BR112021005257B1 - Método para obter uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, células obtidas das mesmas e composições compreendendo as mesmas - Google Patents
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Abstract
método para obter uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, células obtidas das mesmas e composições compreendendo as mesmas. método para obter uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais para transporte hipotérmico e administração local da referida população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais em terapia. finalmente, também é descrito o uso da referida população enriquecida de células- tronco mesenquimais funcionais e composições compreendendo as mesmas, obtidas pelo método descrito, no tratamento autólogo ou alogênico de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais, por tratamentos locais ou sistêmicos, e mais particularmente no tratamento de doenças osteoarticulares, tais como, doença degenerativa do disco, osteoartrite e reparação óssea; no lúpus eritematoso, doença do enxerto contra o hospedeiro e outras doenças autoimunes; na insuficiência vascular periférica e outras doenças cardiovasculares.
Description
[001] A presente invenção fornece um método para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas a partir de uma amostra ex vivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea para transporte hipotérmico e administração local da referida composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, em terapia. Finalmente, a presente invenção refere-se ao uso das referidas composições compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas pelo método descrito, no tratamento autólogo ou alogênico de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais, por tratamentos locais ou sistêmicos e, mais particularmente, no tratamento de doenças osteoarticulares, tais como, doença degenerativa do disco, osteoartrite e reparo ósseo; no lúpus eritematoso, doença do enxerto contra o hospedeiro e outras doenças autoimunes; nainsuficiência vascular periférica e outras doenças cardiovasculares.
[002] O padrão ouro da terapia avançada para osteoartrite com impacto clínico é a substituição protética. Isso é especialmente problemático em pacientes jovens, uma vez que as próteses articulares têm duração limitada, sendo também um procedimento caro, questão que justifica a exploração de novos métodos terapêuticos potencialmente mais eficazes.
[003] Há uma população de células-tronco não hematopoéticas na medula óssea denominadas células estromais progenitoras ou células-tronco mesenquimais (CTMs). Essas células são caracterizadas por sua multipotencialidade, isto é, sua capacidade de se diferenciar em outros tipos de células. As CTMs apresentam uma população de morfologia fusiforme de fibroblastos, que expressa antígenos CD73, CD90 e CD105 e apresenta ausência de antígenos hematopoiéticos, marcadores de monócitos, macrófagos e linfócitos B. Além disso, eles retêm a capacidade de diferenciação in vitro para osteoblastos, adipócitos e condrócitos quando mantidos em ambientes condicionados adequados.
[004] A infusão intra-articular de células-tronco mesenquimais (CTM), por exemplo na osteoartrite, é uma dessas novas linhas de pesquisa, pelo seu reconhecido potencial regenerativo e anti-inflamatório.
[005] Estudos com CTMs em modelos animais provaram a capacidade das referidas CTMs de sobreviver após a infusão no ambiente articular do corpo humano (tais como discos intervertebrais, joelhos, etc.) e de reparar a cartilagem de uma maneira dependente da dose.
[006] As CTMs têm, portanto, a capacidade de regenerar tecidos danificados ou destruídos, tais como, osso, cartilagem e outros tecidos. Além disso, sua capacidade de modular as reações imunológicas e controlar a inflamação foi demonstrada por sua ação sobre os linfócitos T.
[007] As CTMs podem ser obtidas de diferentes órgãos e tecidos, mas a medula óssea representa uma de suas melhores e mais acessíveis fontes.
[008] No entanto, a frequência de CTMs na medula óssea é baixa e representa apenas entre 0,001 a 0,01% das células mononucleares da medula óssea. O fato de que, para um único tratamento sistêmico, entre 1,0x106 a 2,0x106 CTMs por Kg de peso corporal é geralmente usado, e que em tratamentos locais uma única dose administrada localmente pode ser tão alta quanto 20-40x106 células, torna, portanto, a coleta direta in situ de grande quantidade da medula óssea impossível.
[009] A criopreservação permite que várias alíquotas de células-tronco mesenquimais da medula óssea sejam administradas em dose única, evitando intervenções sucessivas no paciente e reduzindo parte dos custos de fabricação. Além disso, permite eventualmente realizar diferentes doses para o tratamento, melhorando assim a eficácia do mesmo.
[0010] Além disso, a criopreservação é fundamental para a realização de administração alogênica de CTMs, reduzindo custos e proporcionando uma forma mais eficiente de tratar os pacientes quando comparada com o uso de CTMs autólogas, que precisam ser recém-preparadas do mesmo paciente a ser tratado, tornando o tratamento menos eficiente, mais caro e logisticamente mais complicado.
[0011] No entanto, a criopreservação não é um procedimento simples e frequentemente resulta em lesões celulares graves, bem como danos ocultos que não se manifestam quando as células são descongeladas, mas apenas em um estágio posterior. Isso compromete a funcionalidade das CTMs, tanto em suas capacidades de diferenciação, quanto em sua capacidade de regenerar tecidos danificados e a velocidade com que essa regeneração é realizada. Além disso, se os agentes crioconservantes, tal como dimetilssulfóxido (DMSO), permanecerem em suspensão quando as CTMs são administradas, reações adversas foram relatadas, tais como, náuseas, taquicardia, bradicardia, hipotensão, etc. Por outro lado, DMSO adicionado às culturas de células em concentrações tão baixas quanto 0,5% diminuem a taxa de proliferação de CTM in vitro.
[0012] Por outro lado, a via alogênica abre a possibilidade de tratamento de pacientes com doenças autoimunes, cujas próprias células poderiam ser portadoras da doença a ser tratada e, portanto, desprovidas de efeitos cicatrizantes. Além disso, as CTMs são muito menos imunogênicas do que outros tipos de células e geralmente não desencadeiam reações de rejeição e mesmo a produção de antígenos anti-HLA contra o doador é geralmente pouca ou não detectável (J García-Sancho et al., Transplantation direct 3 (9): e205).
[0013] Atualmente, existem diversos trabalhos que abordam a injeção de células mesenquimais criopreservadas na corrente sanguínea após o descongelamento, diretamente e sem tratamentos prévios. No entanto, a inoculação local de CTMs na cavidade articular em tratamentos de osteoartrite, ou no disco intervertebral em doenças degenerativas do disco, é sempre preferida, uma vez que todas as células são capazes de chegar ao local a ser tratado e dificilmente são suscetíveis a serem atacadas pelo sistema imunológico do hospedeiro quando o tratamento é alogênico. Por outro lado, o tratamento local requer a remoção prévia do agente crioprotetor, caso contrário, o agente crioprotetor, muitas vezes o dimetilsulfóxido (DMSO), interfere na multiplicação das CTMs. Mesmo quando o DMSO é removido, as células com dano oculto não são detectadas com viabilidade ou ensaios metabólicos e, conforme explicado, o referido dano oculto compromete sua viabilidade uma vez administrado, bem como a funcionalidade, tanto em suas capacidades de diferenciação, quanto em sua capacidade de regenerar tecidos danificados e a velocidade na qual a referida regeneração é realizada.
[0014] Por exemplo, Marquez-Curtis et al. (Cryobiology 71 (2015) 181-197) fornecem uma revisão sobre como a(o)s diferentes condições/processos usada(o)s para criopreservar e descongelar as células-tronco mesenquimais resultam em uma viabilidade celular diversa e uma capacidade de crescimento dos produtos celulares obtidos. Em particular, a referida revisão propõe várias soluções para melhorar as propriedades dos produtos celulares obtidos após a criopreservação. Por um lado, Marquez-Curtis et al, descrevem diferentes protocolos que modulam as condições para criopreservação (taxa de congelamento, temperatura de armazenamento, % de crioprotetor) com o uso de dimetilssulfóxido (DMSO) para melhorar a qualidade do produto celular após o descongelamento e para limitar a toxicidade do DMSO. Por outro lado, os autores também propõem outros crioprotetores, tais como: glicerol; açúcares, tais como trealose, rafinose, lactose, sacarose, etc.; antioxidantes; inibidores apoptóticos ou misturas dos mesmos; junto com processos tais como: vitrificação; congelamento em um campo magnético; etc., para tentar manter a qualidade dos produtos celulares obtidos após o descongelamento, evitando problemas de toxicidade, especialmente derivados do uso de DMSO. Ao revisar o estudo da criopreservação, o referido artigo indica que é sabido que após o descongelamento ocorre uma perda significativa na recuperação de células viáveis, os autores apenas sugerem uma variedade de soluções possíveis que incluem, cultura de células pós-descongelamento, sem indicação de condições de cultura, cultura de células antes da criopreservação, usando moduladores químicos, como resveratrol ou salubrinal, para diminuir a apoptose, sem fornecer qualquer condução particular entre essas sugestões.
[0015] Wei et al. (Veterinary surgery, 2018; 47: 19-29) também reconhecem as questões de toxicidade do DMSO e admitem as complicações práticas para sua remoção, indicando que, o uso do referido crioprotetor resulta em perda celular e menor número de unidades formadoras de colônias. Nesse sentido, esse artigo aponta para o desenvolvimento de outros crioprotetores, diferentes do DMSO, tal como condutor do desenvolvimento de produtos de células-tronco com fenótipo adequado, diferenciação e perfis de viabilidade adequados, que podem ser usados diretamente após o descongelamento evitando os problemas de toxicidade do DMSO.
[0016] Na mesma linha, Yuan et al. (Cryotherapy, 2016: 18: 860-869) concordam com a necessidade de substituir o DMSO por causa de seus problemas de toxicidade, e propõem ZENALB® 4.5 (um suplemento proteico) como crioprotetor para substituir o DMSO e obter produtos celulares que, diretamente após o descongelamento, têm perfis adequados de fenótipo, diferenciação e viabilidade.
[0017] A publicação do pedido de patente internacional WO 2010/064054 A1 segue, também, a mesma linha de desenvolvimento, descrevendo a toxicidade do crioprotetor comumente usado DMSO. A publicação propõe, em vez disso, composições com Hypothermosol® e o antioxidante ácido 6- hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox) para armazenar células-tronco, incluindo células-tronco mesenquimais, mas também para criopreservá-las, sem a necessidade de DMSO como crioprotetor. Mais uma vez, o documento WO 2010/064054 A1 propõe o uso direto das células após o descongelamento.
[0018] A publicação do pedido de patente internacional WO 2017/068140 A1 descreve terapias com células-tronco baseadas em células derivadas de tecido adiposo. A referida publicação propõe um método no qual células-tronco obtidas da fração vascular do estroma de um lipoaspirado são cultivadas em um biorreator e, consequentemente, congeladas e descongeladas, pelo menos duas vezes, e administradas diretamente após o descongelamento.
[0019] Verificou-se, portanto, que a técnica anterior sugere, como uma pista geral para desenvolver produtos celulares, incluindo produtos de células-tronco mesenquimais, que podem ser usados no tratamento após criopreservação, a substituição de DMSO para evitar os problemas de viabilidade e toxicidade encontrados, como bem como o uso direto do produto celular após o descongelamento.
