JP2022501322A - 機能的な間葉系幹細胞の富化集団を得る方法、それによって得られる細胞、およびその細胞を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
a.ジメチルスルホキシドを5%から10%含む凍結保護培地中に5x106から10x106細胞/mlの濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁する工程と、
b.骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも24時間にわたって、最初に液体窒素中で、−70℃から−90℃に冷却して、凍結保存する工程と、
c.以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と;
c1.1分から5分間、温度を35〜39℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
c2.適切な培養培地で試料を初期試料の体積の10から30倍に希釈する工程と、
c3.試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、そして間葉系幹細胞のペレットを適切な培養培地において再懸濁する工程、
c4.少なくとも70%の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
c5.工程(c4)において選択された間葉系幹細胞をプラスチック支持体上に播種し、前記間葉系幹細胞を、7.5%から10%までのCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む、適切な培養培地を用いて、1000から5000細胞/cm2の間の細胞濃度で、35〜39℃の適切な培養条件でインキュベートする工程、
c6.一定の時間間隔で、7.5%から10%までのCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、その細胞が支持体の表面の80〜100%を占める時に支持体から単離させる、工程、
d.凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な、間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程(c6)において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、2〜8℃での輸送および保管に適した培地において懸濁させる工程であって、ここで、前記2〜8℃での輸送および保管に適した培地は、6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸を0.25から1mM含む等張の培地である、工程と、を含む。
a.5%から10%のジメチルスルホキシドを含む凍結保護培地中に5x106から10x106細胞/mlの細胞濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁させる工程と、
b.骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも24時間にわたって、液体窒素中で、最初に−70℃から−90℃に冷却して、温度を下げることによって凍結保存する工程と、
c.以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と;
c1.1分から5分間、温度を35〜39℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
c2.適切な培養培地を用いて、試料を試料体積の10から30倍に希釈する工程、
c3.試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、および、適切な培養培地中に間葉系幹細胞を再懸濁させる工程、
c4.少なくとも70%の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
c5.プラスチック支持体上に工程(c4)において選択された間葉系幹細胞を播種し、7.5%から10%のCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む適切な培養培地を用いて、1000から5000細胞/cm2の間の濃度で、35〜39℃の適切な培養条件で、前記間葉系幹細胞をインキュベートする工程、
c6.一定の時間間隔で、7.5%から10%のCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、その細胞が支持体の表面の80〜100%を占める時に支持体から単離させる工程、
d.凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程(c6)において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、2〜8℃での輸送および保管に適した培地中に懸濁させる工程であって、ここで、前記2〜8℃での輸送および保管に適した培地は、6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸を0.25から1mMを含む等張の培地である、工程と、を含む。
− プラスチックに対する接着性を示し、および、
− 少なくとも70%の生存率を呈し、および、
− CD90、CD166、CD73、およびCD105の90%以上の発現を呈し、および、
