ES2948810T3 - Método para obtener una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, células así obtenidas y composiciones que las comprenden - Google Patents
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Abstract
Un método para obtener una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales para el transporte hipotérmico y la administración local de dicha población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales en terapia. Finalmente también se describe el uso de dicha población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, y composiciones que las comprenden, obtenidas mediante el método descrito, en el tratamiento autólogo o alogénico de enfermedades susceptibles a la terapia con células madre mesenquimales, ya sea mediante tratamientos locales o sistémicos, y más particularmente en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares tales como enfermedad degenerativa del disco, osteoartritis y reparación ósea; en lupus eritematoso, enfermedad de injerto contra huésped y otras enfermedades autoinmunes; en insuficiencia vascular periférica y otras enfermedades cardiovasculares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para obtener una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, células así obtenidas y composiciones que las comprenden
Campo de la invención
La presente invención proporciona un método para obtener una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenida a partir de una muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea, para el transporte hipotérmico y la administración local de dicha composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, en terapia. Por último, la presente invención se refiere al uso de dichas composiciones que comprenden una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenidas mediante el método descrito, en el tratamiento autólogo o alógeno de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales, mediante tratamientos o bien locales o bien sistémicos, y más particularmente en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares tales como discopatía degenerativa, osteoartritis y reparación ósea; en lupus eritematoso, enfermedad de injerto contra huésped y otras enfermedades autoinmunitarias; en insuficiencia vascular periférica y otras enfermedades cardiovasculares.
Antecedentes de la invención
El método de referencia en la terapia de la osteoartritis avanzada con impacto clínico es el reemplazo protésico.
Este es especialmente problemático en pacientes jóvenes, ya que las prótesis articulares tienen una duración limitada siendo además un procedimiento costoso, lo cual justifica la exploración de nuevos métodos terapéuticos potencialmente más eficaces.
En la médula ósea existe una población de células madre no hematopoyéticas denominada células progenitoras estromales o células madre mesenquimales (MSC). Estas células se caracterizan por su multipotencialidad, es decir, su capacidad de diferenciarse en otros tipos de células. Las MSC tienen una población de morfología fibroblástica fusiforme, que expresa los antígenos CD73, CD90 y CD105 y muestra ausencia de antígenos hematopoyéticos, marcadores de monocitos, macrófagos y linfocitos B. Además, conservan la capacidad de diferenciación in vitro hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos cuando se mantienen en entornos acondicionados adecuados.
La infusión intraarticular de células madre mesenquimales (MSC), por ejemplo, en la osteoartritis, es una de estas nuevas líneas de investigación, debido a su potencial regenerativo y antiinflamatorio reconocido.
Estudios con MSC en modelos animales han demostrado la capacidad de dichas MSC para sobrevivir tras su infusión en el entorno articular del cuerpo humano (tales como discos intervertebrales, rodillas, etc.) y, para reparar el cartílago de manera dependiente de la dosis.
Las MSC tienen, por tanto, la capacidad de regenerar tejidos dañados o destrozados, tales como huesos, cartílagos y otros tejidos. Además, se ha demostrado su capacidad para modular las reacciones inmunitarias y controlar la inflamación mediante su acción sobre los linfocitos T.
Las MSC pueden obtenerse de diferentes órganos y tejidos, pero la médula ósea representa una de sus mejores y más accesibles fuentes.
Sin embargo, la frecuencia de las MSC en la médula ósea es baja y sólo representa entre el 0,001 y el 0,01% de las células mononucleares de la médula ósea. El hecho de que, para un único tratamiento sistémico, se usen generalmente entre 1,0x106 y 2,0x106 MSC por kg de peso corporal y que, en los tratamientos locales una única dosis administrada localmente pueda llegar a 20-40x106 células, hace que, por tanto, no sea posible la recogida directa in situ de una cantidad tan grande a partir de la médula ósea.
La crioconservación permite que varias alícuotas de células madre mesenquimales de médula ósea puedan ser administradas como una única dosis, evitando así sucesivas intervenciones sobre el paciente y reduciendo parte de los costes de fabricación. Además, permite realizar eventualmente diferentes dosis para el tratamiento, mejorando así la eficacia del mismo.
Además, la crioconservación es esencial para llevar a cabo la administración alógena de MSC, reduciendo los costes y proporcionando una manera más eficiente de tratar a los pacientes en comparación con el uso de MSC autólogas, que necesitan ser recién preparadas a partir del mismo paciente que va a ser tratado, haciendo el tratamiento menos eficiente, más caro y logísticamente más complicado.
Sin embargo, la crioconservación no es un procedimiento sencillo, y a menudo da como resultado lesiones celulares graves, así como daños ocultos que no se manifiestan en el momento en el que se descongelan las células, sino solamente en una fase posterior. Esto compromete la funcionalidad de las MSC, tanto en su capacidad de diferenciación, como en su capacidad de regeneración del tejido dañado y en la velocidad a la que se realiza dicha regeneración. Además, si los agentes crioconservadores, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), permanecen en suspensión cuando son administradas las MSC, se han notificado reacciones adversas, tales como náuseas, taquicardia, bradicardia, hipotensión, etc. Por otra parte, el DMSO añadido a los cultivos celulares en concentraciones tan bajas como el 0,5% disminuye la tasa de proliferación de las MSC in vitro.
Por otro lado, la ruta alógena abre la posibilidad de tratar a pacientes con enfermedades autoinmunitarias, cuyas propias células podrían ser portadoras de la enfermedad que va a ser tratada y, por tanto, carecer de efectos curativos. Además, las MSC son mucho menos inmunogénicas que otros tipos celulares y no suelen desencadenar reacciones de rechazo e incluso, la producción de antígenos anti-HLA contra el donante es generalmente escasa o no detectable (J García-Sancho et al., Transplantation direct 3 (9): e205).
En la actualidad, existen varios trabajos que presentan la inyección de células mesenquimales crioconservadas en el torrente sanguíneo tras su descongelación, directamente y sin tratamientos previos. Sin embargo, siempre se prefiere la inoculación local de las MSC en la cavidad articular en los tratamientos de la osteoartritis, o en el disco intervertebral en la discopatía degenerativa, ya que todas las células pueden llegar al lugar que va a ser tratado y son poco susceptibles de ser atacadas por el sistema inmunitario del huésped cuando el tratamiento es alógeno. Por otro lado, el tratamiento local requiere la eliminación previa del agente crioprotector, ya que, de lo contrario, el agente crioprotector, a menudo dimetilsulfóxido (DMSO), interfiere en la multiplicación de las MSC. Incluso cuando ya se ha eliminado el DMSO, las células con daño oculto no son detectadas con ensayos de viabilidad o metabólicos y, tal como se ha explicado, dicho daño oculto compromete su viabilidad una vez administrado, así como la funcionalidad, tanto en su capacidad de diferenciación, como en su capacidad de regeneración del tejido dañado y la velocidad a la que se realiza dicha regeneración.
Por ejemplo, Marquez-Curtis et al. (Cryobiology 71 (2015) 181-197) proporcionan una revisión sobre cómo las diferentes condiciones/procesos usados para crioconservar y descongelar las células madre mesenquimales dan como resultado una viabilidad celular y capacidad de crecimiento de los productos celulares obtenidos variable. En particular, dicha revisión, propone múltiples soluciones para mejorar las propiedades de los productos celulares obtenidos después de la crioconservación. Por un lado, Marquez-Curtis et al., describen diferentes protocolos que modulan las condiciones de crioconservación (velocidad de congelación, temperatura de almacenamiento, % de crioprotector) con el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) para mejorar la calidad del producto celular después de la descongelación y limitar la toxicidad del DMSO. Por otro lado, los autores también proponen otros crioprotectores, tales como: glicerol; azúcares, tales como trehalosa, rafinosa, lactosa, sacarosa, etc.; antioxidantes; inhibidores apoptóticos o mezclas de los mismos; junto con procesos tales como: vitrificación; congelación en campo magnético; etc., para tratar de mantener la calidad de los productos celulares obtenidos después de la descongelación, al tiempo que se evitan los problemas de toxicidad, especialmente derivados del uso de DMSO. Al repasar el estado de la crioconservación, dicho artículo indica que es conocido que, después de la descongelación, se produce una pérdida significativa en la recuperación de células viables, los autores se limitan a sugerir una variedad de posibles soluciones que incluyen el cultivo de las células después de la descongelación, sin indicar las condiciones de cultivo,
el cultivo de las células antes de la crioconservación, el uso de moduladores químicos, tales como resveratrol o salubrinal, para disminuir la apoptosis, sin aportar ninguna pista concreta entre esas sugerencias.
Wei et al. (Veterinary surgery, 2018;47:19-29) también reconocen los problemas de toxicidad del DMSO y admiten la existencia de complicaciones prácticas para su eliminación, indicando que, el uso de dicho crioprotector provoca la pérdida de células y un menor número de unidades formadoras de colonias. En este sentido, este artículo apunta hacia el desarrollo de otros crioprotectores, diferentes al DMSO, como pista para desarrollar productos de células madre con perfiles de fenotipo, diferenciación y viabilidad adecuados, que puedan ser usados directamente después de la descongelación evitando los problemas de toxicidad del DMSO.