[0020] Por outro lado, Alves et al. (Tissue Engineering; parte A, vol. 19, números 7 e 8, 2013) analisam o efeito do estresse oxidativo sofrido por CTMs durante a cultura ex vivo e a perda gradual do potencial de diferenciação e redução da eficácia clínica. Para essa finalidade, os autores propõem o uso do trolox como antioxidante para prevenir o referido dano oxidativo. No entanto, os autores concluem que, embora a suplementação com trolox possa reduzir o dano oxidativo durante os primeiros períodos de cultivo, os efeitos benéficos demonstrados pelos antioxidantes foram, no entanto, incapazes de resgatar a capacidade de diferenciação das CTMs humanas após a expansão in vitro.
[0021] Para essa finalidade, é claro que a principal questão para desenvolver terapias baseadas em CTMs eficazes e padronizadas é garantir que a manipulação dessas referidas células, tal como a criopreservação ou expansão, não danifique as células comprometendo sua atividade, tal como a capacidade para multiplicar e diferenciar uma vez administrado.
[0022] Além disso, é essencial formular as CTMs em uma composição que seja capaz de reter, durante o transporte e até sua administração, sua funcionalidade e sua viabilidade, que geralmente são perdidas em algumas horas.
[0023] A invenção fornece um método para obter uma população enriquecida de CTMs funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte que são formuladas em composições desenvolvidas para transporte hipotérmico e administração local, que resolve os problemas acima mencionados.
[0024] A presente invenção se refere a um método para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte adequadas para administração em terapia, o referido método compreendendo as etapas de: a. colocar em suspensão uma amostra ex vivo de células- tronco mesenquimais da medula óssea em um meio crioprotetor compreendendo 5% a 10% de dimetilsulfóxido a uma concentração de 5x106 a 10x106 células/ml; em nitrogênio líquido; c. restaurar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, realizando as seguintes etapas: c1. descongelar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, aumentando progressivamente a temperatura até 35-39 °C durante 1 a 5 minutos; c2. diluir a amostra 10 a 30 vezes o volume da amostra inicial com meio de cultura adequado; c3. centrifugar a amostra, descartando o sobrenadante e recolocando em suspensão sedimento de células-tronco mesenquimais em meio de cultura adequado; c4. selecionar as células-tronco mesenquimais com viabilidade de pelo menos 70%; c5. semear as células-tronco mesenquimais selecionadas na etapa (c4) em um suporte de plástico e incubar as referidas células-tronco mesenquimais com um meio de cultura adequado compreendendo CO2 de 7,5% a 10% e pelo menos 5% de soro fetal de bovino, a uma concentração de células entre 1000 a 5000 células/cm2, com condições de cultura adequadas a 35-39 °C, superfície do suporte; d. colocar em suspensão a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas isoladas na etapa (c6) em um meio adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, em que o referido meio adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C é um meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
[0025] A presente invenção refere-se adicionalmente a uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte que podem ser obtidas pelo método da invenção.
[0026] Além disso, a presente invenção também se refere a uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas pelo método da invenção, para uso como um medicamento.
[0027] A presente invenção se refere a um método para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais (CTMs) funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte in vitro. O referido método compreende as etapas de: a. colocar em suspensão uma amostra ex vivo de células- tronco mesenquimais da medula óssea em um meio crioprotetor compreendendo 5% a 10% de dimetilssulfóxido a uma concentração de células de 5x106 a 10x106 células/ml; b. criopreservar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea diminuindo a temperatura, resfriando-as primeiro a -70 °C a -90 °C por pelo menos 24 horas antes de armazenar a amostra em nitrogênio líquido; c. restaurar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, realizando as seguintes etapas: - 1. descongelar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, aumentando progressivamente a temperatura até 35-39 °C durante 1 a 5 minutos; - 2. diluir a amostra 10 a 30 vezes o volume da amostra com meio de cultura adequado; - 3. centrifugar a amostra, descartar o sobrenadante e recolocar em suspensão as células-tronco mesenquimais em meio de cultura adequado; - 4. selecionar as células-tronco mesenquimais com viabilidade de pelo menos 70%; de cultura adequado compreendendo CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%, a uma concentração entre 1000 a 5000 células/cm2, com condições de cultura adequadas a 3539 °C, - 6. substituir por meio de cultura novo adequado compreendendo CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%, em intervalos de tempo regulares e isolar a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais restauradas e criopreservadas do suporte quando as células ocupam 80 a 100% da superfície do suporte;
[0028] d. colocar em suspensão a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas isoladas na etapa (c6) em um meio adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, em que o referido meio adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C é um meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
[0029] O meio de cultura adequado compreende pelo menos soro fetal bovino a 5% com CO2 a 7,5% a 10% e a quantidade necessária de -HCO3. Nesse sentido, a proporção de CO2 e - HCO3 no meio de cultura adequado permanece constante, incluindo uma concentração de CO2 de 7,5% a 10%, e pelo menos soro fetal bovino a 5%. De preferência, o referido método compreende adicionalmente uma etapa adicional (c7) de seleção de uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte que: - apresentam aderência a plástico; e - apresentam uma viabilidade de pelo menos 70%; e - apresentam uma expressão >90% de CD90, CD 166, CD73 e CD105; e - apresentam uma expressão <10% de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%; e - não apresentam aberrações cromossômicas; e - apresentam capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
[0030] O termo “meio isotônico” , para os fins da presente invenção, refere-se a uma solução que preserva o volume das células por ter a mesma osmolaridade eficaz, ou concentração de soluto não permeável que as células, isto é, tem a mesma pressão osmótica que a interior das células. Consequentemente, as soluções isotônicas permitem a livre troca de água através da membrana quando as células estão em suspensão nas referidas soluções e mantêm o volume das células suspensas nas mesmas.
[0031] O ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico, ou trolox, é um análogo da vitamina E.
[0032] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio adequado para transporte e armazenamento a 28 °C é um meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM é um meio livre de proteínas, de soro e de componente animal compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25mM a 1mM.
[0033] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM é um meio compreendendo Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cloreto 17 mM, di-hidrogenofosfato 10 mM, HCO3 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, dextrano com um peso molecular médio de 40000 6%, adenosina 2 mM, glutationa 3 mM, glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 1 mM.
[0034] Em outra forma de realização preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:9 a 9:1 (v/v) de uma primeira composição compreendendo Na+ 130 mM, K+ 4 mM, Ca2+ 1,35 mM, Cloreto 109 mM e lactato 16 mM, com uma segunda composição compreendendo Na+ 159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, Cloreto 77 mM, di-hidrogenofosfato 28 mM, citrato 10 mM e acetato de 32 mM, suplementado com glicose 5 mM, albumina de soro humano 0,1% a 0,5% e ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
[0035] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:9, ou 1:4, ou 1:3 ou 1:1, ou 3:1 ou 4:1 ou 9:1 (v/v) da referida primeira composição e da referida segunda composição, suplementada com glicose 5 mM, albumina de soro humano 0,1% a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25 a 1 mM.
[0036] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:1 (v/v) da referida primeira composição e da referida segunda composição, suplementada com glicose 5 mM, albumina de soro humano 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,5 mM.
[0037] Em uma forma de realização ainda mais preferida, o referido meio isotônico compreende glicose 5 mM, albumina de soro humano 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico 0,5 mM.
[0038] Em uma forma de realização ainda mais preferida, o referido meio isotônico compreende albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 1 mM.
[0039] A presente invenção também se refere a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte adequadas para administração em terapia obtenível de acordo com o método para obter uma população funcional de células-tronco mesenquimais (CTMs) in vitro, descrito nesse documento acima.
[0040] Uma forma de realização da presente invenção refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método descrito acima nesse documento, para uso como um medicamento, em particular para uso no tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais.
[0041] Outra forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método descrito acima nesse documento, para uso no tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células- tronco mesenquimais, em que a referida composição compreende um população de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte é administrada localmente ou em tratamentos sistêmicos.
[0042] Outra forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método aqui descrito acima, para uso no tratamento de doenças osteoarticulares, reparo ósseo; doenças autoimunes e doenças cardiovasculares.
[0043] Em uma forma de realização, as doenças osteoarticulares são selecionadas de doença degenerativa do disco, osteoartrite, lesões meniscais e artrite reumatoide.
[0044] Em uma forma de realização, as doenças autoimunes são selecionadas de lúpus eritematoso, doença do enxerto contra hospedeiro e esclerose sistêmica.
[0045] Em uma forma de realização, as doenças cardiovasculares são selecionadas de insuficiência vascular periférica, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia.
[0046] A referida composição compreendendo a referida população enriquecida de CTMs funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte é capaz de reter a funcionalidade das CTMs novas após o descongelamento e também durante o transporte hipotérmico de 2 a 8 °C por pelo menos 72 horas.
[0047] Para as finalidades da presente invenção, as células-tronco mesenquimais da medula óssea são células- tronco não hematopoiéticas presentes na medula óssea caracterizadas pela sua multipotencialidade mesodérmica e que são, portanto, capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
[0048] De acordo com a presente invenção, o termo “ população de células-tronco mesenquimais funcionais” refere-se a uma amostra de células-tronco mesenquimais que compreende uma quantidade de células-tronco mesenquimais adequadas para uso no tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais, e em que a referida amostra compreende apenas células-tronco mesenquimais com características funcionais de células-tronco mesenquimais frescas, isto é, apresentam aderência a plástico; apresentam viabilidade de pelo menos 70%; apresentam uma expressão >90% de CD90, CD166, CD73 e CD105; apresentam uma expressão <10% de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%; não apresentam aberrações cromossômicas e apresentam capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
[0049] Para as finalidades da presente invenção, “uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais” refere-se a um grupo de pelo menos 0,5x106 células-tronco mesenquimais funcionais que apresentam aderência a plástico; apresentam uma viabilidade de pelo menos 70%; apresentam uma expressão >90% de CD90, CD166, CD73 e CD105; apresentam uma expressão <10% de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%; não apresentam aberrações cromossômicas e apresentam capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
[0050] Para as finalidades da presente invenção, o termo “ células criopreservadas” são células mantidas em temperaturas de -70 °C ou inferiores que, devido à baixa temperatura de preservação, têm substancialmente qualquer atividade metabólica ou química que possa causar danos às células substancialmente interrompidas.
[0051] Para as finalidades da presente invenção, o termo “células criopreservadas e restauradas” ou “ amostra criopreservada e restaurada de células-tronco mesenquimais” e termos equivalentes referem-se a células-tronco mesenquimais que foram previamente criopreservadas, descongeladas, diluídas, isoladas e cultivadas em meio de cultura adequado compreendendo pelo menos soro fetal bovino a 5%, altos níveis de CO2 a 35-39 °C, de acordo com o método da invenção, em que as referidas células criopreservadas e restauradas apresentam substancialmente toda a atividade metabólica e química de células-tronco mesenquimais novas e têm uma viabilidade de pelo menos 70%, mais de preferência uma viabilidade de pelo menos 80% e ainda mais de preferência uma viabilidade de pelo menos 90%.
[0052] Para as finalidades da presente invenção, o termo “células criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte” ou “células-tronco mesenquimais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte” e termos equivalentes referem-se a células- tronco mesenquimais que foram previamente criopreservadas e restauradas em meio de cultura adequado compreendendo pelo menos soro fetal bovino a 5%, altos níveis de CO2 a 35-39 °C e que, após o isolamento, são condicionados para transporte, em uma suspensão compreendendo meio isotônico adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C compreendendo trolox 0,25 mM a 1mM. Nesse sentido, para as finalidades da presente invenção, o termo “condicionado” é equivalente a “condicionado para transportar” ou “ condicionado para transporte” ou “condicionado para transporte e armazenamento a 2-8 °C”.