− CD14、CD34、CD45の10%以下の発現、および10%以下のHLA−DRの発現を呈し、および、
− 染色体異常の特徴を持たず、および、
− 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を呈する。
i. プラスチック支持体において適切な培養培地でエクスビボ骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ii. 酵素溶液を添加し、および、使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
iii. 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
iv. 遠心分離処理し、および、上澄み液を廃棄する工程と、が行われる。
I. 少なくとも30mlのフィルタリングされた骨髄穿液のエクスビボ試料を提供する工程、
ii. エクスビボ骨髄穿刺液を抗凝血剤にさらす工程、
iii. エクスビボ骨髄穿刺液から単核細胞を選択する工程、
IV. 70%を超える生存率を伴う単核細胞を選択する工程、
V. 適切な培養培地中の、プラスチック支持体に1.5x106から2x106細胞/cm2で単核細胞を播種し、および適切な培養条件においてそれらをインキュベートする工程、
VI. 細胞増殖パーセンテージおよびプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の外観を一定の時間間隔で測定する工程、
VI.1 細胞増殖パーセンテージが60%未満である時、上澄み液を取り除いて、培養培地を替える工程、
VI.2 細胞増殖パーセンテージが80%を超えれば、プラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞の試料を単離させる工程、
VI.3 前記間葉系幹細胞を増加させ、および純化するために、2継代まで継代培養を実行し、および、増殖パーセンテージが80%以上である場合、継代培養の各々からのプラスチック支持体に接着した間葉系幹細胞を単離させる工程。
III.1 エクスビボ骨髄穿刺液試料にフィコール溶液をゆっくり加える工程と、
III.2 試料を、15から25℃にて少なくとも30分間止めることなく、300〜500gで、遠心分離処理する工程と、
III.3 適切な培養液で界面を分離させ、および、洗浄する工程と、
III.4 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
III.5 適切な培養液でペレットを洗浄する工程と、
III.6 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、
III.7 単核細胞を備えたペレットを適切な培養培地中に再懸濁させる工程と、を含む。
i. 適切な培養培地を用いてプラスチック支持体中の骨髄間葉系幹細胞試料を洗浄する工程と、
ii. 酵素溶液を添加し、使用した培養培地に適切な条件において培養する工程と、
iii. 等しい体積の培養培地を添加することにより酵素溶液を不活性化する工程と、
iv. 遠心分離処理して上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
i. プラスチック支持体中の、凍結保存され、回復された、および機能的な間葉系幹細胞試料を、適切な培地で洗浄する工程と、
ii. 酵素溶液を添加し、および使用される培養培地に適切な条件でインキュベートする工程と、
iii. 等しい体積の培養培地を添加することより、酵素溶液を不活性化する工程と、
iv. 遠心分離処理し、および上澄み液を廃棄する工程と、を含む。
− プラスチックに対する接着性を示し、および、
− 少なくとも70%の生存率を呈し、および
− CD90、CD166、CD73、およびCD105の90%以上の発現を呈し、および、
− CD14、CD34、CD45の10%以下の発現、および10%以下のHLA−DRの発現を呈し、および、
− 染色体異常の特徴を持たず、および、
− 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を持ち合わせる。
本発明は、実施例において、図および総括的なスキームと同様に、例示される。以下のスキームにおいて使用される置換基と整数は、他に指示がない限り、本発明の実施形態において定義された通りである。このセクションは、本発明についての理解を支援するために設けられるが、特許請求の範囲に記載された本発明をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。
プロトコル化された抗凝固療法の対象とされた骨髄穿刺液は、実施例の組成物を得るために使用されるMSCを得るための細胞の供給源である。骨髄穿刺液を、抽出の後、24時間以内に処理した。
実施例1において得られた、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団の機能的な特徴における低体温条件下(2〜8の℃)の3日の保管にわたる細胞の生存率に対するいくつかの組成物の影響を調査した。異なる3つの培養培地、リンガー乳酸塩溶液、SSP+血小板添加溶液、および、Hypothermosol(登録商標)−FRSを輸送用にMSCを調節するために使用した。それらの組成物を表1に示す。
1.細胞への膜のNa/K ATPアーゼを介したK+の送り込み、および、アルカリ・イオン勾配の回復を促進するために培養培地のK濃度を増加させたが、それは、温度の低下のために原形質膜のNa/K ATPaseが阻害されるため、失われる。加えて、原形質膜を安定させるために培養培地のMg2+容量を増加させた。