En la misma línea, Yuan et al. (Cryotherapy, 2016: 18: 860-869) coinciden en la necesidad de reemplazar el DMSO por sus problemas de toxicidad, y proponen ZENALB® 4.5 (un complemento proteico) como crioprotector para reemplazar el DMSO y obtener productos celulares que, directamente después de la descongelación, tengan perfiles adecuados de fenotipo, diferenciación y viabilidad.
La publicación de solicitud de patente internacional WO 2010/064054 A1 sigue también la misma línea de desarrollo, describiendo la toxicidad del crioprotector comúnmente usado, DMSO. La publicación propone, en su lugar, composiciones con Hypothermosol® y el antioxidante ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox) para almacenar células madre, incluyendo células madre mesenquimales, pero también para crioconservarlas, sin necesidad de DMSO como crioprotector. Una vez más, el documento WO 2010/064054 A1 propone el uso directo de las células después de la descongelación.
La publicación de solicitud de patente internacional WO 2017/068140 A1 describe terapias con células madre basadas en células derivadas del tejido adiposo. Dicha publicación propone un método en el que las células madre obtenidas de la fracción vascular del estroma de un lipoaspirado se cultivan en un biorreactor y, a continuación, son congeladas y descongeladas, al menos dos veces, y son administradas directamente después de la descongelación. Por tanto, se encuentra que la técnica anterior sugiere, como pista general para desarrollar productos celulares, incluyendo productos de células madre mesenquimales, que pueden usarse en el tratamiento después de la crioconservación, el reemplazo de DMSO para evitar los problemas de viabilidad y toxicidad encontrados, así como el uso directo del producto celular después de la descongelación.
Por otro lado, Alves et al. (Tissue Engineering; part A, vol. 19, números 7 y 8, 2013) analizan el efecto del estrés oxidativo que sufren las MSC durante el cultivo ex vivo y la pérdida gradual de su potencial de diferenciación y reducción de su eficacia clínica. Para ello, los autores proponen el uso de trolox como antioxidante para prevenir dicho daño oxidativo. Sin embargo, los autores concluyen que, aunque la complementación con trolox puede reducir el daño oxidativo durante los primeros periodos de cultivo, los efectos beneficiosos mostrados por los antioxidantes no pudieron, sin embargo, rescatar la capacidad de diferenciación de las MSC humanas tras su expansión in vitro.
Para ello, está claro que la principal cuestión clave para desarrollar terapias eficientes y normalizadas basadas en MSC es asegurarse de que la manipulación de dichas células, tal como crioconservación o expansión, no dañe las células comprometiendo su actividad, tal como la capacidad de multiplicarse y diferenciarse una vez administradas.
Además, es esencial formular las MSC en una composición que pueda conservar, durante el transporte y hasta su administración, su funcionalidad y viabilidad, que generalmente se pierden en el plazo de algunas horas.
La invención proporciona un método para obtener una población enriquecida de MSC funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, que se formulan en composiciones desarrolladas para el transporte hipotérmico y la administración local, que resuelve los problemas mencionados anteriormente.
Breve descripción de la invención
La presente invención se define de acuerdo a las reivindicaciones y se refiere a un método para obtener una
composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, adecuada para su administración en terapia, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. suspender una muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea en un medio crioprotector que comprende del 5% al 10% de dimetilsulfóxido a una concentración de 5x106 a 10x106 células/ml;
b. crioconservar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea, enfriándolas en primer lugar hasta de -70°C a -90°C durante al menos 24 horas antes de almacenar la muestra en nitrógeno líquido; c. restaurar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea, realizando las siguientes etapas:
c1. descongelar la muestra de las células madre mesenquimales de médula ósea aumentando progresivamente la temperatura hasta 35-39°C durante de 1 a 5 minutos;
c2. diluir la muestra de 10 a 30 veces el volumen de muestra inicial con un medio de cultivo adecuado; c3. centrifugar la muestra, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células madre mesenquimales en un medio de cultivo adecuado;
c4. seleccionar las células madre mesenquimales con una viabilidad de al menos el 70%; c5. sembrar las células madre mesenquimales seleccionadas en la etapa (c4) sobre un soporte de plástico e incubar dichas células madre mesenquimales con un medio de cultivo adecuado que comprende desde 7,5% hasta 10% de CO2y al menos 5% de suero bovino fetal, a una concentración celular de entre 1000 y 5000 células/cm2, con condiciones de cultivo adecuadas a 35-39°C,
c6. reemplazar con medio de cultivo recién preparado adecuado que comprende desde 7,5% hasta 10% de CO2 y al menos 5% de suero bovino fetal, a intervalos de tiempo regulares y aislar las células madre mesenquimales del soporte cuando las células ocupen del 80 al 100% de la superficie del soporte;
c7. seleccionar las células madre mesenquimales que:
- muestran adherencia al plástico; y
- presentan una viabilidad de al menos el 70%; y
- presentan una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105; y
- presentan una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%; y - no presentan aberraciones cromosómicas; y
- presentan capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos d. suspender las células madre mesenquimales aisladas en la etapa (c7) en un medio adecuado para el transporte y el almacenamiento a 2-8°C para obtener una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, en la que dicho medio adecuado para el transporte y el almacenamiento a 2-8°C es un medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
La presente invención se refiere además a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenibles mediante el método de la invención.
Además, la presente invención también se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenibles mediante el método de la invención, para uso como medicamento.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a un método para obtener una composición que comprende células madre mesenquimales (MSC) funcionales in vitro tal y como se define en las reivindicaciones. La materia aquí divulgada que no forma parte de las reivindicaciones o, que no forma parte de las realizaciones de la invención, ha sido identificada a modo de ejemplos de la presente divulgación. Dichos ejemplos se incluyen con propósito ilustrativo para ayudar en la comprensión de la invención proporcionando información específica de posibles formas preferidas
de poner en práctica la invención definida en las reivindicaciones. El método de la invención para obtener una composición que comprende células madre mesenquimales (MSC) funcionales in vitro, tal y como se define en las reivindicaciones comprende las etapas de:
a. suspender una muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea en un medio crioprotector que comprende del 5% al 10% de dimetilsulfóxido a una concentración celular de 5x106 a 10x106 células/ml;
b. crioconservar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea disminuyendo la temperatura, enfriándolas en primer lugar hasta de -70°C a -90°C durante al menos 24 horas antes de almacenar la muestra en nitrógeno líquido;
c. restaurar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea, realizando las siguientes etapas:
c1. descongelar la muestra de las células madre mesenquimales de médula ósea aumentando progresivamente la temperatura hasta 35-39°C durante de 1 a 5 minutos;
c2. diluir la muestra de 10 a 30 veces el volumen de la muestra con un medio de cultivo adecuado; c3. centrifugar la muestra, descartar el sobrenadante y resuspender las células madre mesenquimales en un medio de cultivo adecuado;
c4. seleccionar las células madre mesenquimales con una viabilidad de al menos el 70%; c5. sembrar las células madre mesenquimales seleccionadas en la etapa (c4) sobre un soporte de plástico e incubar dichas células madre mesenquimales con un medio de cultivo adecuado que comprende del 7,5% al 10% de CO2 y al menos 5% de suero bovino fetal, a una concentración de entre 1000 y 5000 células/cm2, con condiciones de cultivo adecuadas a 35-39°C, c6. reemplazar con un medio de cultivo recién preparado que comprende del 7,5% al 10% de CO2 y al menos 5% de suero bovino fetal, a intervalos regulares de tiempo y aislar las células madre mesenquimales del soporte cuando las células ocupen del 80 al 100% de la superficie del soporte; c7. seleccionar las células madre mesenquimales que:
- muestran adherencia al plástico; y
- presentan una viabilidad de al menos el 70%; y
- presentan una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105; y
- presentan una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%; y - no presentan aberraciones cromosómicas; y
- presentan capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos
d. suspender las células madre mesenquimales aisladas en la etapa (c7) en un medio adecuado para el transporte y almacenamiento a 2-8°C para obtener una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, donde dicho medio adecuado para el transporte y almacenamiento a 2-8°C es un medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,25 a 1 mM.
Por ejemplo, el medio de cultivo adecuado comprende al menos 5% de suero bovino fetal con del 7,5% al 10% de CO2 y la cantidad requerida de -HCO3. En este sentido, la proporción de CO2 y -HCO3 en el medio de cultivo adecuado se mantiene constante, incluyendo una concentración de CO2 de desde el 7,5% hasta el 10%, y al menos 5% de suero bovino fetal.
El término “medio isotónico”, para los fines de la presente descripción, se refiere a una disolución que conserva el volumen de las células al tener la misma osmolaridad efectiva, o concentración de solutos no permeables, que las células, es decir, tiene la misma presión osmótica que el interior de las células. Por consiguiente, las disoluciones isotónicas permiten el libre intercambio de agua a través de la membrana cuando las células están suspendidas en dichas soluciones y mantienen el volumen de las células suspendidas en ellas.
El ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, o trolox, es un análogo de la vitamina E.