[0053] O termo “compreende(m)” é interpretado como significando que inclui um grupo de características, mas que não exclui a presença de outras características, desde que não tornem a reivindicação impraticável. Para essa finalidade, para as finalidades da presente invenção, o termo “compreende” pode ser substituído pelo termo “consistindo em” e o termo “consistindo essencialmente em”. Dessa forma, quando o termo “compreende(m)” é referido a um grupo de características A, B e C, deve ser interpretado como eventualmente incluindo outras características diferentes de A, B e C, desde que não renderizem a reivindicação impraticável, mas também pode ser interpretada para incluir apenas as referidas características A, B e C, ou para incluir apenas substancialmente as referidas características e, consequentemente, “compreende(m)” deve ser interpretado para incluir também um grupo “consistindo em” características A, C e C e um grupo “consistindo essencialmente em” características A, B e C.
[0054] As células-tronco mesenquimais usadas no método da invenção são originadas de células mononucleares da medula óssea ex vivo. As referidas células mononucleares da medula óssea ex vivo incluem vários tipos de células-tronco da medula ex vivo, incluindo células-tronco hematopoiéticas ex vivo, células-tronco mesenquimais ex vivo, células progenitoras endoteliais ex vivo e outras células-tronco precursoras. Após o trauma, os fatores de crescimento celular podem ser capazes de promover a diferenciação tecidual das CTMs da medula óssea, tornando possível o reparo dos órgãos lesionados e a restauração da função orgânica.
[0055] CTMs apresentam forte adesão ao plástico na cultura. Essa capacidade de adesão é usada para o isolamento e a purificação das referidas CTMs a partir de células mononucleares da medula óssea.
[0056] De preferência, o método para obter uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte adequadas para administração em terapia, é realizado em 10 a 15 dias.
[0057] Em uma forma de realização preferida, a amostra ex vivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea compreende pelo menos 8x106 células-tronco mesenquimais da medula óssea.
[0058] Em uma forma de realização preferida, a amostra ex vivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea compreende 8x106 a 10x106 células-tronco mesenquimais da medula óssea.
[0059] De preferência, a amostra ex vivo compreende células-tronco mesenquimais da medula óssea com uma viabilidade de pelo menos 90%.
[0060] De preferência, a amostra ex vivo compreende 8x106 a 10x106 células-tronco mesenquimais com uma viabilidade de pelo menos 90%, com expressão de CD90, CD166, CD73 e CD105 >90% e com expressão de CD14, CD34, CD45 e HLA- DR <10%.
[0061] Em uma forma de realização preferida, a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea ex vivo é fornecida em um suporte de plástico, separada do suporte de plástico usando um método enzimático e, recolocada em suspensão em um meio adequado.
[0062] Os suportes de plástico preferidos são suportes de plástico hidrofílicos ou suportes de plástico carregados negativamente. Em uma forma de realização preferida, o referido suporte de plástico preferido compreende grupos hidrofílicos. Em uma forma de realização preferida, os referidos suportes de plástico preferidos são suportes de plástico tratados com tecido com um carácter hidrofílico. Os exemplos comerciais dos referidos suportes de plástico preferidos são os suportes Corning CellBIND®.
[0063] Em uma forma de realização preferida, antes da etapa (a), as seguintes etapas são conduzidas: i. lavar com meio adequado a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea ex vivo em um suporte de plástico; ii. adicionar uma solução enzimática e incubar em condições adequadas para o meio usado; iii. inativar a solução enzimática pela adição de igual volume de meio; iv. centrifugar e descartar o sobrenadante.
[0064] Em uma forma de realização preferida, o meio adequado para lavar as células no passo (i) é o Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM).
[0065] Em outra forma de realização preferida, a etapa (i) é realizada em um meio de cultura selecionado de Meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), Meio de Soro Reduzido de Meio Essencial Mínimo de Eagle, Meio Essencial Mínimo de Eagle, Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado com nucleosídeos, glicose, etc., ou qualquer outro meio de cultura adequado.
[0066] Em uma forma de realização preferida, quando o meio adequado é DMEM, a etapa (ii) compreende a adição de uma solução enzimática e a incubação durante 5 a 10 minutos a 35-37 °C sob CO2 a 10%, mais de preferência a 37 °C.
[0067] Em qualquer caso, a pessoa habilitada reconhecerá quais são os meios e as condições de cultura possíveis, bem como as modificações possíveis para conduzir a cultura da etapa (i).
[0068] De preferência, a solução enzimática usada na etapa (ii) compreende tripsina a 0,05% e ácido etilenodiaminotetracético tetrassódico (EDTA) em solução salina balanceada de Hank.
[0069] Um exemplo comercial da solução enzimática usada na etapa (ii) é uma solução de Tripsina-EDTA 1X (Sigma 9417C).
[0070] De preferência, a etapa (iv) compreende a centrifugação da amostra a 300 a 500 g a 15 a 25 °C por 5 a 10 minutos, mais de preferência a 400g a 20 °C por 5 minutos.
[0071] Em uma forma de realização preferida, a etapa (a) compreende o fornecimento de uma amostra de 8x106 a 10x106 células-tronco mesenquimais com uma viabilidade de pelo menos 90%, com expressão de CD90, CD166, CD73 e CD105 ≥90% e com expressão de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR ≤10%.
[0072] De preferência, a amostra ex vivo de células- tronco mesenquimais da medula óssea usada na etapa (a) é obtida por um método que compreende as etapas de: I. fornecer uma amostra ex vivo de pelo menos 30 ml de aspirado de medula óssea filtrado; II. submeter o aspirado de medula óssea ex vivo a um anticoagulante; III. selecionar as células mononucleares do aspirado de medula óssea ex vivo; IV. selecionar as células mononucleares com viabilidade maior que 70%; V. semear as células mononucleares de 1,5x106 a 2x106 células/cm2 em suporte plástico, em meio de cultura adequado e incubar as mesmas em condições de cultura adequadas; VI. medir a porcentagem de crescimento celular e o aparecimento de células-tronco mesenquimais aderidas ao suporte de plástico em intervalos regulares de tempo e VII. trocar o meio de cultura quando a porcentagem de crescimento celular for menor que 60%, removendo o sobrenadante; ou VI.2 isolar a amostra de células-tronco mesenquimais aderidas ao suporte plástico se a porcentagem de crescimento celular for maior que 80%; mesenquimais e isolar as células-tronco mesenquimais aderidas ao suporte plástico de cada uma das subculturas se a porcentagem de crescimento for maior que 80%.
[0073] De preferência, o método para obter uma amostra ex vivo de células-tronco mesenquimais da medula óssea da etapa (a), a partir de uma amostra ex vivo de aspirado de medula óssea, é realizado em 8 a 10 dias.
[0074] Em uma forma de realização, o anticoagulante usado na etapa (II) é heparina.
[0075] Em uma forma de realização, a etapa (III) compreende selecionar as células mononucleares do aspirado ósseo ex vivo por gradiente de densidade.
[0076] De preferência, a etapa (III) compreende selecionar in vitro as células mononucleares do aspirado ósseo ex vivo por gradiente de densidade usando uma solução compreendendo ficoll, compreendendo: 111.1 adicionar lentamente uma solução de Ficoll à amostra de aspirado de medula óssea ex vivo; 111.2 centrifugar a amostra a 300 a 500 g, a 15 a 25 °C por pelo menos 30 minutos sem freio; 111.3 isolar e lavar a interface com um meio adequado; 111.4 centrifugar e descartar o sobrenadante; 111.5 lavar o sedimento com um meio adequado; 111.6 centrifugar e descartar o sobrenadante; 111.7 recolocar em suspensão o sedimento com as células mononucleares em um meio de cultura adequado;
[0077] Em uma forma de realização preferida, a etapa I compreende adicionar lentamente uma solução Ficoll em uma proporção 2:3 (vol:vol) com a amostra de aspirado de medula óssea ex vivo.
[0078] Em uma forma de realização preferida, a lavagem é realizada com tampão fosfato contendo albumina de soro humano 0,5.
[0079] Em outra forma de realização preferida, a lavagem é realizada com uma solução salina fisiológica na etapa III.3.
[0080] Em outra forma de realização preferida, a lavagem é realizada com solução de Ringer.
[0081] De preferência, a etapa III.4 compreende a centrifugação da amostra a 300 a 500 g a 15 a 25 °C por 5 a 10 minutos, mais de preferência a 400g a 20 °C por 5 minutos.
[0082] De preferência, a etapa III.6 compreende a centrifugação da amostra a 300 a 500 g de 15 a 25 °C por 5 a 10 minutos, mais de preferência a 400g a 20 °C por 5 minutos.
[0083] Em uma forma de realização preferida, as células mononucleares selecionadas na etapa (IV) têm uma viabilidade maior que 70%, mais de preferência maior que 80% e mais de preferência maior que 90%.
[0084] De preferência, a viabilidade da célula mononuclear é determinada usando um teste de exclusão por corante. Os referidos testes de exclusão por corante baseiam- se no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem certos corantes, tal como o azul de tripano, ao passo que as células mortas não. Nesse teste, uma suspensão de células é simplesmente misturada com o corante e então examinada visualmente para determinar se as células absorvem ou excluem o corante. As células que excluem o corante são, portanto, células vivas.
[0085] Em uma forma de realização preferida, a etapa V é realizada em um meio de cultura selecionado de Meio Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM), Meio de Soro Reduzido de Meio Essencial Mínimo de Eagle, Meio Essencial Mínimo de Eagle, Meio Essencial Mínimo de Eagle modificado com nucleosídeos, glicose, etc. ou qualquer outro meio de cultura adequado.
[0086] Em uma forma de realização preferida, a etapa V é realizada semeando as células mononucleares em 1,5x106 a 2x106 células/cm2 em um suporte de plástico, em DMEM com soro fetal bovino de pelo menos 5% (FBS) e incubando a 35-39 °C sob CO2 a 7,5% a 10%. O meio de cultura compreende de preferência, pelo menos soro fetal bovino a 5% com CO2 a 7,5% a 10% e a quantidade necessária de -HCO3.
[0087] Em outra forma de realização preferida, a etapa V é realizada semeando as células mononucleares em 1,5x106 a 2x106 células/cm2 em um suporte de plástico, em DMEM, com pelo menos FBS a 5% e gentamicina a 0,5% e incubando a 3539 °C sob CO2 a 7,5-10%.
[0088] Os suportes de plástico preferidos são suportes de plástico hidrofílicos ou suportes de plástico carregados negativamente. Em uma forma de realização preferida, o referido suporte de plástico preferido compreende grupos hidrofílicos. Em uma forma de realização preferida, os referidos suportes de plástico preferidos são suportes de plástico tratados com tecido com um carácter hidrofílico. Os exemplos comerciais dos referidos suportes de plástico preferidos são os suportes Corning CellBIND®.
[0089] Em qualquer caso, a pessoa habilitada reconhecerá quais são os meios e condições de cultura possíveis, bem como as modificações possíveis para conduzir a cultura da etapa (V).
[0090] De preferência, na etapa VI, se a percentagem de crescimento celular for menor que 60-80%, é feita uma mudança de meio.