2.pHのよりよい維持のために緩衝能力(リン酸、クエン酸塩、および重炭酸およびHEPES)を増加させた。乳酸塩と酢酸塩の存在も代謝中に陽子生成を減少させることにより寄与した。
3.グルコース、酢酸塩、アデノシンなどの異なる代謝経路を介して作用する代謝基質を加えることにより、培養培地の栄養価は、向上された。
4.コロイド状浸透圧による細胞溶解に対抗するために、ラクトビオン酸塩、スクロース、マンニトール、またはデキストランなどの原形質膜不浸透性の浸透圧調整剤(osmolyte)を添加した。
5.最後に、グルタチオンを備えた培養培地と可溶性ビタミンEアナログの6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸(トロロックス)の相補性によって酸化防止能力を増加させた。
本発明の方法によって、実施例1において記載されているように細胞を得た直後、実施例2に従って、トロロックスを伴う等張の培地、組成物3で調製した、機能的なMSCの富化集団を含む組成物の、7人の異なるドナーに由来する、7つのバッチに関する調査を、実行し、および、一群のパラメーターを以下の目的のために評価した:
− 本発明の方法により、実施例1において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が治療における応用に適していることを証明するため、
− 実施例1において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団が、the Society for Cellular Therapy (ISCT) (Dominici et al., Cryotherapy, 2006, vol 8, No 4, 315−317)によって定義されたMSCの典型的な特徴を保護することを証明するため(Wuchter et al, Cryotherapy, 2015, 17:128−139)、および、
− 実施例1において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団中に表現型と遺伝子型の異常がないことを実証するため。
1.接着能力によって測定された細胞形態と、
2.cm2ごとの細胞の拡大(増殖)能力として測定された細胞の性能と、
3.トリパンブルーを使用して測定された細胞の生存率と、
4.CD73、CD90、CD105、およびCD166の陽性の発現と、CD14、CD34、CD45、およびHLA−DRの陰性の発現を分析する免疫表現型分析と、
5.本発明の方法によって得られた組成物の無菌性と、
6.構造的異常および遺伝異常をチェックするための細胞遺伝学の調査と、であった。
2006年、ISCTは、間葉系細胞を定義する3つの基準を提案した。第1に、これらの細胞は培養物において接着性がなければならない。第2に、CD34およびCD45などの血液生成の抗原がない状態において、CD90およびCD105抗原を発現する。および、第3に、間葉系細胞は「インビトロで」骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞へ分化することができなければならない。加えて、この集団は特徴的な表現型を示さないため、CD73、CD166の存在下やCD14とHLA−DRの欠如下などにおける、他の接着分子の存在が分析されるべきである。
生成物の無菌性評価において得られた結果は、確立された判定基準に従う。微生物の増殖(自動システム−Bact/AlertにおいてCO2産生量によって、およびヨーロッパ薬局方各条6.2.27に準拠して、検知される)は、いずれの場合にも観察されず、および、マイコプラスマの存在は、ヨーロッパ薬局方各条6.2.7に従うPCR/NATに基づく手順によっても検知されなかった。
上記すべてに加え、起こり得る薬剤の染色体異常を除外するために、実施例1において得られた機能的な間葉系幹細胞の富化集団の核型を得て、および、評価した。
試験の目的は、
− 72時間の輸送プロセスの後に本発明の方法によって得られる機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物の、無菌性、生存率、および免疫表現型を評価することと、
− 72時間の輸送プロセスを実行した後に、前記組成物のMSCがインビトロの再拡大能力、すなわち同じインビトロの増殖能力を維持すると示すこと、である。
− 輸送温度
− 細胞の生存率
− 免疫表現型の分析
− 無菌性
− 細胞が輸送プロセスの後に複製する能力を維持することを立証する増殖キネティクス試験。
輸送プロセスの後72時間、トリパンブルー色素排除法を用いて細胞の生存率を評価した。すべての試験を3回繰り返して実行した。表6は、分析されたドナーの初期の生存率、および72時間に得られた平均生存率±標準偏差を示す。
フローサイトメトリー分析は、組成物が発送された後72時間にて、試験された細胞が、すべての組成物の発現パターンにおいて、CD73、CD90、CD105、およびCD166を発現し、また、CD14、CD34、CD45、およびHLA−DRについて陰性であることを示した。表7は、組成物の発送時点、および、生成物が発送された後72時間における、フローサイトメトリーによって分析されたマーカーの発現のパーセンテージを示す。すべてのドナーは、輸送プロセスの後に間葉細胞表現型を示す。
輸送プロセスの後に培養する際、増殖キネティクス試験を異なる時間区間で細胞数を記録して実行した。これらの結果は、分析された3ドナーについて、機能的なMSCの富化集団が、72時間の輸送プロセスの後に複製の能力を維持するということを示す。