En una realización más preferida, dicho medio adecuado para el transporte y el almacenamiento a 2-8°C es un medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM es un medio libre de proteínas, libre de suero, libre de componentes animales, que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM.
Por ejemplo dicho medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM es un medio que comprende Na+100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, cloruro 17 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, HCO35 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, dextrano con un peso molecular medio de 40000 al 6%, adenosina 2 mM, glutatión 3 mM, glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM.
En otra realización preferida, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:9 a 9:1 (v/v) de una primera composición que comprende Na+ 130 mM, K+ 4 mM, Ca2+ 1,35 mM, cloruro 109 mM y lactato 16 mM, con una segunda composición que comprende Na+159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, cloruro 77 mM, fosfato de dihidrógeno 28 mM, citrato 10 mM y acetato 32 mM, complementado con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM.
En un ejemplo aquí descrito, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:9, o 1:4, o 1:3 o 1:1, o 3:1 o 4:1 o 9:1 (v/v) de dicha primera composición y dicha segunda composición, complementada con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM.
En otro ejemplo aquí descrito, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:1 (v/v) de dicha primera composición y dicha segunda composición, complementada con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,5 mM.
En otro ejemplo que aquí se describe, dicho medio isotónico comprende glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,5 mM.
En otro ejemplo también aquí descrito, dicho medio isotónico comprende albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM.
La presente invención también se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales adecuada para administración en la terapia, obtenible según el método para obtener células madre mesenquimales (MSC) in vitro, descrito anteriormente en el presente documento.
Una realización de la presente invención se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales obtenibles según el método descrito en el presente documento, para uso como medicamento, en particular para uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales. Otra realización se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenibles según el método descrito anteriormente en el presente documento, para uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales, en la que dicha composición que comprende células madre mesenquimales funcionales se administra localmente o en tratamientos sistémicos.
Otra realización se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenibles según el método descrito anteriormente en el presente documento, para uso en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares, reparación ósea; enfermedades autoinmunitarias y enfermedades cardiovasculares.
En una realización, las enfermedades osteoarticulares se seleccionan de entre discopatía degenerativa, osteoartritis, lesiones de menisco y artritis reumatoide,
En una realización, las enfermedades autoinmunitarias se seleccionan de entre lupus eritematoso, enfermedad de
injerto contra huésped y esclerosis sistémica.
En una realización, las enfermedades cardiovasculares se seleccionan de entre insuficiencia vascular periférica, infarto de miocardio, ictus e isquemia.
Dicha composición que comprende MSC funcionales puede conservar la funcionalidad de las MSC recién obtenidas después de la descongelación y también durante el transporte hipotérmico a de 2 a 8°C durante al menos 72 horas.
Para los fines de la presente descripción, las células madre mesenquimales de médula ósea son células madre no hematopoyéticas presentes en la médula ósea que se caracterizan por su multipotencialidad mesodérmica y que, por consiguiente, pueden diferenciarse hacia osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
Según la presente descripción, el término “población de células madre mesenquimales funcionales” se refiere a una muestra de células madre mesenquimales que comprende una cantidad de células madre mesenquimales adecuadas para uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales, y en la que dicha muestra comprende únicamente células madre mesenquimales con las características funcionales de las células madre mesenquimales recién obtenidas, es decir, que muestren adherencia al plástico; presenten una viabilidad de al menos el 70%; presenten una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105; presenten una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%; no presenten aberraciones cromosómicas y presenten capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
Para los fines de la presente descripción, “una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales” se refiere a un grupo de al menos 0,5x106 células madre mesenquimales funcionales que muestran adherencia al plástico; presentan una viabilidad de al menos el 70%; presentan una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105; presentan una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%; no presentan aberraciones cromosómicas y presentan capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
Para los fines de la presente descripción, el término “células crioconservadas” son células mantenidas a temperaturas de -70°C o inferiores que, debido a la baja temperatura de conservación, tienen sustancialmente detenida cualquier actividad metabólica o química que pudiera provocar daños a las células.
Para los fines de la presente descripción, el término “células crioconservadas y restauradas” o “muestra crioconservada y restaurada de células madre mesenquimales” y términos equivalentes, se refieren a células madre mesenquimales que previamente se han crioconservado, descongelado, diluido, aislado y cultivado en un medio de cultivo adecuado que comprende suero bovino fetal al menos al 5%, altos niveles de CO2, a 35-39°C, según el método de la invención, en el que dichas células crioconservadas y restauradas presentan sustancialmente toda la actividad metabólica y química de las células madre mesenquimales recién obtenidas y tienen una viabilidad de al menos el 70%, más preferiblemente una viabilidad de al menos el 80% y aún más preferiblemente una viabilidad de al menos el 90%.
Para los fines de la presente descripción, el término “células crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte” o “células madre mesenquimales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte” y términos equivalentes, se refiere a las células madre mesenquimales que previamente se han crioconservado y restaurada en un medio de cultivo adecuado que comprende suero bovino fetal al menos al 5%, altos niveles de CO2, a 35-39°C y que, después del aislamiento, se acondicionan para el transporte, en una suspensión que comprende un medio isotónico, adecuado para el transporte y almacenamiento a 2-8°C, que comprende trolox de 0,25 mM a 1 mM.
En este sentido, para los fines de la presente descripción, el término “acondicionado” es equivalente a “acondicionado para el transporte” o “acondicionado para el transporte y el almacenamiento a 2-8°C”.
El término “comprende(n)” se interpreta en el sentido de que incluye un grupo de características, pero que no excluye la presencia de otras características, siempre que no hagan inviable la reivindicación. Para ello, para los fines de la
presente descripción, el término “comprende” puede reemplazarse por el término “que consiste en” y el término “que consiste esencialmente en”. De este modo, cuando el término “comprende(n)” se refiere a un grupo de características A, B y C, debe interpretarse que incluye eventualmente otras características diferentes de A, B y C, siempre que no hagan inviable la reivindicación, pero también puede interpretarse que sólo incluye dichas características A, B y C, o que sólo incluye sustancialmente dichas características y, por consiguiente, debe interpretarse que “comprende(n)” incluye también un grupo “constituido por” características A, C y C y un grupo “constituido esencialmente por” características A, B y C.
Las células madre mesenquimales pueden originarse a partir de células mononucleares de médula ósea ex vivo. Dichas células mononucleares de médula ósea ex vivo incluyen varios tipos de células madre de médula ósea ex vivo, incluyendo células madre hematopoyéticas ex vivo, células madre mesenquimales ex vivo, células progenitoras endoteliales ex vivo y otras células madre precursoras. Después de un traumatismo, los factores de crecimiento celular pueden promover la diferenciación tisular de las MSC de médula ósea, lo que posibilita la reparación de los órganos lesionados y el restablecimiento de su función.
Las MSC presentan una fuerte adhesión al plástico en cultivo. Esta capacidad de adhesión se usa para el aislamiento y la purificación de dichas MSC a partir de células mononucleares de la médula ósea.
En un ejemplo, el método para obtener una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales adecuada para administración en terapia aquí descrito, se lleva a cabo en de 10 a 15 días.
En un ejemplo aquí descrito, la muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea comprende al menos 8x106 células madre mesenquimales de médula ósea.
En un ejemplo aquí descrito, la muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea comprende de 8x106 a 10x 106 células madre mesenquimales de médula ósea.
Por ejemplo, preferiblemente, la muestra ex vivo comprende células madre mesenquimales de médula ósea con una viabilidad de al menos el 90%.
Por ejemplo, preferiblemente, la muestra ex vivo comprende de 8x106 a 10x106 células madre mesenquimales con una viabilidad de al menos el 90%, con expresión de CD90, CD 166, CD73 y CD105 >90% y con expresión de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%.
En un ejemplo, la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea ex vivo se proporciona en un soporte de plástico, se separa del soporte de plástico usando un método enzimático y, se resuspende en un medio adecuado.
Ejemplos de soportes de plástico preferidos son soportes de plástico hidrófilos o soportes de plástico cargados negativamente. En un ejemplo preferido dicho soporte de plástico preferido comprende grupos hidrófilos. En un ejemplo, dichos soportes de plástico son soportes de plástico tratados con tejidos que tienen un carácter hidrófilo.
Ejemplos comerciales de dichos soportes de plástico preferidos son los soportes Corning CellBIND®.
En un ejemplo preferido, previamente a la etapa (a) se llevan a cabo las siguientes etapas:
i. lavar con un medio adecuado la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea ex vivo en un soporte de plástico;
ii. añadir una disolución enzimática e incubar en condiciones adecuadas para el medio usado;
iii. inactivar la disolución enzimática añadiendo un volumen igual de medio;
iv. centrifugar y descartar el sobrenadante.
En un ejemplo preferido, el medio adecuado para el lavado de las células en la etapa (i) es el medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM).
En otro ejemplo preferido, la etapa (i) se lleva a cabo en un medio de cultivo seleccionado de entre medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medios de suero reducidos de medios esenciales mínimos de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle modificado con nucleósidos, glucosa, etc., o cualquier otro medio de cultivo adecuado.