[0091] De preferência, na etapa VI se for maior que 80% a cultura celular é submetida à dissociação e à expansão celulares por meio da realização de subculturas de até 2 passagens a fim de aumentar e purificar a linha de célula de CTMs.
[0092] Em uma forma de realização preferida, a etapa (VI.3) compreende isolar as células-tronco mesenquimais aderidas ao suporte de plástico de cada uma das subculturas se a percentagem de crescimento celular for maior que 80%; em que o isolamento compreende: i. lavar com meio adequado a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea em um suporte de plástico; ii. adicionar uma solução enzimática e incubar em condições adequadas ao meio usado; iii. inativar a solução enzimática pela adição de igual volume de meio; iv. centrifugar e descartar o sobrenadante.
[0093] Em uma forma de realização preferida, o meio adequado para lavar as células na etapa (i) é o Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM).
[0094] Em uma forma de realização preferida, quando o meio adequado é DMEM, a etapa (ii) compreende a adição de uma solução enzimática e a incubação durante 5 a 10 minutos de 35 a 39 °C sob CO2 a 10%.
[0095] De preferência, a solução enzimática usada na etapa (ii) é uma solução contendo tripsina a 0,05% e ácido etilenodiaminotetracético de sódio a 0,02% e 0,05%. De preferência, a solução enzimática usada na etapa (ii) compreende tripsina a 0,05% e ácido etilenodiaminotetracético tetrassódico (EDTA) em solução salina balanceada de Hank.
[0096] De preferência, a centrifugação da etapa (iv) é realizada a 300-500 g a 15 a 25 °C e durante 30 minutos.
[0097] Em qualquer caso, a pessoa habilitada reconhecerá quais são os diferentes meios e condições possíveis, bem como as modificações possíveis para conduzir o isolamento das células-tronco mesenquimais da etapa (VII).
[0098] Em uma forma de realização preferida, a amostra ex vivo de células-tronco mesenquimais obtidas acima, para uso na etapa (a), tem uma viabilidade de pelo menos 90%, com expressão de CD90, CD166, CD73 e CD105 >90% e com expressão de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%.
[0099] Em uma forma de realização preferida, a amostra de aspirado de medula óssea ex vivo contém mais de 3000 leuc0citos/μl.
[00100] Em uma forma de realização preferida, a amostra de aspirado de medula óssea ex vivo é uma amostra de aspirado de medula óssea ex vivo da crista ilíaca.
[00101] Em uma forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende um meio compreendendo Soro Fetal Bovino e DMSO a 5 a 10%.
[00102] Em outra forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende DMSO a 5% e soro fetal de bovino a 95%.
[00103] Em outra forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende DMSO a 10% e soro fetal de bovino a 90%.
[00104] Em outra forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende um meio sem componentes, soro e proteínas de animais compreendendo DMSO a 5%.
[00105] Ainda em outra forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende um meio sem componentes, soro e proteínas de animais compreendendo DMSO a 10%.
[00106] Em uma forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende DMSO a 5 a 10% e 95 a 90% de uma composição isotônica compreendendo Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cloreto 17 mM, dihidrogenofosfato 10 mM, -HCO3 5 mM, ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, dextrano com um peso molecular médio de 40000 a 6%, adenosina 2 mM, glutationa 3 mM, glicose 5 mM.
[00107] Em uma forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende DMSO a 5% e 95 a 90% de uma composição isotônica compreendendo Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cloreto 17 mM, di- hidrogenofosfato 10 mM, -HCO3 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)- 1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, dextrano com um peso molecular médio de 40000 a 6%, adenosina 2 mM, glutationa 3 mM, glicose 5 mM.
[00108] Em uma forma de realização preferida, o meio crioprotetor da etapa (a) compreende DMSO a 10% e 95 a 90% de uma composição isotônica compreendendo Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cloreto 17 mM, di- hidrogenofosfato 10 mM, -HCO3 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)- 1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, dextrano com um peso molecular médio de 40000 a 6%, adenosina 2 mM, glutationa 3 mM, glicose 5 mM.
[00109] Em uma forma de realização preferencial, a etapa (b) compreende a criopreservação da amostra de células- tronco mesenquimais da medula óssea a uma velocidade de 1 °C/min até -70 °C a -90 °C por pelo menos 25 horas antes de armazenar a amostra em nitrogênio líquido,
[00110] De preferência, a etapa (c) de restauração das células-tronco mesenquimais criopreservadas começa de acordo com a data estabelecida para o tratamento que pode ser em até 6 a 20 anos.
[00111] De preferência, a etapa (c1) é realizada rapidamente, em 15 a 20 minutos.
[00112] De preferência, a etapa (c1) compreende o descongelamento das células-tronco mesenquimais criopreservadas aumentando progressivamente a temperatura até 35-39 °C durante 1 a 5 minutos, enquanto mantém uma velocidade controlada de aumento de temperatura. Um equipamento adequado para descongelar as células-tronco mesenquimais criopreservadas na etapa (c1) é um ThawSTAR® CFT2.
[00113] Em uma forma de realização preferida, o meio de cultura adequado da etapa (c2) é o meio de Eagle modificado por Dulbecco com pelo menos soro fetal bovino a 5% e CO2 a 7,5% a 10%. O meio de cultura compreende, de preferência, pelo menos soro fetal bovino a 5% com CO2 a 7,5% a 10% e a quantidade necessária de -HCO3.
[00114] Em outra forma de realização preferida, o meio de cultura adequado da etapa (c2) é selecionado de meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), meio de soro reduzido de meio essencial mínimo de Eagle, meio essencial mínimo de Eagle, meio essencial mínimo de Eagle modificado com nucleosídeos, glicose, etc., ou qualquer outro meio de cultura adequado incluindo CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%.
[00115] Em qualquer caso, a pessoa habilitada na técnica reconhecerá quais são os possíveis meios de cultura compreendendo pelo menos FBS a 5% e altos níveis de CO2 e - HCO3, e condições a 35-39 °C, bem como as modificações possíveis para conduzir a cultura da etapa (c2).
[00116] De preferência, a etapa (c3) compreende a centrifugação da amostra, descartando o sobrenadante e recolocando em suspensão as células-tronco mesenquimais em meio de cultura adequado a uma concentração de 1x106 a 5x106 células/ml. De preferência, o referido meio de cultura adequado inclui 7,5% a CO2 a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%.
[00117] De preferência, a etapa (c3) compreende a centrifugação da amostra a 300 a 500 g a 15 a 25 °C por 5 a 10 minutos, mais de preferência a 400g a 20 °C por 5 minutos.
[00118] De preferência, a viabilidade celular das células-tronco mesenquimais, na etapa (c4), é determinada usando um teste de exclusão por corante.
[00119] De preferência, a viabilidade celular das células-tronco mesenquimais, na etapa (c4), é determinada usando Azul de Tripano.
[00120] Os referidos testes de exclusão por corante baseiam-se no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem certos corantes, tal como azul de tripano, eosina ou propídio, enquanto as células mortas não. Nesse teste, uma suspensão de células é simplesmente misturada com o corante e então examinada visualmente para determinar se as células absorvem ou excluem o corante. As células que excluem o corante são, portanto, células vivas.
[00121] De preferência, a etapa (c6) compreende a substituição por meio de cultura adequado novo, compreendendo altos níveis de CO2, de preferência pelo menos Soro Fetal Bovino a 5% e CO2 a 7,5% a 10%, em intervalos de tempo regulares e isolamento da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas do suporte quando as células ocupam 80 a 100% da superfície do suporte.
[00122] Em uma forma de realização preferida, o meio de cultura adequado da etapa (c5) e (c6) é o meio de Eagle modificado por Dulbecco com CO2 a 7,5% a 10%, com a quantidade necessária de -HCO3 e pelo menos soro fetal bovino a 5%.
[00123] Em outra forma de realização preferida, o meio de cultura adequado da etapa (c5) e (c6) é selecionado de meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), meio de soro reduzido de meio essencial mínimo de Eagle, meio essencial mínimo de Eagle ou qualquer outro meio de cultura adequado com CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%.
[00124] De preferência, a cultura da etapa (c5) e (c6) será mantida a 35-39 °C com CO2 a 7,5% a 10% com um meio de cultura adequado compreendendo pelo menos soro fetal bovino a 5%. O meio de cultura compreende adicionalmente a quantidade necessária de -HCO3.
[00125] De preferência, a cultura da etapa (c5) será mantida nas condições de cultura adequadas para o meio de cultura selecionado.
[00126] Em qualquer caso, a pessoa habilitada na técnica reconhecerá quais são os possíveis meios de cultura e condições 35-39 °C, bem como as modificações possíveis para conduzir a cultura da etapa (c5) e (c6) compreendendo altos níveis de CO2 e pelo menos soro fetal bovino a 5%.
[00127] De preferência, na etapa (c5) o meio é trocado a cada 3 a 4 dias até que as células ocupem 80-100% da superfície de crescimento, obtendo-se um rendimento de 10.000 a 40000 células/cm2. De preferência, a etapa (c5) é realizada em 10 a 15 dias.
[00128] Em uma forma de realização preferida, a etapa (c6) compreende o isolamento da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas do suporte quando as células ocupam 80 a 100% da superfície do suporte; em que o isolamento compreende: i. lavar com meio adequado a amostra de células-tronco mesenquimais criopreservadas, restauradas e funcionais em um suporte de plástico; ii. adicionar solução enzimática e incubar em condições adequadas ao meio utilizado; iii. inativar a solução enzimática pela adição de igual volume de meio; iv. centrifugar e descartar o sobrenadante.
[00129] Em uma forma de realização preferida, o meio adequado para lavar as células na etapa (i) é o Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM).
[00130] Em uma forma de realização preferida, quando o meio adequado é DMEM, a etapa (ii) compreende a adição de uma solução enzimática e a incubação durante 5 a 10 minutos a 35-39 °C sob CO2 a 7,5% a 10%.
[00131] De preferência, a solução enzimática usada na etapa (ii) é uma solução contendo tripsina a 0,05% e ácido etilenodiaminotetracético a 0,02%. De preferência, a solução enzimática usada na etapa (ii) compreende tripsina a 0,05% e ácido etilenodiaminotetracético tetrassódico a 0,02% (EDTA) em solução salina balanceada de Hanks.
[00132] Em qualquer caso, a pessoa habilitada na técnica reconhecerá quais são os possíveis diferentes meios e condições adequados, bem como as modificações possíveis para conduzir o isolamento da população enriquecida de células- tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas da etapa (c6).
[00133] De preferência, a centrifugação da etapa (iv) é realizada a 300-500 g a 15 a 25 °C e durante 10 a 30 minutos, mais de preferência a 400g, 20 °C durante 10 minutos.
[00134] Em uma forma de realização preferida, a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas isoladas na etapa (c6) tem uma viabilidade >80%.
[00135] Em uma forma de realização preferida, a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas isoladas na etapa (c6) tem uma viabilidade >90%.
[00136] Em uma forma de realização preferida, o referido meio adequado para transporte e armazenamento a 2-8 °C é um meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox) 0,25mM a 1mM.
[00137] O ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico, ou trolox, é um análogo da vitamina E.
[00138] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM é um meio livre de componente, soro e proteína de animal compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25mM a 1mM.
