公式为“扩增倍数＝每次收获的细胞数/(0.5×105)”。
按照上述方法，取两个不同供体来源的毛囊组织，P0代和P1代所获得的细胞收获量及扩增倍数如下表1。
表1胎牛血替、新生牛血替、小牛血替或者成牛血替对毛囊细胞生长情况评估
以上显示，胎牛血替和新生牛血替用于培养基可显著增强间充质干细胞原代细胞和传代细胞的增殖能力，并且，胎牛血替略胜于新生牛血替。
实施例3血清替代物的制备
本实施例中所述牛血为胎牛血。其中，胎牛血是取怀孕8个月母牛体中胎牛心脏穿刺采集的牛血。
牛血的采集与运输
采集牛血前，在500mL血清瓶内加入100mg肝素钠，使得肝素钠的终浓度为200mg/L；采集牛血过程中，缓慢晃动血清瓶，使得牛血和肝素钠混合均匀；采集完成后，将牛血在4℃条件下运输至血清替代物制备实验室。
血清替代物的制备
将采集到的牛血放进生物安全柜内分装；第一轮低速离心：在4℃条件下，以800g转速离心10分钟，从离心机中缓慢取出离心管，此时分为上层清液和下层沉淀，下层沉淀由靠近上层的白细胞层和位于下层的红细胞层组成，收集上层清液至250mL血清瓶中，记为A1，置于4℃保存；第二轮高速离心：将移除了上层清液的下层沉淀部分在4℃条件下，以2100g转速离心15分钟，小心吸取上层清液置于500mL血清瓶中，并标记为A2，将A1和A2混合均匀，标记为A3。将A3置于﹣80℃冻存。
取出A3在室温下平衡10分钟，后置于37℃恒温水浴锅内，使得水浴锅中的水没过瓶身的三分之二，以80-100转/分钟的速度振荡使之融解，每隔10分钟观察一次，待到瓶内形成冰水混合物状态(0℃)时，立即拿出，结束融化；再次将A3置于﹣45℃超低温冰箱中冻存12小时以上以至其完全冷冻，以此记为1次冻融；如此反复冻融(即融化和冷冻)4次。
待到4次冻融结束后，将A3置于37℃恒温水浴锅内融解。最后，经0.22μm滤膜过滤后，即制成血清替代物(血替)；将其分装于新的血清瓶内，置于﹣15℃以下温度条件冻存备用。
实施例4血清和血清替代物在培养原代人间充质干细胞中的比较
血清和血清替代物在培养原代人脐带间充质干细胞中的比较
获取完整的人脐带组织，使用大手术剪刀剪掉脐带两端各1cm，然后多次漂洗以除去血液，用小剪刀沿仅脐静脉处剪开外羊膜层，用组织镊沿小口处钝性分离，将羊膜层完全撕开，摊平，撕除静脉和动脉。
将去除血管的组织转移至装有10mL消化酶的50mL离心管中，使用大手术剪刀剪碎组织，组织块剪至1mm3左右，封口膜封口后，转移至37℃振荡摇床，转速60-80次/min，振荡消化2-3小时。
所用消化酶按照以下配方配制：20mg/mL胶原酶Ⅳ(Sigma-Aldrich公司)，40mg/mLDispaseⅡ(Sigma-Aldrich公司)，500mM CaCl2(Sigma-Aldrich公司)20mg/mL透明质酸酶(北京索莱宝科技有限公司)，50mM HEPES(缓冲剂，BBI Life Science)。
酶解完成后，用75％乙醇对试管表面消毒后，转移至生物安全柜中加入30mL平衡盐溶液HBSS，稀释混匀，使用100μm细胞过滤筛网过滤。
将获得的过滤液分装至15mL离心管，每个离心管分装10mL左右过滤液，400g常温离心6分钟。离心完成后缓慢去除上清，各加入1mL 10％胎牛血替(实施例3制备)+1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(购自上海源培生物科技股份有限公司)重悬沉淀细胞，合并至一管后400g离心6分钟。弃去上清，1mL 10％胎牛血替(实施例3制备)+1％青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基(购自上海源培生物科技股份有限公司)重悬，得到原代间充质干细胞。加入等量的AO/PI试剂混合均匀，使用Countstar荧光计数仪计数，自动细胞计数仪的使用详见《Countstar Rigel S2型自动细胞计数仪使用标准操作规程》WWSC-0024-CC。统计原代脐带间充质干细胞的细胞收获量。
用胎牛血清(购买自依科赛生物科技(太仓)有限公司)替换胎牛血清替代物(实施例3制备)，重复进行上述实验，分离培养得到原代脐带间充质干细胞，统计细胞收获量。结果见图1。
血清和血清替代物在培养原代人毛囊间充质干细胞中的比较
如实施例2所述方法获得原代人毛囊间充质干细胞，分别用含有10％胎牛血清(购买自依科赛生物科技(太仓)有限公司)和10％胎牛血清替代物(实施例3制备)的DMEM/F12培养基分离培养获得原代人毛囊间充质干细胞，统计细胞收获量。结果见图2。