En un ejemplo preferido, cuando el medio adecuado es DMEM, la etapa (ii) comprende la adición de una disolución enzimática y la incubación durante de 5 a 10 minutos a 35-37°C bajo 10% de CO2, más preferiblemente a 37°C.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios y condiciones de cultivo, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el cultivo de la etapa (i).
Por ejemplo, preferiblemente, la disolución enzimática usada en la etapa (ii) comprende tripsina al 0,05% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico al 0,02% en solución salina equilibrada de Hanks.
Un ejemplo comercial de la disolución enzimática usada en la etapa (ii) es una disolución de tripsina-EDTA 1X (Sigma 9417C).
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (iv) comprende centrifugar la muestra a de 300 a 500 g a de 15 a 25°C durante de 5 a 10 minutos, más preferiblemente a 400g a 20°C durante 5 minutos.
En un ejemplo preferido, la etapa (a) comprende proporcionar una muestra de 8x106 a 10x106 células madre mesenquimales con una viabilidad de al menos el 90%, con expresión de CD90, CD 166, CD73 y CD105 >90% y con expresión de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%.
Por ejemplo, preferiblemente, la muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea usada en la etapa (a) se obtiene mediante un método que comprende las etapas de:
I. proporcionar una muestra ex vivo de al menos 30 ml de aspirado de médula ósea filtrado;
II. someter el aspirado de médula ósea ex vivo a un anticoagulante;
III. seleccionar las células mononucleares del aspirado de médula ósea ex vivo;
IV. seleccionar las células mononucleares con una viabilidad superior al 70%;
V. sembrar las células mononucleares a de 1,5x106 a 2x106 células/cm2 en un soporte de plástico, en un medio de cultivo adecuado e incubarlas en condiciones de cultivo adecuadas;
VI. medir el porcentaje de crecimiento celular y el aspecto de las células madre mesenquimales adheridas al soporte de plástico a intervalos regulares de tiempo y
VI.1 cambiar el medio de cultivo cuando el porcentaje de crecimiento celular sea inferior al 60%, retirando el sobrenadante; o
VI.2 aislar la muestra de células madre mesenquimales adheridas al soporte de plástico si el porcentaje de crecimiento celular es superior al 80%;
VI.3 realizar subcultivos de hasta 2 pases con el fin de aumentar y purificar dichas células madre mesenquimales y aislar las células madre mesenquimales adheridas al soporte de plástico de cada uno de los subcultivos si el porcentaje de crecimiento es superior al 80%.
Por ejemplo, preferiblemente, el método para obtener una muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea de la etapa (a), a partir de una muestra ex vivo de aspirado de médula ósea, se lleva a cabo en de 8 a 10 días.
En un ejemplo, el anticoagulante usado en la etapa (II) es la heparina.
En un ejemplo, la etapa (III) comprende la selección de las células mononucleares del aspirado óseo ex vivo mediante un gradiente de densidad.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (III) comprende la selección in vitro de las células mononucleares del aspirado óseo ex vivo por gradiente de densidad usando una disolución que comprende Ficoll, que comprende:
111.1 añadir lentamente una disolución de Ficoll a la muestra de aspirado de médula ósea ex vivo; 111.2 centrifugar la muestra a de 300 a 500 g, a de 15 a 25°C durante al menos 30 minutos sin freno; 111.3 aislar y lavar la interfaz con un medio adecuado;
111.4 centrifugar y descartar el sobrenadante;
111.5 lavar el sedimento con un medio adecuado;
111.6 centrifugar y descartar el sobrenadante;
111.7 resuspender el sedimento con las células mononucleares en un medio de cultivo adecuado.
En un ejemplo preferido, la etapa I comprende la adición lenta de una disolución de Ficoll en una proporción de 2:3 (v:v) a la muestra de aspirado de médula ósea ex vivo.
En un ejemplo preferido, el lavado se lleva a cabo con tampón fosfato que contiene albúmina sérica humana 0,5.
En otro ejemplo preferido, el lavado se lleva a cabo con una solución salina fisiológica en la etapa III.3.
En otro ejemplo preferido, el lavado se lleva a cabo con solución de Ringer.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa III.4 comprende la centrifugación de la muestra a de 300 a 500 g a de 15 a 25°C durante de 5 a 10 minutos, más preferiblemente a 400g a 20°C durante 5 minutos.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa III.6 comprende la centrifugación de la muestra a de 300 a 500 g a de 15 a 25°C durante de 5 a 10 minutos, más preferiblemente a 400g a 20°C durante 5 minutos.
En un ejemplo preferido, las células mononucleares seleccionadas en la etapa (IV) tienen una viabilidad superior al 70%, más preferiblemente superior al 80% y más preferiblemente superior al 90%.
Por ejemplo, preferiblemente, la viabilidad de las células mononucleares se determina mediante una prueba de exclusión de colorantes. Dichas pruebas de exclusión de colorantes se basan en el principio de que las células vivas poseen membranas celulares intactas que excluyen determinados colorantes, tales como azul tripano, mientras que las células muertas no lo hacen. En esta prueba, simplemente se mezcla una suspensión de células con colorante y luego se examina visualmente para determinar si las células absorben o excluyen el colorante. Las células que excluyen el colorante son, por tanto, células vivas.
En un ejemplo preferido, la etapa V se lleva a cabo en un medio de cultivo seleccionado de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medios de suero reducidos de medios esenciales mínimos de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle modificado con nucleósidos, glucosa, etc., o cualquier otro medio de cultivo adecuado.
En un ejemplo preferido, la etapa V se lleva a cabo sembrando las células mononucleares a de 1,5x106 a 2x106 células/cm2 en un soporte de plástico, en DMEM con suero bovino fetal al menos al 5% (FBS) e incubando a 35-39°C bajo del 7,5% al 10% de CO2. El medio de cultivo comprende preferiblemente, suero bovino fetal al menos al 5% con del 7,5% al 10% de CO2 y la cantidad requerida de -HCO3.
En otro ejemplo preferido, la etapa V se lleva a cabo sembrando las células mononucleares a de 1,5x106 a 2x106 células/cm2 en un soporte de plástico, en DMEM, con FBS al menos al 5% y gentamicina al 0,5% e incubando a 35-39°C bajo el 7,5-10% de CO2.
Ejemplos de soportes de plástico preferidos son soportes de plástico hidrófilos o soportes de plástico cargados negativamente. En un ejemplo preferido, dicho soporte de plástico preferido comprende grupos hidrófilos. En un ejemplo preferido, dichos soportes de plástico preferidos son soportes de plástico tratados con tejidos que tienen un
carácter hidrófilo. Ejemplos comerciales de dichos soportes de plástico preferidos son los soportes Corning CellBIND®.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios y condiciones de cultivo, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el cultivo de la etapa (V).
Por ejemplo, preferiblemente, en la etapa VI, si el porcentaje de crecimiento celular es inferior al 60-80% se realiza un cambio de medio.
Por ejemplo, preferiblemente, en la etapa VI si fuera mayor al 80% el cultivo celular se somete a disociación y expansión celular realizando subcultivos de hasta 2 pases para aumentar y purificar la línea celular de MSC.
En un ejemplo preferido, la etapa (VI.3) comprende aislar las células madre mesenquimales adheridas al soporte de plástico de cada uno de los subcultivos si el porcentaje de crecimiento celular es superior al 80%; en la que el aislamiento comprende:
i. lavar con un medio adecuado la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea en un soporte de plástico;
ii. añadir una disolución enzimática e incubar en condiciones adecuadas para el medio usado;
iii. inactivar la disolución enzimática añadiendo un volumen igual de medio;
iv. centrifugar y descartar el sobrenadante.
En un ejemplo preferido, el medio adecuado para el lavado de las células en la etapa (i) es medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
En un ejemplo preferido, cuando el medio adecuado es DMEM, la etapa (ii) comprende la adición de una disolución enzimática y la incubación durante de 5 a 10 minutos a de 35 a 39°C bajo el 10% de CO2.
Por ejemplo, preferiblemente, la disolución enzimática usada en la etapa (ii) es una disolución que contiene tripsina al 0,05% y ácido etilendiaminotetraacético de sodio al 0,02% y al 0,05%. Preferiblemente, la disolución enzimática usada en la etapa (ii) comprende tripsina al 0,05% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico al 0,02% en solución salina equilibrada de Hanks.
Por ejemplo, preferiblemente el centrifugado de la etapa (iv) se realiza a 300-500 g a de 15 a 25°C y durante 30 minutos.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios y condiciones diferentes, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el aislamiento de las células madre mesenquimales de la etapa (VII). En un ejemplo preferido, la muestra ex vivo de células madre mesenquimales obtenida anteriormente, para su uso en la etapa (a), tiene una viabilidad de al menos el 90%, con expresión de CD90, CD 166, CD73 y CD105 >90% y con expresión de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%.
En un ejemplo preferido, la muestra de aspirado de médula ósea ex vivo contiene más de 3000 leucocitos/^!.
En un ejemplo preferido, la muestra de aspirado de médula ósea ex vivo es una muestra de aspirado de médula de la cresta ilíaca ex vivo.
En un ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende un medio que comprende suero bovino fetal y DMSO a del 5 al 10%.