[00139] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM é um meio compreendendo Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cloreto 17 mM, di-hidrogenofosfato 10 mM, -HCO3 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, dextrano com um peso molecular médio de 40000 a 6%, adenosina 2 mM, glutationa 3 mM, glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico a 1 mM.
[00140] Em outra forma de realização preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:9 a 9:1 (v/v) de uma primeira composição compreendendo Na+ 130 mM, K+ 4 mM, Ca2+ 1,35 mM, Cloreto 109 mM e lactato 16 mM, com uma segunda composição compreendendo Na+ 159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, Cloreto 77 mM, di-hidrogenofosfato 28 mM, citrato 10 mM e acetato 32 mM, suplementado com glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,1% a 0,5% e ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
[00141] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:9, ou 1:4, ou 1:3 ou 1:1, ou 3:1 ou 4:1 ou 9:1 (v/v) da referida primeira composição e da referida segunda composição, suplementada com glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,1% a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25 a 1 mM.
[00142] Em uma forma de realização mais preferida, o referido meio isotônico compreende uma mistura de 1:1 (v/v) da referida primeira composição e da referida segunda composição, suplementada com glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,5 mM.
[00143] Em uma forma de realização ainda mais preferida, o referido meio isotônico compreende glicose 5 mM, albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico a 0,5 mM.
[00144] Em uma forma de realização ainda mais preferida, o referido meio isotônico compreende albumina de soro humano a 0,5% e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 1 mM.
[00145] Um meio isotônico comercial adequado é Hyportermosol®-Base suplementada com ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM e albumina de soro humano a 0,1% a 0,5%.
[00146] A solução base Hyporthermosol® contém Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cl- 17,1 mM, di- hidrogenofosfato 10 mM, bicarbonato 5 mM, ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfônico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarose 20 mM, manitol 20 mM, glicose 5 mM, adenosina 2 mM e glutationa 3 mM.
[00147] De preferência, o referido método compreende adicionalmente uma etapa adicional (c7) de seleção de uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte que: - apresentam aderência a plástico; e - apresentam uma viabilidade de pelo menos 70%; e - apresentam uma expressão >90% de CD90, CD166, CD73 e CD105; e - não apresentam aberrações cromossômicas; e - apresentam capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
[00148] De preferência, a composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte adequadas para administração em terapia obtida de acordo com o método da invenção, é transportada em um acondicionamento isotérmico que garante uma temperatura constante entre 2 e 8 °C para pelo menos >72 horas, em todas as épocas do ano e nas condições climáticas. Um exemplo de acondicionamento usado com o método da invenção é o sistema de acondicionamento ORCA®.
[00149] A composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte permanece estável mesmo após sofrer até 10 duplicações.
[00150] Uma forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte que podem ser obtidas de acordo com o método da invenção.
[00151] Outra forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso como um medicamento. Outra forma de realização refere-se ao uso de uma composição compreendendo uma população de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte adequadas para administração em terapia, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso na fabricação de um medicamento
[00152] Adicionalmente, a invenção se refere a uma composição compreendendo uma população enriquecida de células- tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso no tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais.
[00153] Outra forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso no tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais, em que a referida composição compreende um população de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte é administrada localmente ou em tratamentos sistêmicos.
[00154] Outra forma de realização refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso no tratamento de doenças osteoarticulares, reparo ósseo; doenças autoimunes e doenças cardiovasculares.
[00155] Em uma forma de realização, as doenças osteoarticulares são selecionadas de doença degenerativa do disco, osteoartrite, lesões meniscais e artrite reumatoide.
[00156] Em uma forma de realização, as doenças autoimunes são selecionadas de lúpus eritematoso, doença do enxerto contra hospedeiro e esclerose sistêmica.
[00157] Em uma forma de realização, as doenças cardiovasculares são selecionadas de insuficiência vascular periférica, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia. Em uma forma de realização preferida, a doença é um distúrbio isquêmico do nervo óptico.
[00158] Para as finalidades da presente invenção, o termo “tratamento autólogo” ou “ terapia autóloga” refere- se a um tratamento em que as células-tronco mesenquimais da medula óssea usadas na etapa (a) do método da invenção são células-tronco mesenquimais da medula óssea da mesma pessoa que a pessoa para quem se destina a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais para uso, ou para a qual se destina a composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais para uso, de acordo com a invenção.
[00159] Para as finalidades da presente invenção, o termo “tratamento alogeneico ou alogênico” ou “terapia alogênica” refere-se a um tratamento em que as células- tronco mesenquimais da medula óssea usadas na etapa (a) do método da invenção são células-tronco mesenquimais da medula óssea de uma pessoa diferente da pessoa para a qual se destina o uso da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, ou para quem se destina o uso da composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, de acordo com a invenção.
[00160] As composições que compreendem uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, descritas acima nesse documento, são, portanto, usadas na fabricação de um medicamento para tratamento autólogo ou alogênico do tratamento de doenças suscetíveis à terapia com células-tronco mesenquimais, seja por tratamentos locais ou sistêmicos, em particular doenças osteoarticulares, osteoartrite, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares.
[00161] Uma forma de realização da invenção refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso como um medicamento a ser administrado a uma concentração de 5x106 a 10x106 células/ml.
[00162] Uma forma de realização da invenção refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, para uso como um medicamento a ser administrado a uma densidade celular de 1x106 a 10x106 células/ml e dose de 0,5 a 90 milhões de células, dependendo da indicação.
[00163] Uma forma de realização da invenção refere-se a uma composição que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, obtidas de acordo com o método da invenção, descrito acima nesse documento, para uso no tratamento autólogo de doenças osteoarticulares, reparo ósseo; doenças autoimunes e doenças cardiovasculares.
[00164] Outra forma de realização refere-se a um método de tratamento de doenças osteoarticulares, reparo ósseo; doenças autoimunes e doenças cardiovasculares compreendendo a administração de uma quantidade terapêutica de uma composição compreendendo uma composição compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte, a um indivíduo em necessidade da mesma, em que a referida composição compreendendo a referida população enriquecida, pode ser obtida de acordo com ao método descrito na presente divulgação.
[00165] Figura 1: efeitos da Composição 2 de acordo com a invenção e da composição de referência 1 e uma composição compreendendo uma solução de Ringer com lactato suplementada com glicose e albumina de soro humano, na viabilidade celular durante 3 dias de armazenamento sob condições hipotérmicas. (2-8 °C). Os dados são média ± sem de 5 doadores diferentes.
[00166] Figura 2: efeitos da Composição 2 e da Composição 3, de acordo com a invenção, e da Composição de referência 1 e uma composição compreendendo uma solução de Ringer com lactato suplementada com glicose e albumina de soro humano, na viabilidade celular durante 3 dias de armazenamento sob condições hipotérmicas. (2-8 °C). Os dados são média ± sem de 5 doadores diferentes.
[00167] Figura 3: Viabilidade celular versus tempo alcançada por (1) as composições compreendendo CTMs criopreservadas em FBS + DMSO a 10%, restauradas a 35-39 C com meio compreendendo CO2 a 10% e transporte condicionado para obter a composição 3, de acordo com a invenção (barras preenchidas); (2) com uma composição compreendendo CTMs em Hypothermosol® com trolox criopreservado e descongelado e mantido em temperatura ambiente (20-25 °C) pelos tempos indicados, de acordo com WO2010/064054 (barras com linhas diagonais); e (3) com uma composição compreendendo CTMs em Ringer com Lactato e DMSO a 10% criopreservado e descongelado (barras brancas). Os valores são médias +/- DP de 3 doadores. Todas as medições foram feitas em triplicata.
[00168] Figura de referência 4: Efeito de DMSO no crescimento de células-tronco mesenquimais. Células-tronco mesenquimais novas foram semeadas a 1000 células por cm2 com DMSO a 0%, 0,1%, 0,3%, 1% e 5% e cultivadas a 37 °C nos tempos mostrados. Os valores são média ± DP de 3 doadores.
[00169] Figura 5: curva de crescimento da composição 3 compreendendo células-tronco mesenquimais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte obtidas de acordo com o método da invenção após 72 horas de transporte hipotérmico (2-8 °C). Média ± DP de valores em triplicata. Representante de 3 experimentos similares com diferentes doadores.
[00170] A invenção é ilustrada nos exemplos, bem como nas figuras e nos esquemas genéricos. Os substituintes e inteiros usados nos seguintes esquemas são como definidos nas formas de realização da presente invenção, a menos que indicado de outra forma. Essa seção é apresentada para auxiliar na compreensão da invenção, mas não deve ser interpretada como limitando de qualquer forma a invenção como estabelecido nas reivindicações.
[00171] As composições compreendendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais obtidas de acordo com o método da invenção e usadas nos exemplos foram processadas usando Boas Práticas de Fabricação (GMP) na Unidade de Produção de Células do Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM) de Valladolid, seguindo os procedimentos operacionais padrão aprovados pela Agência Espanhola de Medicamentos, AEMPS (Num. PEI 10-134 e Num. PEI 15-007).
[00172] O aspirado de medula óssea submetido a um procedimento anticoagulante protocolizado é a fonte celular para obter as CTMs usadas para obter as composições do exemplo. O aspirado de medula óssea foi processado em até 24 horas após sua extração.
[00173] O processo de obtenção dos CTMs dura aproximadamente de 21 a 28 dias.
[00174] Na primeira etapa, a fração de células mononucleares (CMNs) foi selecionada com gradiente de densidade Ficoll. Subsequentemente, foi realizado um estudo de viabilidade celular pela técnica de exclusão do Azul de Tripano: as células mononucleares (CMNs) devem ter uma viabilidade >70% para iniciar a cultura. As CMNs foram semeadas em frascos de cultura contendo DMEM + FBS a 20% (se forem esperados problemas de contaminação bacteriana, adicionar gentamicina a 0,5%) e foram incubadas a 37 °C sob CO2 a 10%. A cada 3 ou 4 dias o aparecimento da monocamada celular e a confluência (% da superfície da cultura ocupada pelas células) foram observados ao microscópio invertido. Se a confluência fosse menor que 60-80%, uma mudança de meio era feita; se a confluência fosse maior que 80%, a cultura de células era submetida à dissociação e expansão celulares (passagem) e as subculturas eram realizadas de modo a aumentar o número de e purificar a linha de célula CTM.
[00175] As células obtidas na primeira passagem foram lavadas, quantificadas e em suspensão em meio de criopreservação. A concentração de células foi estabelecida em 5-10x106 CTM por 1ml de meio de criopreservação feito de FBS a 90% + DMSO a 10% (crioconservante).
[00176] O procedimento de criopreservação foi realizado gradativamente, mantendo as células a -80 ± 8 °C por 24-72 horas. Após esse período de tempo, as células foram armazenadas sob nitrogênio líquido a nominalmente -196 °C até o uso.
[00177] A restauração, incluindo a re-expansão, da amostra foi programada de acordo com a data estabelecida para o tratamento que pode ser em até 6 a 20 anos após.
[00178] Durante a restauração, os crioprotetores foram removidos rapidamente, em 15-20 min, levando em consideração que a amostra deve ser devidamente temperada até sua temperatura de cultura (37 °C).
[00179] Por fim, as células foram recolocadas em suspensão em meio de cultura completo para realização de contagem e estudos de viabilidade celular, excluindo-se lotes de células com menos de 70% de viabilidade.