輸送のシミュレーションの後に組成物の無菌性を評価した。機能的な間葉系幹細胞の富化集団を伴う組成物を得た72時間後に、3つの細胞拡大プロセスを始めた。抗生物質を伴わない培地で11日間にわたりこれらの拡大を維持した。3つの培養のどれもが、微生物学的汚染の兆候を示さず、すべての適切な増殖キネティックスが存在し、および従って、無菌性を維持する。
1.72時間の輸送プロセスの後、本発明の方法で得られた組成物における間葉系細胞の生存率は80%以上である。
2.増殖キネティックスの調査において、組成物に含まれ、抗生物質を伴わない培養培地において維持された間葉系細胞は、輸送の後に無菌性を保つことが観察される。
3.72時間の輸送プロセス後、組成物中に含まれた間葉系細胞の表現型は、CD34、CD45、およびHLA−DRなどの典型的な血液生成マーカーがない状態におけるCD105とCD90の発現という、International Society for Cellular Therapy (ISCT)によって確立された基準を満たす。それらはまた、CD73、CD166について陽性であり、かつCD14を発現しない。前と同様陽性のマーカーについての90%以上の発現パーセンテージと、陰性のマーカーについての10%以下の発現パーセンテージがある。
4.組成物中に含まれた間葉系細胞は、72時間の低体温の輸送プロセスを実行した後に、分裂することができるため、「インビトロ」の再拡大能力を維持する。
現在の実施例は、プロセスの再現性を実証し、前記プロセスが、医薬製造品として治療において使用するために適切な規格品を提供するかどうかを、評価し、得られた生成物が一組の最終生成物仕様書に準拠することを確証することを目的とする。
本発明の方法に従って得られた組成物に含まれる間葉系幹細胞の細胞生存率プロファイルを、現在の凍結保存法と比較する。
DMSOが混入している可能性のある現在の凍結保存法におけるDMSOの影響を評価するため、DMSO存在下での間葉系幹細胞の細胞増殖プロファイルを分析した。
また、本発明の方法に従って得られた、凍結保存され、回復され、輸送調整された機能的な間葉系幹細胞を含む組成物について、解凍、回復、および、4℃で72時間輸送した後の細胞増殖も評価した(CRT)。
Claims (14)
- 治療における投与に適した、凍結保存され、回復され、および輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞富化集団を含む組成物を得るための方法であって、前記方法は、
a.ジメチルスルホキシドを5%から10%含む凍結保護培地中に5x106から10x106細胞/mlの濃度で骨髄間葉系幹細胞のエクスビボ試料を懸濁する工程と、
b.骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前の少なくとも24時間にわたって、液体窒素中で、最初に−70℃から−90℃に冷却して、凍結保存する工程と、
c.以下の工程を実行することによって、骨髄間葉系幹細胞の試料を回復させる工程と;
c1.1分から5分間、温度を35〜39℃まで次第に上昇させることにより、骨髄間葉系幹細胞の試料を解凍する工程、
c2.適切な培養培地で試料を初期試料の体積の10から30倍に希釈する工程、
c3.試料を遠心分離処理し、上澄み液を廃棄し、そして間葉系幹細胞のペレットを適切な培養培地において再懸濁する工程、
c4.少なくとも70%の生存率がある間葉系幹細胞を選択する工程、
c5.プラスチック支持体上に工程(c4)において選択された間葉系幹細胞を播種し、7.5%から10%のCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む適切な培養培地を用いて、1000から5000細胞/cm2の間の細胞濃度で、35〜39℃の適切な培養条件で、前記間葉系幹細胞をインキュベートする工程、
c6.一定の時間間隔で、7.5%から10%のCO2と少なくとも5%のウシ胎児血清を含む新鮮な適切な培養培地に交換し、および、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞を、その細胞が支持体の表面の80〜100%を占める時に支持体から単離させる、工程、
d.凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む組成物を得るために、工程(c6)において単離された、凍結保存および回復された機能的な間葉系幹細胞の富化集団を、2〜8℃での輸送および保管に適した培地中に懸濁させる工程であって、ここで、前記2〜8℃での輸送および保管に適した前記培地は、6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸を0.25から1mM含む等張の培地である、工程と、を含む、方法。 - 工程(a)の凍結保護培地はウシ胎児血清と5%から10%のDMSOを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)の凍結保護培地は、動物成分がない、無血清の、および無タンパク質の培地であって、5%または10%のDMSOを含んでいる、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)は、骨髄間葉系幹細胞の試料を、保存の前少なくとも25時間、液体窒素中で、−70℃から−90℃に、1℃/分のスピードで、凍結保存することを含むことを特徴とする、請求項1から3のいずれか1つに記載の方法。