En un ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende DMSO al 5% y suero bovino fetal al 95%. En otro ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende DMSO al 10% y suero bovino fetal al
90% .
En otra realización preferida, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende un medio libre de proteínas, libre de suero, libre de componentes animales, que comprende DMSO al 5%.
En otra realización preferida, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende un medio libre de proteínas, libre de suero, libre de componentes animales, que comprende DMSO al 10%.
En un ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende DMSO a del 5 al 10%, y del 95 al 90% de una composición isotónica que comprende Na+ 100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, cloruro 17 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, HCO3- 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, dextrano con un peso molecular medio de 40000 al 6%, adenosina 2 mM, glutatión 3 mM, glucosa 5 mM.
En un ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende DMSO al 5%, y del 95 al 90% de una composición isotónica que comprende Na+100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, cloruro 17 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, HCO3- 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, dextrano con un peso molecular medio de 40000 al 6%, adenosina 2 mM, glutatión 3 mM, glucosa 5 mM.
En un ejemplo preferido, el medio crioprotector de la etapa (a) comprende DMSO al 10%, y del 95 al 90% de una composición isotónica que comprende Na+100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, cloruro 17 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, HCO3- 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, dextrano con un peso molecular medio de 40000 al 6%, adenosina 2 mM, glutatión 3 mM, glucosa 5 mM.
En una realización preferida, la etapa (b) comprende crioconservar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea a una velocidad de 1°C/min hasta de -70°C a -90°C durante al menos 25 horas antes de almacenar la muestra en nitrógeno líquido.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c) de restauración de las células madre mesenquimales crioconservadas se inicia según la fecha establecida para el tratamiento que puede ser de hasta 6 a 20 años.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c1) se lleva a cabo rápidamente, en de 15 a 20 minutos.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c1) comprende la descongelación de las células madre mesenquimales crioconservadas mediante el aumento progresivo de la temperatura hasta 35-39°C durante de 1 a 5 minutos, manteniendo una velocidad controlada de aumento de la temperatura. Un equipo adecuado para descongelar las células madre mesenquimales crioconservadas en la etapa (c1) es un ThawSTAR® CFT2.
En un ejemplo preferido, el medio de cultivo adecuado de la etapa (c2) es medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al menos al 5% y del 7,5% al 10% de CO2. El medio de cultivo comprende preferiblemente, al menos suero bovino fetal al 5% con del 7,5% al 10% de CO2 y la cantidad requerida de -HCO3.
En otro ejemplo preferido, el medio de cultivo adecuado de la etapa (c2) se selecciona de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medios de suero reducidos de medios esenciales mínimos de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle modificado con nucleósidos, glucosa, etc., o cualquier otro medio de cultivo adecuado que incluye del 7,5% al 10% de CO2 y suero bovino fetal al menos al 5%.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios de cultivo que comprenden FBS al menos al 5% y altos niveles de CO2 y -HCO3, y condiciones a 35-39°C, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el cultivo de la etapa (c2).
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c3) comprende centrifugar la muestra, descartar el sobrenadante y resuspender las células madre mesenquimales en un medio de cultivo adecuado a una concentración de 1x106 a 5x106 células/ml.
Preferiblemente, dicho medio de cultivo adecuado incluye del 7,5% al 10% de CO2 y bovino fetal al menos suero al 5%.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c3) comprende centrifugar la muestra a de 300 a 500 g a de 15 a 25°C durante de 5 a 10 minutos, más preferiblemente a 400g a 20°C durante 5 minutos.
Por ejemplo, preferiblemente, la viabilidad celular de las células madre mesenquimales, en la etapa (c4), se determina mediante un ensayo de exclusión de colorantes.
Por ejemplo, preferiblemente, la viabilidad celular de las células madre mesenquimales, en la etapa (c4), se determina usando azul tripano.
Dichas pruebas de exclusión de colorantes se basan en el principio de que las células vivas poseen membranas celulares intactas que excluyen determinados colorantes, tales como azul tripano, eosina o propidio, mientras que las células muertas no lo hacen. En esta prueba, simplemente se mezcla una suspensión de células con colorante y luego se examina visualmente para determinar si las células absorben o excluyen el colorante. Las células que excluyen el colorante son, por tanto, células vivas.
Por ejemplo, preferiblemente, la etapa (c6) comprende reemplazar con medio de cultivo recién preparado adecuado, que comprende altos niveles de CO2, preferiblemente suero bovino fetal al menos al 5% y del 7,5% al 10% de CO2, a intervalos de tiempo regulares y aislar la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas y restauradas del soporte cuando las células ocupan del 80 al 100% de la superficie del soporte. En un ejemplo preferido, el medio de cultivo adecuado de la etapa (c5) y (c6) es medio de Eagle modificado por Dulbecco con del 7,5% al 10% de CO2, con la cantidad requerida de -HCO3 y suero bovino fetal al menos al 5%. En otro ejemplo preferido, el medio de cultivo adecuado de la etapa (c5) y (c6) se selecciona de medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), medios de suero reducidos de medios esenciales mínimos de Eagle, medio esencial mínimo de Eagle, o cualquier otro medio de cultivo adecuado con del 7,5% al 10% de CO2 y suero bovino fetal al menos al 5%.
Por ejemplo, preferiblemente, el cultivo de la etapa (c5) y (c6) se mantendrá a 35-39°C con del 7,5% al 10% de CO2 con un medio de cultivo adecuado que comprenda suero bovino fetal al menos al 5%. El medio de cultivo comprende además la cantidad requerida de -HCO3.
Por ejemplo, preferiblemente, el cultivo de la etapa (c5) se mantendrá en las condiciones de cultivo adecuadas para el medio de cultivo seleccionado.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios y condiciones de cultivo de 35-39°C, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el cultivo de la etapa (c5) y (c6) que comprenden altos niveles de CO2 y suero bovino fetal al menos al 5%.
Por ejemplo, preferiblemente, en la etapa (c5) se cambia el medio cada 3 a 4 días hasta que las células ocupen el 80-100% de la superficie de crecimiento, obteniendo un rendimiento de 10000 a 40000 células/cm2. Preferiblemente la etapa (c5) se realiza en de 10 a 15 días.
En un ejemplo preferido, la etapa (c6) comprende aislar la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas y restauradas del soporte cuando las células ocupan del 80 al 100% de la superficie del
soporte; en la que el aislamiento comprende:
i. lavar con un medio adecuado la muestra de células madre mesenquimales crioconservadas, restauradas y funcionales en un soporte de plástico;
ii. añadir una disolución enzimática e incubar en condiciones adecuadas para el medio usado;
iii. inactivar la disolución enzimática añadiendo un volumen igual de medio;
iv. centrifugar y descartar el sobrenadante.
En un ejemplo preferido, el medio adecuado para el lavado de las células en la etapa (i) es medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM).
En un ejemplo preferido, cuando el medio adecuado es DMEM, la etapa (ii) comprende la adición de una disolución enzimática y la incubación durante de 5 a 10 minutos a 35-39°C bajo del 7,5% al 10% de CO2.
Por ejemplo, preferiblemente, a disolución enzimática usada en la etapa (ii) es una disolución que contiene tripsina al 0,05% y ácido etilendiaminotetraacético al 0,02%. Preferiblemente, la disolución enzimática usada en la etapa (ii) comprende tripsina al 0,05% y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) tetrasódico al 0,02% en solución salina equilibrada de Hanks.
En cualquier caso, el experto reconocerá cuáles son los posibles medios diferentes y las condiciones adecuadas, así como las modificaciones posibles para llevar a cabo el aislamiento de células madre mesenquimales de la etapa (c6).
Por ejemplo, preferiblemente, el centrifugado de la etapa (iv) se lleva a cabo a 300-500 g a de 15 a 25°C y durante de 10 a 30 minutos, más preferiblemente a 400g, 20°C durante 10 minutos.
En un ejemplo preferido, la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas y restauradas aisladas en la etapa (c6) tiene una viabilidad >80%.
En un ejemplo preferido, la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas y restauradas aisladas en la etapa (c6) tiene una viabilidad >90%.
En una realización preferida, dicho medio adecuado para el transporte y el almacenamiento a 2-8°C es un medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox) de 0,25 mM a 1 mM.
El ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, o trolox, es un análogo de la vitamina E.
En una realización más preferida, dicho medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM es un medio libre de proteínas, libre de suero, libre de componentes animales, que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM.
En un ejemplo preferido, dicho medio isotónico, que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM, es un medio que comprende Na+100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, cloruro 17 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, HCO3- 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, dextrano con un peso molecular medio de 40000 al 6%, adenosina 2 mM, glutatión 3 mM, glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM.
En otra realización preferida, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:9 a 9:1 (v/v) de una primera composición que comprende Na+130 mM, K+ 4 mM, Ca2+ 1,35 mM, cloruro 109 mM y lactato 16 mM, y una segunda composición que comprende Na+ 159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, cloruro 77 mM, fosfato de dihidrógeno 28 mM, citrato 10 mM y acetato 32 mM, complementado con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM.