图1和图2显示：不论是人脐带间充质干细胞，还是人毛囊间充质干细胞，胎牛血清替代物用于培养基能增强原代细胞增殖能力、提高原代细胞生长量。
实施例5血清和血清替代物培养干细胞分化能力的比较
将制备得到的胎牛血清替代物(实施例3制备)以及商用胎牛血清(购买自依科赛生物科技(太仓)有限公司)如下所述用于培养诱导细胞分化。
成脂分化并染色：
首先，进行毛囊间充质干细胞铺板。将12孔板中的2孔用明胶处理后，室温或者置于细胞培养箱内晾干15分钟。将传代收获的毛囊间充质干细胞按细胞浓度，取2.5×105个细胞于15mL离心管中，加入含有10％实施例3制备得到的胎牛血清替代物或10％商用胎牛血清+人间充质干细胞无血清培养基(购自TBD生物制品科技有限责任公司)至总体积为2.5mL，即终浓度为1.0×105个细胞/mL，轻轻上下颠倒8次混匀。立即将混匀后的毛囊间充质干细胞铺到包被好的12孔板的两个孔中，每孔1mL细胞混悬液，摇晃5次后于显微镜下观察混合均匀，37℃培养箱中培养。
接着，进行成脂诱导分化。待到铺板的毛囊间充质干细胞生长至90-100％融合时，于超净台中吸弃孔内培养基，加入1mL毛囊间充质干细胞成脂诱导分化培养基(MesenCultAdipogenic Differentiation Medium(Human)，购买自STEMCELL Technologies)。每隔3天吸弃旧培养基，更换新的诱导分化培养基，培养基使用前需放入37℃水浴锅中预热15分钟。
最后，用油红O染色。成脂诱导分化第十四天，吸弃孔内培养基，加入1mL PBS，前后左右各晃动3次，吸弃PBS；每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛固定液，前后左右各晃动3次使孔底完全被浸润，室温静置15分钟；吸弃固定液，加入1mL PBS，前后左右各晃动3次，吸弃PBS；每孔加入0.4mL新鲜配置的油红O染液，前后左右各晃动3次使孔底完全被浸润，室温静置8分钟；加入1mL异丙醇后晃动浸润后吸弃；加入1mL PBS晃动3次后吸弃；加入0.1～0.2mL PBS观察染色情况。成脂肪结果见图3，成脂率(％)结果见表2。
表2血清替代物和商用血清培养干细胞诱导成脂率(％)
由上表2可知，相较于商用胎牛血清，胎牛血清替代物用于培养基能显著增强毛囊间充质干细胞的成脂能力。
成软骨分化并检测其相关基因表达：
首先，进行诱导分化培养。将人毛囊间充质干细胞分别用含有10％实施例3制备得到的胎牛血清替代物或10％商用胎牛血清+人间充质干细胞无血清培养基(购自TBD生物制品科技有限责任公司)重悬，调整细胞浓度为1×107个细胞/mL。于超净工作台中将上述细胞悬液按15μL/滴的量加在10cm培养皿盖内表面，在培养皿底部加入5mL PBS保湿，小心将滴有细胞悬液的皿盖扣好，静置于细胞培养箱中培养24小时，皿盖上的细胞悬滴聚集成球状。用巴氏吸管小心将微球转移至含有1mL成软骨分化诱导培养基(MesenCult ACFChondrogenic Differentiation Basal Medium，购买自STEMCELL Technologies)的低吸附二十四孔板中。每隔3天更换新的成软骨诱导分化培养基1-1.5mL。在第3天收集细胞球于1.5mL离心管中。用1mL PBS清洗2遍，吸尽PBS，每管加入50μL Trizol裂解液(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)，使用高速组织研磨器研磨细胞微球15秒，至微球碎裂成小碎片，每管再加入950μL裂解液，枪头反复吹打5次，涡旋30秒，至微球完全裂解，无肉眼可见微粒。
接着，检测成软骨分化相关基因表达。先提取总RNA，逆转录成cDNA，然后qPCR检测基因表达。
在细胞微球样品的裂解液中，加入100μL BCP(1-溴3-氯丙烷)，涡旋仪上混匀15秒，冰上静置5分钟，4℃离心12000rpm 15分钟；小心拿出EP管，立即轻轻吸取约500μL上层水相于新的1.5mL RNase-free EP管中，加入等体积异丙醇，涡旋混匀，-80℃冷冻30分钟以上；4℃离心12000rpm，20分钟，弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，上下颠倒清洗沉淀；4℃离心12000rpm，5分钟，弃上清，开盖室温晾干沉淀，加入15-20μL的DNase/RNase Free H2O，冰上静置5分钟，在涡旋仪上混匀并短暂离心，使沉淀完全溶解；取1μL总RNA溶液测定RNA浓度，记录检测结果并取1μg RNA进行后续逆转录操作。设置逆转录条件为25℃10分钟，42℃30分钟，85℃1分钟，将上述总RNA逆转成cDNA。制备引物及相应qPCR体系(PerfectStartGreen qPCR SuperMix)，检测与成软骨分化相关基因的表达情况(“人间充质干细胞体外成软骨分化能力综合评价策略研究”，张可华等，中国新药杂志，2017,26(18)，2196-2203)。由此得到含有胎牛血清替代物或者商用胎牛血清的培养基培养的人毛囊间充质干细胞中，上调基因占成软骨分化相关总基因的比例，结果如下表3所示。