[00180] Uma vez conhecido o número de células viáveis restauradas, uma amostra de 5x105 células foi retirada para análise citogenética como visto abaixo nesse exemplo. A solução restante foi semeada a uma concentração entre 10005000 células por cm2.
[00181] Essa cultura foi mantida a 37 °C com CO2 a 10%. O meio foi trocado a cada 4 dias até que as células ocupassem 80-100% da superfície de crescimento. Nesse momento foi realizada uma dissociação com tripsina-EDTA. A restauração, incluindo o tempo de re-expansão, dura 10-15 dias desde o descongelamento.
[00182] A viabilidade celular foi maior que 80% e não mudou em cerca de 12 horas.
[00183] Os efeitos de várias composições na viabilidade celular ao longo de 3 dias de armazenamento sob condições hipotérmicas (2-8 °C) nas características funcionais da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas obtidas no Exemplo 1 foram investigados. Três meios diferentes foram usados para condicionar as CTMs para transporte, solução de Ringer com Lactato, SSP + solução de aditivo de plaquetas e Hypothermosol®-FRS, cujas composições são mostradas na Tabela 1.
[00184] As seguintes ações funcionais foram investigadas combinando as três soluções:
[00185] 1. A concentração de K do meio foi aumentada para favorecer o bombeamento de K+ através da membrana Na/K ATPase nas células e restauração dos gradientes de íons alcalinos, que se dissipam devido à inibição da membrana plasmática Na/K ATPase devido a redução da temperatura. Além disso, o teor de Mg2+ do meio foi aumentado para estabilizar a membrana plasmática.
[00186] 2. A capacidade tampão (fosfato, citrato, bicarbonato e HEPES) foi aumentada para melhor manutenção do pH. A presença de lactato e acetato também contribuiu para diminuir a produção de prótons durante o metabolismo.
[00187] 3. A potência nutritiva do meio foi favorecida pela adição de substratos metabólicos que atuam por diferentes vias metabólicas, tais como, glicose, acetato e adenosina.
[00188] 4. Osmólitos impermeáveis à membrana plasmática, tais como, lactobionato, sacarose, manitol ou dextrano, foram adicionados para se opor à lise das células osmóticas coloidais.
[00189] 5. Finalmente, a capacidade antioxidante foi aumentada pela complementação do meio com glutationa e o análogo solúvel da vitamina E ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox).
[00190] A atividade benéfica de cada um desses aditivos foi investigada para mostrar se os efeitos da modificação foram positivos. As diferentes soluções testadas são mostradas na tabela 1: TABELA 1
[00191] As Figs. 1 e 2 mostram os efeitos de várias composições na viabilidade celular durante 3 dias de armazenamento sob condições hipotérmicas. (2-8 °C).
[00192] A solução de transporte usual, Ringer com Lactato suplementado com glicose e albumina de soro humano (mostrado nos círculos nas figuras 1 e 2), estabilizou as CTMs criopreservadas e restauradas por 12 horas, mas não é adequado para períodos mais longos.
[00193] Uma combinação de SSP + (solução de aditivo de plaquetas, Ringwald et al. 2006, Transfusion Med Rev, vol 20, num 2, 158-164) com Ringer com Lactato suplementado com glicose e albumina sérica humana (Composição 1, mostrada com triângulos vazios nas figuras 1 e 2) também não melhorou suficientemente a viabilidade das células durante 3 dias de armazenamento sob condições hipotérmicas. (2-8 °C), no entanto, quando a essa solução trolox é adicionado para obter a composição 2 (mostrada com diamantes nas figuras 1 e 2), a estabilidade aumenta muito significativamente, como mostrado nas figuras 1 e 2, em que a referida composição forneceu mais de 80% de viabilidade após 72 horas.
[00194] A composição 3 com trolox também forneceu desempenho similar como visto na figura 2 (mostrado com triângulos preenchidos).
[00195] A preservação parecia adequada com as composições 2 e 3 mesmo após 7 dias a 4ºC.
[00196] Um estudo de 7 lotes originados de sete doadores diferentes, de composições compreendendo uma população enriquecida de CTMs funcionais, foi preparado com o meio isotônico com trolox, composição 3, de acordo com o Exemplo 2, diretamente após a obtenção das células como descrito no Exemplo 1, de acordo com ao método da presente invenção, foi realizado, e um grupo de parâmetros foi avaliado, a fim de: - provar que a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, de acordo com o método da invenção, é adequada para aplicação em terapia - provar que a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, preserva as características típicas das CTMs definidas pela Sociedade para Terapia Celular (ISCT) (Dominici et al., Cryotherapy, 2006, vol 8, No 4, 315 -317); (Wuchter et al, Cryotherapy, 2015, 17: 128-139), e - demonstrar a ausência de aberrações de fenótipo e genótipo na população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas no Exemplo 1.
[00197] Os parâmetros medidos foram: 1. morfologia celular medida pela capacidade de adesão; 2. desempenho celular medido como capacidade de expansão (crescimento) das células por cm2; 3. viabilidade celular medida com azul de tripano; 4. análise de imunofenótipo analisando expressão positiva de CD73, CD90, CD105 e CD166 e expressão negativa de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR; 5. esterilidade das composições obtidas de acordo com o método da invenção; e 6. estudos citogenéticos para verificar anormalidades estruturais e aberrações genéticas.
[00198] Morfologia: Em todos os 7 casos avaliados, as culturas celulares apresentaram células aderentes de aspecto fibroblástico.
[00199] Desempenho celular: O número de células por cm2 obtido é mostrado na Tabela 2 para a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas no Exemplo 1, (CTMs processadas) no Exemplo 1, e de CTMs de controle (CTMs de controle) que não desapareceram através do método da invenção. TABELA 2
[00200] Os números médios de células/cm2, 18391 vs 17377 (última linha na Tabela 2) não se diferem significativamente, indicando que o método da invenção não afetou o crescimento das células.
[00201] Viabilidade: A viabilidade celular obtida, da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1 (CTMs processadas) e de CTMs de controle (CTMs de controle) que não passaram pelo método da invenção, é mostrada na Tabela 3: TABELA 3
[00202] A viabilidade foi muito preservada e nenhuma diferença significativa entre os valores encontrados nos controles e nas células obtidas no Exemplo 1 (98 vs 95; ver última linha na Tabela 3)
[00203] Em todos os casos, a viabilidade celular deve ser >70%.
[00204] Em 2006, o ISCT propôs três critérios para definir as células mesenquimais: primeiro, essas células devem ser aderentes na cultura; segundo, expressar antígenos CD90 e CD105 na ausência de antígenos hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45; e terceiro, as células mesenquimais devem ser capazes de diferenciar “in vitro” em osteoblastos, adipócitos e condrócitos. Além disso, como essa população não apresenta fenótipo característico, outras moléculas de adesão como a presença de CD73, CD166 e a ausência de CD14 e HLA-DR devem ser analisadas.
[00205] O controle fenotípico da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais foi realizado por meio da análise dos antígenos de superfície por citometria de fluxo, o que nos permite verificar a presença de marcadores específicos de células mesenquimais.
[00206] Uma suspensão de 1 milhão de células-tronco mesenquimais funcionais em 2 ml de PBS foi preparada, distribuída em 4 tubos (250.000 células/tubo em um volume de 500 μl) e marcada com o padrão de anticorpo mostrado na Tabela 4 abaixo. As doses usadas foram as recomendadas pelo fabricante. Tabela: Padrão de combinação de anticorpos para análise de citometria TABELA 4
[00207] Os tubos foram incubados no escuro a 4 °C por 20 minutos. Após esse tempo, 2,5 ml de PBS foram adicionados para lavar e centrifugados por 5 minutos a 2.000 rpm. O sobrenadante foi removido e o sedimento celular recolocado em suspensão em 500 μl de PBS antes de passar a amostra pelo citômetro de fluxo.
[00208] A análise mostrou que tanto a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, quanto as CTMs de controle (CTMs novas) que não passaram pelo método da invenção, expressaram CD73, CD90, CD105 e CD166 (>90%) e foram negativos (<10%) para CD14, CD34, CD45 e HLA-DR.
[00209] Por outro lado, foi estudada a porcentagem de expressão dos marcadores usados no estudo imunofenotípico (ver Tabela 5) em sete doadores. TABELA 5
[00210] Os resultados obtidos na avaliação da esterilidade dos produtos estão de acordo com os critérios de aceitação estabelecidos. Nenhum crescimento microbiológico (detectado pela produção de CO2 em um sistema automatizado — Bact/Alerta e Monografia da Farmacopeia Europeia em conformidade 6.2.27) foi observado em qualquer caso e nenhuma presença de micoplasma foi detectada por procedimento baseado em PCR/NAT em conformidade com a Monografia da Farmacopeia Europeia 6.2.7.
[00211] Além de tudo o acima, o cariótipo da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtido no Exemplo 1, foi obtido e avaliado para descartar possíveis aberrações cromossômicas do medicamento.
[00212] No estudo citogenético realizado na população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas no Exemplo 1, não foram observadas anormalidades estruturais verificadas pelas bandas G (com resolução de 400 bandas).
[00213] Em resumo, a partir dos resultados obtidos nesse exemplo, podemos concluir que: 1. Tanto a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, (CTMs processadas) quanto as CTMs de controle (CTMs de controle) que não passaram pelo método da invenção são células aderentes de aparência fibroblástica.
[00214] 2. O número de células obtidas por cm2 na população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas no Exemplo 1, é o mesmo que no controle e suficiente para realizar controles de qualidade, bem como para obter doses de tratamento adequadas.
[00215] 3. A viabilidade da população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas no Exemplo 1, (CTMs processadas) e CTMs de controle (CTMs de controle), que não passaram pelo método da invenção, é a mesma e acima do limite fixo (>70%).
[00216] 4. O fenótipo de ambos, a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, (CTMs processadas) e CTMs de controle (CTMs de controle), que não passaram pelo método da invenção, atendem aos critérios estabelecidos pela Sociedade Internacional para Terapia Celular (ISCT): expressão de CD105 e CD90, na ausência de marcadores tipicamente hematopoiéticos, tais como CD34, CD45 e HLA-DR. As células (ambas, de controle e processadas) também são positivas para CD73, CD166 e não expressam CD14. Levando em consideração os percentuais de expressão obtidos, e seguindo os parâmetros estabelecidos no ISCT (Wuchter et al, 2015), foi estabelecido o critério de aceitação na expressão >90% para marcadores considerados positivos como CD73, CD90, CD105 e CD166, e a expressão <10% é considerado negativo para marcadores como CD14, CD34, CD45 e HLA-DR.
[00217] 5. Em resumo, o método da invenção não modifica ou transforma as características da população enriquecida de CTMs funcionais obtidas pelo referido método, sendo assim bioequivalente às CTMs que não passaram pelo método da invenção, as células novas usadas antes, que mostrou valor terapêutico significativo em várias indicações (Orozco, Transplantation, 2011, 92: 822-828; Orozco, Transplantation, 2013, 95(12): 1535-1541; Vega, Transplantation 2015, 99: 1681-1690; Noriega, Transplantation 2017, 101: 1945-1951).
[00218] 6. A população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, não apresenta aberrações genotípicas após o processo de criopreservação.
[00219] 7. A ausência de aberrações cromossômicas na população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida no Exemplo 1, permite-nos concluir que as CTMs permanecem estáveis quando sofrem até 10 duplicações.