En otro ejemplo preferido, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:9, o 1:4, o 1:3 o 1:1, o 3:1 o 4:1 o 9:1 (v/v) de dicha primera composición y dicha segunda composición, complementada con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM.
En un ejemplo más preferido, dicho medio isotónico comprende una mezcla 1:1 (v/v) de dicha primera composición y dicha segunda composición, complementada con glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,5 mM.
En un ejemplo aún más preferido, dicho medio isotónico comprende glucosa 5 mM, albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 0,5 mM.
En un ejemplo aún más preferido, dicho medio isotónico comprende albúmina sérica humana al 0,5% y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM.
Un medio isotónico comercial adecuado es Hyportermosol®-Base complementado con ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico 1 mM, y albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5%.
La disolución Hyporthermosol®-Base contiene Na+100 mM, K+ 42,5 mM, Ca2+ 0,05 mM, Mg2+ 5 mM, Cl- 17,1 mM, fosfato de dihidrógeno 10 mM, bicarbonato 5 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazinaetanosulfónico (HEPES) 25 mM, lactobionato 100 mM, sacarosa 20 mM, manitol 20 mM, glucosa 5 mM, adenosina 2 mM y glutamina 3 mM.
Por ejemplo, preferiblemente, la composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, aptas para administración en terapia, obtenida según el método de la invención, se transporta en un envase isotérmico que garantiza una temperatura constante de entre 2 y 8°C durante al menos >72 horas, en todas las épocas del año y condiciones climáticas. Un ejemplo de acondicionamiento usado con el método de la invención es el sistema de acondicionamiento ORCA®.
La composición que comprende células madre mesenquimales funcionales permanece estable incluso después de sufrir hasta 10 duplicaciones.
Una realización se refiere a una composición de células madre mesenquimales, obtenible según el método de la invención.
Otra realización se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenible según el método de la invención, para uso como medicamento. También se describe aquí el uso de una composición que comprende una población de células madre mesenquimales funcionales apta para administración en terapia, obtenida según el método de la invención, para uso en la fabricación de un medicamento
Además, aquí se describe una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenible según el método de la invención, para uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales.
También se describe aquí una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenible según el método de la invención, para uso en el tratamiento de enfermedades susceptibles a terapia con células madre mesenquimales, en la que dicha composición que comprende una población de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte se administra localmente o en tratamientos sistémicos.
Otra realización se refiere a una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenible según el método de la invención, para uso en el tratamiento de enfermedades osteoarticulares, reparación ósea;
enfermedades autoinmunitarias y enfermedades cardiovasculares.
En una realización, las enfermedades osteoarticulares se seleccionan de entre discopatía degenerativa, osteoartritis, lesiones de menisco y artritis reumatoide.
En una realización, las enfermedades autoinmunitarias se seleccionan de entre lupus eritematoso, enfermedad de injerto contra huésped y esclerosis sistémica.
En una realización, las enfermedades cardiovasculares se seleccionan de entre insuficiencia vascular periférica, infarto de miocardio, apoplejía e isquemia. En un ejemplo aquí descrito, la enfermedad es un trastorno isquémico del nervio óptico.
Para los fines de la presente descripción, el término “tratamiento autólogo” o “terapia autóloga”, se refiere a un tratamiento en el que las células madre mesenquimales de médula ósea usadas en la etapa (a) del método de la invención son células madre mesenquimales de médula ósea de la misma persona a la que se destina la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales para uso, o a la que se destina la composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales para uso, según la invención.
Para los fines de la presente descripción, el término “tratamiento alógeno o alogénico” o “terapia alógena” se refiere a un tratamiento en el que las células madre mesenquimales de médula ósea usadas en la etapa (a) del método de la invención son células madre mesenquimales de médula ósea de una persona diferente a la persona a la que se destina la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales para uso, o a la que se destina la composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales para uso, según la invención.
Las composiciones que comprenden células madre mesenquimales funcionales, obtenibles según el método de la invención, descrito en el presente documento, se usan, por tanto, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento autólogo o alógeno de enfermedades susceptibles de tratarse con células madre mesenquimales, mediante tratamientos o bien locales o bien sistémicos, en particular enfermedades osteoarticulares, osteoartritis, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades cardiovasculares.
Un ejemplo se refiere a una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenible según el método de la invención, para uso en como medicamento para ser administrado a una concentración de 5x106 a 10x106 células/ml.
Una realización de la invención se refiere a una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenible según el método de la invención, para uso en como medicamento para ser administrado a una densidad celular de 1*106 a 10x106 células/ml y una dosis de 0,5 a 90 millones de células, dependiendo de la indicación.
Una realización de la invención se refiere a una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, obtenible según el método de la invención, descrito anteriormente en este documento, para uso en el tratamiento autólogo de enfermedades osteoarticulares, reparación ósea; enfermedades autoinmunitarias y enfermedades cardiovasculares.
También se describe aquí un método de tratamiento de enfermedades osteoarticulares, de reparación ósea; de enfermedades autoinmunitarias y de enfermedades cardiovasculares que comprende la administración de una cantidad terapéutica de una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, a un sujeto que lo necesita, en el que dicha composición que comprende dicha población enriquecida, puede obtenerse según el método descrito en la presente divulgación.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: efectos de la composición 2 según la invención y de la composición de referencia 1 y de una composición que comprende una solución de lactato de Ringer complementada con glucosa y albúmina sérica humana, sobre la viabilidad celular durante 3 días de almacenamiento en condiciones de hipotermia. (2-8°C). Los datos son la media ± EEM de 5 donantes diferentes
Figura 2: efectos de la composición 2 y de la composición 3, según la invención, y de la composición 1 de referencia y de una composición que comprende una solución de lactato de Ringer complementada con glucosa y albúmina sérica humana, sobre la viabilidad celular durante 3 días de almacenamiento en condiciones de hipotermia. (2-8°C). Los datos son la media ± EEM de 5 donantes diferentes
Figura 3: viabilidad celular en función del tiempo alcanzado por (1) las composiciones que comprenden MSC crioconservadas en FBS+DMSO al 10%, restauradas a 35-39°C con un medio que comprende el 10% de CO2 y acondicionadas para el transporte para obtener la composición 3, según la invención (barras rellenas); (2) con una composición que comprende MSC en Hypothermosol® con trolox crioconservadas y descongeladas y mantenidas a temperatura ambiente (20-25°C) durante los tiempos indicados, según el documento WO2010/064054 (barras con líneas diagonales); y (3) con una composición que comprende MSC en Ringer-lactato y DMSO al 10% crioconservadas y descongeladas (barras blancas). Los valores son medias /- DE 3 donantes. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Figura 4: efecto del DMSO en el crecimiento de las células madre mesenquimales. Se sembraron células madre mesenquimales recién obtenidas a 1000 células por cm2 con DMSO al 0%, al 0,1%, al 0,3%, al 1% y al 5% y se cultivaron a 37°C durante los tiempos indicados. Los valores son la media ± DE 3 donantes.
Figura 5: curva de crecimiento de la composición 3 que comprende células madre mesenquimales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenidas según el método de la invención después de 72 horas de transporte hipotérmico (2-8°C). Media±DE de valores triplicados. Representativo de 3 experimentos similares con diferentes donantes.
Ejemplos
La invención se ilustra en los ejemplos, así como en las figuras y esquemas genéricos. Los sustituyentes y los números enteros usados en los siguientes esquemas son los definidos en las realizaciones de la presente invención, a menos que se indique lo contrario. Esta sección se expone para ayudar a la comprensión de la invención, pero no debe interpretarse como una limitación de la invención tal como se establece en las reivindicaciones.
Las composiciones que comprenden una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales obtenidas según el método de la invención y usadas en los ejemplos, se han procesado siguiendo las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) en la Unidad de Producción Celular del Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM) de Valladolid, siguiendo los procedimientos normalizados de trabajo aprobados por la Agencia Española del Medicamento, AEMPS (n.° PEI.10-134 y n.° PEI 15-007).
Ejemplo 1: obtención de una población de células madre mesenquimales funcionales según el método de la invención
El aspirado de médula ósea sometido a un procedimiento anticoagulante protocolizado es la fuente celular para la obtención de las MSC usadas para obtener las composiciones del ejemplo. El aspirado de médula ósea se procesó en el plazo de 24 horas después de su extracción.
El procedimiento de obtención de MSC dura aproximadamente de 21 a 28 días.
En la primera etapa se seleccionó la fracción de células mononucleares (MNC) con gradiente de densidad con Ficoll. Posteriormente, se llevó a cabo un estudio de viabilidad celular mediante la técnica de exclusión de azul tripano: las células mononucleares (MNC) deben tener una viabilidad >70% para comenzar con el cultivo. Las MNC se sembraron en frascos de cultivo que contenían DMEM FBS al 20% (si se esperan problemas de contaminación bacteriana, se añade gentamicina al 0,5%), y se incubaron a 37°C bajo 10% de CO2. Cada 3 ó 4 días se observó con el microscopio invertido el aspecto de la monocapa celular y la confluencia (% de la superficie de cultivo ocupada por las células). Si la confluencia era inferior al 60-80% se realizó un cambio de medio; si la confluencia era superior al 80% el cultivo celular se sometió a disociación y expansión celular (pase) y se realizaron subcultivos para aumentar el número y purificar la línea celular de MSC.