- 工程(c6)の後、さらに、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を選択する工程(c7)を含み、前記細胞は、
− プラスチックに対する付着性を示し、および、
− 少なくとも70%の生存率を呈し、および、
− CD90、CD 166、CD73、およびCD105の90%以上の発現を呈し、および、
− CD14、CD34、CD45の10%以下の発現、および10%以下のHLA−DRの発現を呈し、および、
− 染色体異常の特徴を持たず、および、
− 骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を持ち合わせる、請求項1から4のいずれか1つに記載の方法。 - 等張の培地は、6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸0.25mMから1mMを含み、動物成分なしの、無血清、無タンパク質の培地であることを特徴とする、請求項1から5のいずれか1つに記載の方法。
- 6−ヒドロキシ−2,5,7,8−テトラメチルクロマン−2−カルボン酸を0.25mMから1mM含む等張の培地は、Na+130mM、K+4mM、Ca2+1.35mM、塩化物109mM、および乳酸塩16mMを含む第1の組成物と、Na+159mM、K+5mM、Mg2+0.8mM、塩化物77mM、リン酸二水素28mM、クエン酸塩10mM、および酢酸塩32mMを含む第2の組成物との、1:9から9:1の混合物(v/v)を含み、グルコース5mMとヒト血清アルブミン0.1%から0.5%で補充されている、請求項1から5のいずれか1つに記載の方法。
- 凍結保存され、回復され、および、輸送調整される、機能的な間葉系幹細胞の富化集団を含む請求項1から7に記載の組成物。
- 薬剤としての使用するための、請求項8に記載の組成物。
- 骨関節疾患、自己免疫疾患、および循環器疾患の、自己由来または同種異系の処置において使用するための、請求項8に記載の組成物。
- 1×106から10x106細胞/mlの細胞密度で、および50万から9000万の細胞数で投与されることを特徴とする、請求項9または10に記載の組成物。
- 骨関節疾患は、変性椎間板疾患、変形性関節症、半月板損傷、および関節リウマチからなる群から選択される、請求項10または11に記載の組成物。
- 自己免疫疾患は、紅斑性狼瘡、移植片対宿主疾患、および全身性硬化症からなる群から選択される、請求項10または11に記載の組成物。
- 心疾患は、末梢血管不全、心筋梗塞、脳卒中、および虚血からなる群から選択される、請求項10または11に記載の組成物。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012510986A (ja) * | 2008-12-05 | 2012-05-17 | リニューロン・リミテッド | 治療用細胞組成物 |
WO2018033911A1 (en) * | 2016-08-14 | 2018-02-22 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Mesenchymal cell-derived exosomes to treat neurological disorders |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101828421B1 (ko) | 2007-12-04 | 2018-02-12 | 프로테오바이오엑티브스 피티와이 엘티디 | 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절 |
JP6382323B2 (ja) * | 2014-01-30 | 2018-08-29 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | 室温での全血の安定化 |
WO2016177805A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | Mesoblast International Sàrl | Potency assay |
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Patent Citations (2)
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---|---|---|---|---|
JP2012510986A (ja) * | 2008-12-05 | 2012-05-17 | リニューロン・リミテッド | 治療用細胞組成物 |
WO2018033911A1 (en) * | 2016-08-14 | 2018-02-22 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Mesenchymal cell-derived exosomes to treat neurological disorders |
Non-Patent Citations (1)
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---|
STEM CELL RES., 2017, VOL.19, P.94-103, JPN6022041557, ISSN: 0004999295 * |
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