CN101486996B - 一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用 - Google Patents

一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用 Download PDF

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本发明提供了一种非动物源性细胞培养血清替代物(PLT)及其应用，所述PLT由如下方法制备得到：取3～5体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400g离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、3000～5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物。本发明的有益效果主要体现在：利用PLT作为胎牛血清替代物用于细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他人源细胞的扩增培养。

Description

一种非动物源性细胞培养血清替代物及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血清等的替代物在细胞培养中的应用。
(二)背景技术
在常规的细胞培养、扩增过程中，动物源性血清如胎牛血清(FBS)是细胞扩增必须的添加成分。
再生医学的细胞治疗手段中，临床使用的种子细胞不仅有数量要求，并且需要保证其安全有效，动物源性血清参与细胞培养虽然能满足数量需求，却给临床治疗带来了不安全隐患。而自体来源的血清无论获得及使用都有诸多不便，无法达到使细胞快速扩增的效果，也无法满足临床细胞治疗对于细胞数量的需求。
(三)发明内容
本发明目的是一种非动物源性细胞培养血清替代物及其作为胎牛血清等的替代物在细胞培养中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种非动物源性细胞培养血清替代物，由如下方法制备得到：取3～5体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，300～400g离心，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-10℃以下冷冻保存备用，使用前30～37℃解冻、3000～5000g离心去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物，以PLT表示。
血液：由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合称为全血。血浆：离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，即血浆。血清：离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，即血清。粗略的说，血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋白元。血沉棕黄层富含血小板，是全血经重离心获得的沉淀部分，上清部分即为血浆。
具体的，所述非动物源性细胞培养血清替代物由如下方法制备得到：取4体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，341g离心6min，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-30℃冷冻保存备用，使用前37℃解冻、5000g离心5min去除血小板膜碎片，既得所述非动物源性细胞培养血清替代物，即PLT。
本发明还涉及所述的非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物在细胞培养中的应用。
所非动物源性细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物可用于培养间质干细胞、人软骨细胞、人肌腱细胞或皮肤人成纤维细胞等常规细胞的培养。所述培养仅仅是以PLT替代胎牛血清，其他参数可按照本领域常规方法进行。
所述PLT在细胞培养基的用量可参照胎牛血清用量，优选的，本发明中所述的应用为：在DMEM培养液中添加10％体积的PLT，作为待用培养基基本组分，用于细胞培养，培养基中其他附加组分，如肝素、双抗等，按常规用量即可。
本发明方法能够避免使用动物源性血清，避免了异种添加物的高危险性；而制备及利用人血小板溶血产物(HPL)作为血清替代物进行细胞培养，不仅能够刺激细胞在短期内大量扩增，还能够维持干细胞的多向分化潜能，不影响细胞质量。
这种细胞培养及扩增方法，不仅有利于加速实验研究进程，更有利于缩短临床使用周期。
本发明的有益效果主要体现在：利用PLT作为胎牛血清替代物用于细胞培养，能够免除细胞培养中的动物源性成分，加速细胞倍增，从而满足临床安全和缩短手术周期需求，不仅适用于间质干细胞，亦适用于其他人源细胞的扩增培养。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：PLT获得方法具体操作步骤
(1)采全血(450ml+45ml)，至血袋(枸橼酸盐磷酸盐右旋糖血袋)；
(2)22℃静置16小时后，血液离心(4250g，13min，22℃)，分离红细胞和血小板，得到血沉棕黄层和血浆。仪器(CompomatG3，NPBI，Amsterdam，the Netherlands))；
(3)为避免MSC引发凝集反应；四单位的O型血沉棕黄层混合一单位的AB血浆，轻柔离心(341g，6min，22℃)作为一个单位的富含血小板血浆(PRP)。PRP转移入贮存袋，过滤除去白细胞。-30℃冷冻保存。使用前，37℃解冻离心(4000g，15min)，去除PLT膜碎片，降低引发异体之间的免疫应答的危险。
(4)上清液即为PLT。
实施例2：PLT作为血清替代物培养间质干细胞
培养基配制：500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT，1000U肝素，1mmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL)；
原代细胞培养：
1.抽取5ml骨髓，肝素抗凝；利用PLT培养基进行差速贴壁法培养；
2.36小时后首次换液，75cm2细胞培养瓶添加15ml培养基。
3.每2～3天换液一次；第5～6天胰酶消化计数，此为原代细胞获取过程；
细胞扩增：
1.初始以3×105个细胞种植，每隔2天换液一次，细胞密度到达90％以上即可传代。
2.胰酶消化，每瓶以3×105个细胞密度种植，2～3天换液一次；
3.经过11～14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3×108个细胞。
而常规以添加胎牛血清的培养基进行培养，由初始3×105个细胞培养至获得不小于3×108个细胞，通常需要14天以上。
实施例3：PLT作为血清替代物培养人软骨细胞
培养基配制：500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT，1000U肝素，1mmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL)；使用75cm2培养瓶扩增细胞；
细胞扩增：
1.以1×106个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90％以上传代。
2.胰酶消化传代，种植密度为1.5×106/瓶；隔2～3天换液；
3.经过11～14天扩增及传代过程，总共可收获不小于4.5×108个细胞。
软骨细胞的异位成软骨培养：
1.收集106个以上软骨细胞；
2.用0.25ml胶原凝胶、0.25ml软骨基质混悬，使之成凝胶团块；
3.将团块植入裸鼠背部皮下，4周后取出观察，组织学切片检测，呈典型软骨组织结构。
实施例4：PLT作为血清替代物培养人肌腱细胞
培养基配制：500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT，1000U肝素，1mmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL)；使用75cm2培养瓶扩增细胞；
细胞扩增
1.以5×105个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90％以上传代。
2.胰酶消化传代，种植密度为8×105/瓶；隔2～3天换液；
3.经过11～14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3×108个细胞。
实施例5：PLT作为血清替代物培养皮肤人成纤维细胞
培养基配制：500mlDMEM基础培养基中添加50mLPLT，1000U肝素，1mmol谷氨酰胺，5mL双抗(青霉素与链霉素浓度各为10000U/mL)；使用75cm2培养瓶扩增细胞；
细胞扩增
1.以5×105个细胞/瓶种植，每2天换液一次，细胞密度到达90％以上传代。
2.胰酶消化传代，种植密度为8×105/瓶；隔2～3天换液；
3.经过11～14天扩增及传代过程，总共可收获不小于3×108个细胞。

Claims (4)

1.一种细胞培养血清替代物，其特征在于所述细胞培养血清替代物由如下方法制备得到：取4体积单位O型的血沉棕黄层和1体积单位AB型的血浆混合，341g离心6min，取上清液作为一个体积单位的富含血小板血浆；将富含血小板血浆过滤除去白细胞，-30℃冷冻保存备用，使用前37℃解冻、5000g离心5min去除血小板膜碎片，即得所述细胞培养血清替代物，即PLT。
2.如权利要求1所述的细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物在细胞培养中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所细胞培养血清替代物作为胎牛血清替代物用于培养间质干细胞、人软骨细胞、人肌腱细胞或皮肤人成纤维细胞。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：在DMEM培养液中添加10％体积分数的PLT，用于细胞培养。
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