Las células obtenidas en el primer pase se lavaron, se cuantificaron y se suspendieron en medio de crioconservación. La concentración de células se fijó en 5-10x106 MSC por 1 ml de medio de crioconservación compuesto por FBS al 90% DMSO al 10% (crioconservante).
El procedimiento de crioconservación se realizó gradualmente, manteniendo las células a -80 ±8°C durante 24-72 horas. Después de este periodo de tiempo, las células se almacenaron en nitrógeno líquido, a -196°C nominalmente, hasta su uso.
La restauración, incluyendo la reexpansión, de la muestra se programó según la fecha establecida para el tratamiento, que puede ser hasta de 6 a 20 años después.
Durante la restauración, los crioprotectores se retiraron rápidamente, en 15-20 min, teniendo en cuenta que la muestra debe atemperarse debidamente hasta su temperatura de cultivo (37°C).
Por último, las células se resuspendieron en medio de cultivo completo para realizar estudios de recuento y viabilidad celular, excluyendo los lotes de células con una viabilidad inferior al 70%.
Una vez conocido el número de células viables restauradas, se tomó una muestra de 5x105 células para el análisis citogenético tal como se observa en este ejemplo. La disolución restante se sembró a una concentración de entre 1000- 5000 células por cm2.
Este cultivo se mantuvo a 37°C con 10% de CO2. El medio se cambió cada 4 días hasta que las células ocuparon el 80-100% de la superficie de cultivo. En este momento se llevó a cabo una disociación con tripsina-EDTA. La restauración, incluyendo el tiempo de reexpansión, dura 10-15 días desde que se realiza la descongelación.
La viabilidad celular fue superior al 80% y no cambió en aproximadamente 12 horas.
Ejemplo 2: composiciones que comprenden una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenidas según el método de la invención.
Se investigaron los efectos de varias composiciones sobre la viabilidad celular a lo largo de 3 días de almacenamiento en condiciones de hipotermia (2-8°C) para las características funcionales de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales crioconservadas y restauradas obtenidas en el ejemplo 1. Se usaron tres medios diferentes para acondicionar las MSC para el transporte, solución de Ringer-lactato, solución aditiva de plaquetas SSP+ e Hypothermosol®-FRS, cuyas composiciones se muestran en la tabla 1.
Se investigaron las siguientes acciones funcionales combinando las tres disoluciones:
1. Se aumentó la concentración de K del medio para favorecer el bombeo de K+ a través de la Na/K ATPasa de la membrana hacia las células y la restauración de los gradientes de iones alcalinos, que se disipan debido a la inhibición de la Na/K ATPasa de la membrana plasmática por la disminución de la temperatura. Además, se aumentó el contenido de Mg2+ del medio para estabilizar la membrana plasmática.
2. Se aumentó la capacidad tampón (fosfato, citrato, bicarbonato y HEPES) para un mejor mantenimiento del pH. La presencia de lactato y acetato también contribuyó a disminuir la producción de protones durante el metabolismo.
3. La potencia nutritiva del medio se vio favorecida por la adición de sustratos metabólicos que actúan a través de diferentes rutas metabólicas, tales como glucosa, acetato y adenosina.
4. Se añadieron osmolitos impermeables a la membrana plasmática, tales como lactobionato, sacarosa, manitol o dextrano, para oponerse a la lisis celular osmótica coloidal.
5. Por último, se aumentó la capacidad antioxidante mediante la complementación del medio con glutatión y el análogo soluble de la vitamina E, ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (trolox).
Se investigó la actividad beneficiosa de cada uno de estos aditivos para demostrar si los efectos de la modificación eran positivos. Las diferentes disoluciones sometidas a prueba se muestran en la tabla 1:
TA BLA 1
Las figuras 1 y 2 muestran los efectos de varias composiciones sobre la viabilidad celular durante 3 días de almacenamiento en condiciones de hipotermia. (2-8°C).
La solución de transporte habitual, Ringer-lactato complementado con glucosa y albúmina sérica humana (mostrada en círculos en las figuras 1 y 2), estabilizó las MSC crioconservadas y restauradas durante 12 horas, pero no es adecuada para periodos más largos.
Una combinación de SSP+ (solución aditiva de plaquetas, Ringwald et al. 2006, Transfusión Med Rev, vol 20, n.° 2, 158-164) con Ringer-lactato complementado con glucosa y albúmina sérica humana (composición 1, mostrada con triángulos vacíos en las figuras 1 y 2) tampoco mejoró suficientemente la viabilidad celular durante 3 días de almacenamiento en condiciones de hipotermia. (2-8°C), sin embargo, cuando a esa disolución se le añade trolox para obtener la composición 2 (mostrada con rombos en las figuras 1 y 2), la estabilidad aumenta muy significativamente, tal como se muestra en las figuras 1 y 2, en las que dicha composición proporcionó más del 80% de viabilidad después de 72 horas.
La composición 3 con trolox también proporcionó un rendimiento similar al observado en la figura 2 (mostrado con triángulos rellenados).
La conservación parecía adecuada con las composiciones 2 y 3 incluso después de 7 días a 4°C.
Ejemplo 3: viabilidad y caracterización de una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1.
Se realizó un estudio de 7 lotes originados de siete donantes diferentes, de composiciones que comprenden una población enriquecida de MSC funcionales, se prepararon con el medio isotónico con trolox, composición 3, según el ejemplo 2, directamente después de obtener las células tal como se describe en el ejemplo 1, según el método de la presente invención, y se evaluaron un grupo de parámetros, con el fin de:
- demostrar que la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, según el método de la invención es adecuada para su aplicación en terapia
- demostrar que la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, conserva las características típicas de las MSC definidas por la Sociedad de Terapia Celular (ISCT) (Dominici et al., Cryotherapy, 2006, vol 8, n.° 4, 315-317); (Wuchter et al, Cryotherapy, 2015, 17:128-139), y
- demostrar la ausencia de aberraciones fenotípicas y genotípicas en la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1.
Los parámetros medidos fueron:
1. morfología celular medida por la capacidad de adhesión;
2. rendimiento celular medido como capacidad de expansión (crecimiento) de las células por
cm2;
3. viabilidad celular medida con azul tripano;
4. análisis del inmunofenotipo que analiza la expresión positiva de CD73, CD90, CD105 y CD166 y la expresión negativa de CD14, Cd34, CD45 y HLA-DR;
5. esterilidad de las composiciones obtenidas según el método de la invención; y
6. estudios citogenéticos para comprobar la existencia de anomalías estructurales y aberraciones genéticas.
Morfología: en los 7 casos evaluados, los cultivos celulares presentaron células adherentes de aspecto fibroblástico.
Rendimiento celular: el número de células por cm2 obtenido se muestra en la tabla 2 para la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenidas en el ejemplo 1, (MSC procesadas) en el ejemplo 1, y de MSC de control (MSC de control) que no han pasado por el método de la invención.
TABLA 2
Los números medios de células/cm2, 18391 frente a 17377 (última línea de la tabla 2) no difieren significativamente, lo que indica que el método de la invención no ha afectado al crecimiento de las células.
Viabilidad: la viabilidad celular obtenida, de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1 (MSC procesadas) y de las MSC de control (MSC de control) que no han pasado por el método de la invención, se muestra en la Tabla 3:
TABLA 3
La viabilidad se conservó en gran medida, y no había diferencias significativas entre los valores encontrados en los controles y las células obtenidas en el ejemplo 1 (98 frente a 95; véase la última línea de la tabla 3)
En todos los casos, la viabilidad celular debe ser >70%.
Análisis inmunofenotípico:
En 2006, el ISCT propuso tres criterios para definir las células mesenquimales: en primer lugar, estas células deben ser adherentes en cultivo; en segundo lugar, deben expresar los antígenos CD90 y CD105 en ausencia de antígenos hematopoyéticos tales como CD34 y CD45; y, en tercer lugar, las células mesenquimales deben poder diferenciarse "in vitro” en osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Además, dado que esta población no presenta un fenotipo característico, deben analizarse otras moléculas de adhesión tal como presencia de CD73, CD166 y la ausencia de CD14 y HLA-DR.
El control fenotípico de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales se realizó mediante un análisis de los antígenos de superficie por citometría de flujo, que permite verificar la presencia de marcadores específicos de células mesenquimales.
Se preparó una suspensión de 1 millón de células madre mesenquimales funcionales en 2 ml de PBS, que se distribuyó en 4 tubos (250.000 células/tubo en un volumen de 500 jl), y se marcó con el patrón de anticuerpos mostrado en la tabla 4 a continuación. Las dosis usadas fueron las recomendadas por el fabricante.
Tabla: patrón de combinación d ni r r l n li i i m rí
TABLA 4
Los tubos se incubaron en la oscuridad a 4°C durante 20 minutos. Después de este tiempo, se añadieron 2,5 ml de PBS para lavar y se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 rpm. Se retiró el sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en 500 j l de PBS antes de pasar la muestra a través del citómetro de flujo.