[00220] Os objetivos do teste foram: - avaliar a esterilidade, a viabilidade e o imunofenótipo das composições que compreendem uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtidas de acordo com o método da invenção após um processo de transporte de 72 horas. - Mostrar que as CTMs das referidas composições mantêm a capacidade de re-expansão in vitro, isto é, a mesma capacidade de crescimento in vitro, após a realização de um processo de transporte de 72 horas.
[00221] Como uma fonte celular de obtenção de CTMs processadas de acordo com o método da invenção, um aspirado de medula óssea de 3 doadores diferentes foi usado e submetido ao procedimento anticoagulante de protocolo. A amostra do aspirado foi processada em até 24 horas após sua extração.
[00222] As composições que compreendem uma população enriquecida de CTMs funcionais foram obtidas de acordo com o método da invenção como descrito no Exemplo 1. A população enriquecida de CTMs funcionais obtida foi colocada em suspensão na composição 3 de acordo com o exemplo 3 acima nesse documento, e o processo de acondicionamento foi realizado em uma seringa de 5 ml em doses de 20 ± 2 milhões de células recolocadas em suspensão em 2 ml para uso em tratamentos de doença degenerativa do disco (DDD). Para uso na osteoartrite a dose de células seria de 40 milhões de células em suspensão em 8 ml.
[00223] A composição, que compreende uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, obtida de acordo com o método da invenção, tem um imunofenótipo característico de células mesenquimais, com a presença de anticorpos CD90, CD105, CD166 e CD73, e ausência de marcadores de CD14, CD34, CD45, HLA-DR.
[00224] A viabilidade celular deve ser maior que 90% para liberação para uso médico das composições obtidas e, a viabilidade das composições liberadas deve ser maior que 80% nas 72 horas de sua emissão (prazo de validade do produto) após realização de simulação de envio, desde que esse o produto tem estabilidade de 72 horas a 2-8 °C.
[00225] A dose para terapia foi de 20 ± 2 x 106 células em um volume final de 2 ml. O recipiente contendo a composição foi identificado por um rótulo contendo os dados do produto fabricado.
[00226] A composição foi transportada em equipamento ORCA que é um acondicionamento isotérmico validado que garante uma temperatura constante entre 2 e 8 °C por pelo menos 168 horas, em todas as épocas do ano e nas condições climáticas. Além disso, o acondicionamento não exige transporte em veículos refrigerados. Além disso, cada caixa incorporava um registrador de dados (termorregistrador) que fornecia um gráfico da temperatura na qual o produto havia sido mantido durante todo o tempo de transporte.
[00227] A acondicionamento ORCA® que consiste em uma caixa de 4,4L com dimensões externas 345 x 317 x 308 mm e um peso de 7,2 kg.
[00228] Para demonstrar que as composições obtidas nesse exemplo em suspensão com a composição 3, de acordo com a presente invenção, permanecem estáveis após o processo de transporte de 72 horas e mantém a esterilidade, a viabilidade e as características fenotípicas de CTMs definidas pela Sociedade para Terapia Celular (ISCT) (Dominici et al., Cryotherapy, 2006, vol 9, N° 4, 315-317), um estudo de 3 lotes foi realizado para avaliar os seguintes parâmetros: - Temperatura de transporte - Viabilidade celular - Análise imunofenotípica - Esterilidade - Teste de cinética de crescimento para verificar se as células mantêm a capacidade de se duplicar após o processo de transporte.
[00229] O acondicionamento isotérmico de ORCA permitiu que a temperatura de transporte fosse mantida por 72 horas em uma faixa de 2 a 8 °C.
[00230] A viabilidade celular foi avaliada 72 h após o processo de transporte, com o método de exclusão pelo Azul Tripano. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. A Tabela 6 mostra a viabilidade inicial dos doadores analisados e a viabilidade média obtida em 72 horas ± desvio padrão.
TABELA 6
[00231] Em todos os casos, a viabilidade celular em 72 horas foi >80%, atendendo aos critérios estabelecidos nesse estudo.
[00232] A análise de citometria de fluxo mostrou que 72 horas após as composições serem despachadas, as células testadas expressaram CD73, CD90, CD105 e CD166 e foram negativas para CD14, CD34, CD45 e HLA-DR em todos os padrões de expressão da composição. A Tabela 5 mostra a porcentagem de expressão dos marcadores analisados por citometria de fluxo no momento de transporte das composições e 72 horas após o transporte do produto. Todos os doadores apresentam fenótipo de células mesenquimais após o processo de transporte. TABELA 7
[00233] Testes de cinética de crescimento foram realizados registrando o número de células em diferentes intervalos de tempo durante a cultura após o processo de transporte. Esses resultados mostram que, para os três doadores analisados, a população enriquecida de CTMa funcionais mantém a capacidade de duplicação após um processo de transporte de 72 horas.
[00234] A esterilidade das composições foi avaliada após a simulação do transporte. Após 72 horas da obtenção da composição com a população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais, 3 processos de expansão celular foram iniciados. Essas expansões foram mantidas por um período de 11 dias com meios de cultura sem antibióticos. Nenhuma das três culturas apresenta sinais de contaminação microbiológica, todas apresentam cinética de crescimento adequada e, portanto, mantêm a esterilidade.
[00235] Com base nos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que: 1. A viabilidade das células mesenquimais nas composições obtidas com o método da invenção após um processo de transporte de 72 horas era >80%.
[00236] 2. No estudo da cinética de crescimento, observa-se que as células mesenquimais contidas nas composições, mantidas em meio de cultura sem antibiótico, preservam a esterilidade após o transporte.
[00237] 3. O fenótipo das células mesenquimais compreendidas nas composições após um processo de transporte de 72 horas obedece aos critérios estabelecidos pela Sociedade Internacional para Terapia Celular (ISCT): expressão de CD105 e CD90, na ausência de marcadores tipicamente hematopoiéticos, tais como CD34, CD45 e HLA-DR. Eles também são positivos para CD73, CD166 e não expressam CD14. Com porcentagens de expressão >90% para os marcadores positivos e <10% para os marcadores negativos.
[00238] 4. As células mesenquimais compreendidas nas composições mantêm a capacidade de re-expansão “in vitro” após realizarem um processo de transporte hipotérmico de 72 horas, uma vez que são capazes de se dividir.
[00239] O presente exemplo visa verificar a reprodutibilidade do processo, avaliar se o referido processo fornece um produto padronizado adequado para uso em terapia como produto medicinal e confirmar se o produto obtido atende a um conjunto de especificações do produto final.
[00240] Os aspirados de medula óssea foram a fonte celular para a obtenção das composições da invenção usadas no teste, processadas de acordo com os requisitos de doação estabelecidos pela Diretriz 2006/17/CE e espanhola RD1301/2006.
[00241] Os aspirados de medula óssea foram processados em 24 horas após a extração.
[00242] O rendimento e a viabilidade das células mononucleares nas amostras são mostrados na tabela 8: TABELA 8
[00243] O isolamento de amostras de células-tronco mesenquimais, para serem usadas no método da invenção, leva aproximadamente 21 a 28 dias, como detalhado acima. Uma fração de células mononucleares (CMNs) foi selecionada nas referidas amostras pelo método por gradiente de densidade com Ficoll. Ao final desse processo, foram realizados controles de contagem e viabilidade usando o método de exclusão por Azul Tripano com Câmara de Neubauer. Nesse momento, as células mononucleares com viabilidade maior que 70% foram selecionadas para iniciar o processo de obtenção das células mesenquimais.
[00244] Após o processo de seleção, as CMNs foram semeadas a uma densidade de 175.000 células/cm2 e mantidas em cultura a 37 °C e CO2 a 10%. A cada 3 ou 4 dias, o aparecimento da célula era observado ao microscópio invertido e a porcentagem de crescimento registrada. Se fosse menos de 60-80%, uma mudança de meio era feita, e se fosse maior que 80%, dissociação e expansão celulares (passagem) eram realizadas, realizando subculturas a fim de aumentar e purificar as CTMs sobre outras células não divisórias presentes na amostra.
[00245] Um estudo imunofenotípico foi realizado por citometria de fluxo e mostrou que as células mesenquimais da amostra expressavam CD73, CD90, CD105 e CD166 em uma porcentagem >90% e eram negativas para os marcadores de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR, uma vez que sua expressão era < 10%.
[00246] A Tabela 9 mostra a porcentagem de expressão dos marcadores analisados por citometria de fluxo no momento da obtenção da carga celular dos dois doadores analisados: TABELA 9
[00247] As células obtidas durante essa primeira etapa foram criopreservadas para a obtenção da amostra de células- tronco mesenquimais da etapa (a) do método da invenção.
[00248] Nesse ponto, uma digestão enzimática com tripsina-EDTA foi realizada permitindo a obtenção de uma suspensão celular que é criopreservada em FBS contendo DMSO a 10% ou com kits comerciais (CryoStor ® CS5) e armazenada em nitrogênio líquido a -196 °C por 24 dias.
[00249] O processo de restauração e revitalização dura aproximadamente 7 a 10 dias, permitindo a obtenção das composições contendo CTMs de acordo com a invenção.
[00250] O processo de restauração começa com o descongelamento de um criotubo incubado 1-2 min a 37 °C ou usando dispositivos automatizados, tal como um Instrumento de Descongelamento ThawSTAR® CFT2, e as células foram semeadas a uma densidade de 2.000 células/cm2.
[00251] Os controles realizados após o descongelamento das amostras apresentaram resultados satisfatórios, como observado na Tabela 10, em termos de viabilidade e contagem de células e, portanto, o processo de restauração celular foi iniciado para obtenção das composições da invenção. TABELA 10
[00252] A cultura foi mantida a 37 ± 2 °C e CO2 a 10%. A cada 3-4 dias, uma mudança de meio foi realizada. Durante esse processo, a cultura foi monitorada em microscópio invertido e foi verificado que as células mesenquimais preservam sua morfologia fibroblástica após o processo de criopreservação e descongelamento.
[00253] Quando a cultura atingiu 80% de confluência, as células-tronco mesenquimais foram recuperadas por dissociação enzimática com tripsina-EDTA.
[00254] A população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais recuperadas foi então recolocada em suspensão na composição 3 do exemplo 2, e o processo de acondicionamento foi realizado em uma seringa de 5 ml em doses de 20 ± 2 milhões de células recolocadas em suspensão em 2 ml.
[00255] A população enriquecida de células mesenquimais funcionais foi analisada por meio de estudos citogenéticos para verificar se apresentavam alterações ao nível do cariótipo após o processo de criopreservação e descongelamento. Os resultados obtidos nessa análise não mostram aberrações cromossômicas. Os resultados dos controles realizados são mostrados na Tabela 11:
TABELA 11
[00256] O estudo imunofenotípico realizado por citometria de fluxo com a substância ativa mostra que a população enriquecida de células mesenquimais funcionais das composições obtidas expressaram CD73, CD90, CD105 e CD166 em porcentagem >90% e foram negativos para CD14, CD34, CD45 e HLA-DR, pois sua expressão foi <10%. A Tabela 12 mostra a porcentagem de expressão dos marcadores analisados por citometria de fluxo no momento da obtenção da substância ativa dos dois doadores analisados: TABELA L2
[00257] Além disso, no estudo da potência realizado observa-se que as células se diferenciam em tecido condrogênico. Foram mantidos em cultura por 30 dias com meio condicionado e o estudo histológico foi realizado por coloração com Azul de Alcian que permite observar os polissacarídeos ácidos encontrados nas células diferenciadas em direção à cartilagem. Os resultados dos controles realizados no produto final são apresentados na tabela 13. TABELA 13
[00258] As composições obtidas, contendo uma população enriquecida de células-tronco mesenquimais funcionais obtidas de acordo com o método da invenção, continham 20 milhões ± 2 milhões de células recolocadas em suspensão na composição 3 de acordo com o Exemplo 2.