表3上调基因占成软骨分化相关总基因的比例(％)
诱导分化天数 胎牛血清替代物 商用胎牛血清
3天 29.04 26.09
表3提示，与商用胎牛血清相比，胎牛血清替代物用于培养基可增强成软骨分化相关基因表达，表明增强成软骨分化。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims (10)

1.一种血清替代物，其特征在于，所述血清替代物含有血小板裂解物和血浆，所述血小板裂解物和血浆来源于胎牛或新生牛；优选地，所述血清替代物由血小板裂解物和血浆组成；优选地，胎牛为怀孕母牛体中5-8月龄的牛胚胎，新生牛为出生14小时内且未进食的牛仔。
2.如权利要求1所述的血清替代物，其特征在于，所述血清替代物是由血小板血浆经血小板裂解制得的。
3.如权利要求2所述的血清替代物，其特征在于，所述血小板血浆通过从胎牛或新生牛的全血分离去除血小板之外的血细胞制得；可选地，还具有以下一项或多项特征：
所述胎牛或者新生牛的全血是经过抗凝处理的；
所述分离采用离心法，优选低温离心；所述离心优选差速离心；
所述血小板裂解采用冻融法。
4.一种制备权利要求1所述的血清替代物的方法，其特征在于，所述方法包括对胎牛或新生牛来源的血小板血浆进行血小板裂解。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：
a)由胎牛全血或新生牛全血分离去除血小板之外的血细胞以获得所述血小板血浆；优选地，所述胎牛全血或新生牛全血是经过抗凝处理的；
b)可选地，在血小板裂解之后，进行除菌级过滤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤a)中，采用离心法分离去除血小板之外的血细胞，优选低温离心；优选地，所述离心分离的速度为400g～2100g、例如400g～1000g，1800～2100g，离心时间为10-30分钟、例如10-25分钟，15-30分钟；优选地，所述低温为10℃以下，或者5℃以下。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述离心法为差速离心法，包括至少一次能够得到血小板血浆上清层和富集了除血小板之外其他血细胞的沉积层的低速离心和至少一次使得经所述低速离心未分离完全的血浆与血细胞二次分离的高速离心，并且包括在血小板裂解之前合并收集的上清液和/或在血小板裂解之后并入高速离心所得的上清液；
优选地，所述差速离心包括至少一次离心速度为400g～1000g，时间为10～25分钟的低速离心；和
至少一次离心速度为1800g～2100g，时间为15-30分钟的高速离心。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述血小板裂解采用冻融法；优选地，所述冻融法具有一项或多项以下特征：
冻融次数为3-7次；
冷冻的时间不少于8小时；
冷冻的温度不高于﹣20℃，优选地，所述冷冻的温度为-80℃；
融化物的温度为0℃。
9.如权利要求1-3任一项所述的血清替代物在培养干细胞中的应用，所述干细胞不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞；优选地，所述干细胞为间充质干细胞；更优选地，所述干细胞选自人毛囊间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人宫膜间充质干细胞。
10.如权利要求1-3任一项所述的血清替代物在诱导干细胞分化中的应用，所述干细胞不包括由受精后超过14天或曾经历体内发育的人胚胎分离或获取的细胞；优选地，所述干细胞为间充质干细胞；更优选地，所述干细胞选自人毛囊间充质干细胞、人脐带间充质干细胞和人宫膜间充质干细胞；较佳地，所述分化可为例如成脂分化或成软骨分化。
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