[00259] Nesse caso, optou-se pelo acondicionamento de 10 milhões em 1 ml por ser a densidade estabelecida para o tratamento de regeneração discal. Essas composições foram acondicionadas em uma seringa de 5 ml contendo 2 ml de suspensão celular, com uma estabilidade de 72 horas a 2-8 C.
[00260] O recipiente contendo as composições da invenção foi identificado com um rótulo incluindo os dados do produto. Esse recipiente foi então introduzido em um saco estéril e saiu da zona estéril para a área de acondicionamento, onde o acondicionamento secundário é realizado em uma caixa com a identificação correspondente.
[00261] As composições foram transportadas em acondicionamento isotérmico validado que garantiu temperatura mantida entre 2 e 8 °C por até 168 horas, contendo também um registrador de dados que fornece um gráfico da temperatura do produto ao longo de todo o processo de transporte.
[00262] Além disso, durante todo o processo de fabricação, é garantida a fabricação asséptica das composições.
[00263] Comparar o perfil de viabilidade celular das células-tronco mesenquimais incluídas nas composições obtidas de acordo com o método da invenção, com os métodos de criopreservação atuais.
[00264] Para essa finalidade, uma primeira amostra de células-tronco mesenquimais foi criopreservada com DMSO a 10% e FBS, restaurada a 35-39 °C com DMEM com CO2 a 10%, e condicionada para transporte para obtenção da composição 3 de acordo com o método da invenção.
[00265] Uma segunda amostra de células-tronco mesenquimais foi congelada em Hypothermosol® FRS (sem DMSO!) e descongelada em temperatura ambiente (21-25 °C).
[00266] Uma terceira amostra de células-tronco mesenquimais foi congelada em meio salino contendo DMSO a 10% e descongelada em temperatura ambiente (21-25 C).
[00267] Os valores são médias +/- DP de 3 doadores. Todas as medições foram feitas em triplicata.
[00268] Como pode ser visto na figura 3, as células- tronco mesenquimais incluídas nas composições obtidas de acordo com o método da invenção forneceram uma viabilidade acima de 80% mesmo após 72 horas de armazenamento (barras pretas). Por outro lado, células-tronco mesenquimais criopreservadas em Hypothermosol ® FRS, sem DMSO e descongeladas em temperatura ambiente (barras com linhas diagonais), apresentaram viabilidade menor que 50% após apenas 24 horas de armazenamento. Os resultados de viabilidade das células criopreservadas com DMSO em solução salina e diretamente descongeladas sem restauração de acordo com a etapa da invenção foram ainda menores. Apenas as composições obtidas de acordo com a invenção mostraram uma estabilidade e uma viabilidade adequadas para uso terapêutico adiado.
[00269] O perfil de crescimento celular das células- tronco mesenquimais na presença de DMSO foi analisado para avaliar o efeito do DMSO nos métodos de criopreservação atuais, que fazem uso das células diretamente após o descongelamento e podem estar contaminadas com DMSO.
[00270] Para essa finalidade, uma amostra de CTMs recém- preparadas foi cultivada em DMEM contendo FBS, CO2 a 10% e diferentes concentrações de DMSO, como mostrado.
[00271] A figura de referência 4 mostra que o DMSO interfere significativamente com o crescimento em concentrações tão baixas quanto 0,3%, sugerindo que mesmo uma pequena contaminação com DMSO, tal como a produzida durante o uso nas etapas de congelamento-descongelamento, pode impedir o crescimento.
[00272] O crescimento celular também foi avaliado para uma composição compreendendo células-tronco mesenquimais criopreservadas, restauradas e condicionadas para transporte obtidas de acordo com o método da invenção após descongelamento, restauração e 72 horas de transporte a 4 °C (CRT).
[00273] Para essa finalidade, uma amostra de células- tronco mesenquimais foi criopreservada com DMSO a 10% e FBS, restaurada a 35-39 °C com DMEM com CO2 a 10% por 7 dias, condicionada para transporte para obtenção da composição 3 de acordo com o método da invenção e incubada em hipotermia (2-8 °C) durante 72 horas e subsequentemente cultivada como na Figura 4.
[00274] A Figura 5 mostra como o perfil de crescimento das células-tronco mesenquimais incluídas nas composições obtidas no método da invenção é similar ao de células cultivadas sem DMSO (Figura 4). Isso significa que o processo de restauração descrito nesse documento elimina qualquer uma das possíveis interações e toxicidade encontradas no uso de DMSO durante a criopreservação, enquanto fornece um perfil de viabilidade celular significativamente melhorado, mesmo após 72 horas de armazenamento hipotérmico após restauração e condicionamento na solução de transporte, de acordo com o método da invenção.
[00275] A estabilidade, a viabilidade e o perfil de crescimento celular das composições obtidas de acordo com o método da invenção permitem seu armazenamento e uso adiado em terapia e resolvem os problemas de toxicidade de DMSO quando administradas. O método da invenção também permite a obtenção de células-tronco mesenquimais com fenótipo, crescimento celular e perfil de viabilidade adequados, em número suficiente para doses terapêuticas, resolvendo os problemas descritos na técnica anterior. Resultados ideais requerem não apenas composições adequadas em cada uma das etapas descritas, procedimentos de criopreservação, restauração e condicionamento para transporte, mas sequência e duração adequadas de cada etapa elementar.
Claims (16)
1. Método in vitro para a obtenção de uma composição compreendendo células-tronco mesenquimais funcionais adequadas para terapia, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a. colocar em suspensão uma amostra ex vivo de células- tronco mesenquimais da medula óssea em um meio crioprotetor compreendendo dimetilssulfóxido a 5% a 10% a uma concentração de 5x106 a 10x106 células/ml; b. criopreservar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, resfriando-as primeiro de -70 °C a -90 °C por pelo menos 24 horas antes de armazenar a amostra em nitrogênio líquido; c. restaurar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, realizando as seguintes etapas: d. . descongelar a amostra de células-tronco mesenquimais da medula óssea, aumentando progressivamente a temperatura até 35 a 39 °C durante 1 a 5 minutos; e. . diluir a amostra de 10 a 30 vezes o volume da amostra inicial com meio de cultura adequado para a amostra; f. . centrifugar a amostra, descartando o sobrenadante e recolocando em suspensão o pelete de células-tronco mesenquimais em meio de cultura adequado para a amostra; c4. selecionar as células-tronco mesenquimais com Petição 870230071809, de 14/08/2023, pág. 12/23 viabilidade de pelo menos 70%; c5. semear as células-tronco mesenquimais selecionadas na etapa (c4) em um suporte de plástico e incubar as referidas células-tronco mesenquimais com um meio de cultura adequado para cultivar as células-tronco mesenquimais compreendendo CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5% a uma concentração de células entre 1000 a 5000 células/cm2, com condições de cultura adequadas a 35 a 39 °C, c6. substituir por meio de cultura novo adequado para cultivar as células-tronco mesenquimais compreendendo CO2 a 7,5% a 10% e pelo menos soro fetal bovino a 5%, em intervalos de tempo regulares e isolando as células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas e restauradas do suporte quando as células ocupam 80 a 100% da superfície do suporte; c7. selecionar as células-tronco mesenquimais que: - apresentam aderência ao plástico; e - apresentam viabilidade de pelo menos 70%; e - apresentam uma expressão >90% de CD90, CD166, CD73 e CD105; e - apresentam uma expressão <10% de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%; e - não apresentam aberrações cromossômicas; e d. colocar em suspensão as células-tronco mesenquimais funcionais criopreservadas isoladas na etapa (c7) em um meio adequado para transporte e armazenamento a 2 a 8 °C para obter uma composição compreendendo células-tronco mesenquimais funcionais, em que o referido meio adequado para transporte e armazenamento a 2 a 8 °C é um meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25 a 1 mM.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio crioprotetor da etapa (a) compreende soro fetal bovino e DMSO 5% a 10%.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio crioprotetor da etapa (a) é um meio livre de componente e proteína de animal, compreendendo DMSO 5% a 10%.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende a criopreservação da amostra de células- tronco mesenquimais da medula óssea a uma velocidade de 1 °C/min de -70 °C a -90 °C por pelo menos 25 horas antes de armazenar a amostra em nitrogênio líquido.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM, é um meio livre de componente e proteína de animal.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio isotônico compreendendo ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25mM a 1mM compreende uma mistura de 1:9 a 9:1 (v/v) de uma primeira composição compreendendo Na+ 130 mM, K+ 4 mM, Ca2+ 1,35 mM, Cloreto 109 mM e lactato 16 mM, com uma segunda composição compreendendo Na+ 159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, Cloreto 77 mM, di- hidrogenofosfato 28 mM, citrato 10 mM e acetato 32 mM, suplementado com glicose 5 mM e albumina de soro humano 0,1% a 0,5%.
7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma população de pelo menos 0,5x106 células-tronco mesenquimais e ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2- carboxílico 0,25mM a 1mM obtenível de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as referidas células-tronco mesenquimais retêm por pelo menos 72 horas durante o transporte hipotérmico a 2 a 8 °C, a funcionalidade das células-tronco mesenquimais novas, incluindo: - mostrar aderência a plástico; - apresentar viabilidade de pelo menos 70%; Petição 870230071809, de 14/08/2023, pág. 15/23 - apresentar uma expressão >90% de CD90, CD166, CD73 e CD105; - apresentar uma expressão <10% de CD14, CD34, CD45 e HLA-DR <10%; - não apresentar aberrações cromossômicas; e - apresentar capacidade de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condrócitos.
8. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para produzir um medicamento.
9. Uso de uma composição, conforme definida na reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para produzir um medicamento para o tratamento autólogo ou alogênico de doenças osteoarticulares, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares.
10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a referida composição é administrada a uma densidade celular de 1x106 a 10x106 células/ml e a 0,5 a 90 milhões de células.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as doenças osteoarticulares são selecionadas do grupo que consiste em doença degenerativa do disco, osteoartrite, lesões meniscais e artrite reumatoide. Petição 870230071809, de 14/08/2023, pág. 16/23
12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as doenças osteoarticulares são selecionadas do grupo que consiste em doença degenerativa do disco, osteoartrite, lesões meniscais e artrite reumatoide.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as doenças autoimunes são selecionadas do grupo que consiste em lúpus eritematoso, doença do enxerto contra hospedeiro e esclerose sistêmica
14. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as doenças autoimunes são selecionadas do grupo que consiste em lúpus eritematoso, doença do enxerto contra hospedeiro e esclerose sistêmica.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as doenças cardiovasculares são selecionadas do grupo que consiste em insuficiência vascular periférica, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as doenças cardiovasculares são selecionadas do grupo que consiste em insuficiência vascular periférica, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia.
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