El análisis mostró que, tanto la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, como las MSC de control (MSC frescas) que no habían pasado por el método de la invención, expresaban CD73, CD90, CD105 y CD166 (>90%) y eran negativas (<10%) para CD14, CD34, CD45 y HLA-DR.
Por otro lado, se ha estudiado el porcentaje de expresión de los marcadores usados en el estudio inmunofenotípico (véase la tabla 5) en siete donantes.
TABLA 5
Esterilidad de las células obtenidas.
Los resultados obtenidos en la evaluación de la esterilidad de los productos son según los criterios de aceptación establecidos. No se observó crecimiento microbiológico (detectado por la producción de CO2 en un sistema automatizado-Bact/Alert y conforme a la Monografía 6.2.27 de la Farmacopea Europea) en ningún caso y no se detectó la presencia de micoplasma mediante el procedimiento basado en PCR/NAT conforme a la Monografía 6.2.7 de la Farmacopea Europea.
Estudios citogenéticos.
Además de todo lo anterior, se obtuvo y evaluó el cariotipo de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, para descartar posibles aberraciones cromosómicas del medicamento.
En el estudio citogenético realizado a la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales,
obtenida en el ejemplo 1, no se observaron anomalías estructurales verificadas por bandas G (con una resolución de 400 bandas).
En resumen, de los resultados obtenidos en este ejemplo se puede concluir que:
1. Tanto la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, (MSC procesadas) como las MSC de control (MSC de control) que no han pasado por el método de la invención, son células adherentes de aspecto fibroblástico.
2. El número de células obtenidas por cm2 en la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenidas en el ejemplo 1, es el mismo que en el control y suficiente para realizar los controles de calidad, así como para obtener las dosis de tratamiento adecuadas.
3. La viabilidad tanto de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, (MSC procesadas) como de las MSC de control (MSC de control), que no han pasado por el método de la invención, es la misma y superior al límite inferior fijado (>70%).
4. El fenotipo tanto de la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenidas en el ejemplo 1, (MSC procesadas) como de las MSC de control (MSC de control), que no han pasado por el método de la invención, cumplen los criterios establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT): expresión de CD105 y CD90, en ausencia de marcadores típicamente hematopoyéticos tales como CD34, CD45 y HLA-DR. Las células (tanto las de control como las procesadas) son también positivas para CD73, CD166 y no expresan CD14. Teniendo en cuenta los porcentajes de expresión obtenidos, y siguiendo los parámetros establecidos en el ISCT (Wuchter et al, 2015), establecimos el criterio de aceptación en la expresión >90% para los marcadores considerados positivos como CD73, CD90, CD105 y CD166, y la expresión ≤10% se considera negativa para marcadores como CD14, CD34, CD45 y HLA-DR.
5. En resumen, el método de la invención no modifica ni transforma las características de la población enriquecida de MSC funcionales obtenidas mediante dicho método, siendo por tanto bioequivalentes a las MSC que no han pasado por el método de la invención, las células recién obtenidas usadas anteriormente, que mostraron un importante valor terapéutico en varias indicaciones (Orozco, Transplantation, 2011, 92:822-828; Orozco, Transplantation, 2013, 95(12):1535-1541; Vega, Transplantation 2015, 99:1681-1690; Noriega, Transplantation 2017, 101:1945-1951). 6. La población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, no presenta aberraciones genotípicas tras el proceso de crioconservación.
7. La ausencia de aberraciones cromosómicas en la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida en el ejemplo 1, permite concluir que las MSC permanecen estables cuando se someten a hasta 10 duplicaciones.
Ejemplo 4: caracterización de una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida según el método de la invención después de un transporte de 72 horas.
Los objetivos de la prueba eran:
- Evaluar la esterilidad, la viabilidad y el inmunofenotipo de las composiciones que comprenden una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenidas según el método de la invención después de un procedimiento de transporte de 72 horas.
- Demostrar que las MSC de dichas composiciones mantienen la capacidad de reexpansión in vitro, es decir, la misma capacidad de crecimiento in vitro, después de llevar a cabo un procedimiento de transporte de 72 horas.
Como fuente celular de obtención de MSC procesadas según el método de la invención, se usó un aspirado de médula ósea de 3 donantes diferentes y se sometió al procedimiento anticoagulante protocolario. La muestra de aspirado se procesó en el plazo de 24 horas después de su extracción.
Las composiciones que comprenden una población enriquecida de MSC funcionales se obtuvieron según el método de la invención tal como se describe en el ejemplo 1. La población enriquecida de MSC funcionales obtenida se suspendió en la composición 3 según el ejemplo 3 del presente documento, y el proceso de acondicionamiento se llevó a cabo en una jeringa de 5 ml en dosis de 20±2 millones de células resuspendidas en 2 ml para uso en tratamientos de discopatía degenerativa (DDD). Para uso en osteoartritis, la dosis de células sería de 40 millones de células suspendidas en 8 ml.
La composición, que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, obtenida según el método de la invención, tiene un inmunofenotipo característico de células mesenquimales, con presencia de anticuerpos CD90, CD105, CD166 y CD73, y ausencia de marcadores CD14, CD34, CD45, HLA- DR.
La viabilidad celular debe ser superior al 90% para ser liberadas para uso médico, las composiciones obtenidas y, la viabilidad de las composiciones liberadas debe ser superior al 80% en el plazo de 72 horas de su emisión (fecha de caducidad del producto) después de realizar una simulación de envío, ya que este producto tiene una estabilidad de 72 horas a 2-8°C.
La dosis para la terapia fue de 20 ± 2 x 106 células en un volumen final de 2 ml. El recipiente que contenía la composición estaba identificado por una etiqueta que contenía los datos del producto fabricado.
La composición se transportó en un equipo ORCA que es un envase isotérmico validado que garantiza una temperatura constante de entre 2 y 8°C durante al menos 168 horas, en todas las épocas del año y condiciones climáticas. Además, el acondicionamiento no requiere el transporte en vehículos refrigerados. Asimismo, cada caja incorporaba un registrador de datos (termo-registrador) que proporcionaba un gráfico de la temperatura a la que se había mantenido el producto durante todo el tiempo de transporte.
El acondicionamiento ORCA ® que consiste en una caja de 4,4 l con unas dimensiones externas de 345 x 317 x 308 mm y un peso de 7,2 kg.
Para demostrar que las composiciones obtenidas en este ejemplo suspendidas con la composición 3, según la presente invención, permanecen estables después del procedimiento de transporte de 72 horas y mantienen la esterilidad, la viabilidad y las características fenotípicas de las MSC definidas por la Sociedad de Terapia Celular (ISCT) (Dominici et al., Cryotherapy, 2006, vol 9, n.° 4, 315-317), se realizó un estudio de 3 lotes para evaluar los siguientes parámetros:
-Temperatura de transporte
-Viabilidad celular
-Análisis inmunofenotípico
-Esterilidad
-Prueba de cinética de crecimiento para verificar que las células mantienen la capacidad de duplicación después del procedimiento de transporte.
El acondicionamiento isotérmico ORCA permitió mantener la temperatura de transporte durante 72 horas en un intervalo de 2 a 8°C.
Viabilidad celular
La viabilidad celular se evaluó a las 72 h del procedimiento de transporte, con el método de exclusión de azul tripano. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. La tabla 6 muestra la viabilidad inicial de los donantes analizados y la viabilidad media obtenida a las 72 horas ± desviación estándar.
TABLA 6
En todos los casos, la viabilidad celular a las 72 horas fue >80%, por lo que cumple los criterios establecidos en este estudio.
Análisis inmunofenotípico
El análisis de citometría de flujo mostró que a las 72 horas después de que se enviaran las composiciones, las células analizadas expresaban CD73, CD90, CD105 y CD166 y eran negativas para CD14, CD34, CD45 y HLA-DR en el patrón de expresión de todas las composiciones. La tabla 5 muestra el porcentaje de expresión de los marcadores analizados mediante citometría de flujo en el momento del envío de las composiciones y a las 72 horas después de que se enviara el producto. Todos los donantes muestran un fenotipo celular mesenquimal después del procedimiento de transporte.
TABLA 7
Prueba de cinética de crecimiento
Se realizaron pruebas de cinética de crecimiento registrando el número de células en diferentes intervalos de tiempo cuando se cultivan después del procedimiento de transporte. Estos resultados muestran que en los tres donantes analizados, la población enriquecida de MSC funcionales mantiene la capacidad de duplicación tras un procedimiento de transporte de 72 horas.
Esterilidad
La esterilidad de las composiciones se evaluó después de la simulación del transporte. Después de 72 horas de obtención de la composición con la población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales, se iniciaron 3 procesos de expansión celular. Estas expansiones se mantuvieron durante un periodo de 11 días con medios de cultivo sin antibióticos. Ninguno de los tres cultivos muestra signos de contaminación microbiológica, todos presentan una cinética de crecimiento adecuada y, por tanto, mantienen la esterilidad.
A partir de los resultados obtenidos en este estudio, se puede concluir que:
1. La viabilidad de las células mesenquimales en las composiciones obtenidas con el método de la invención después de un procedimiento de transporte de 72 horas fue >80%.
2. En el estudio de la cinética de crecimiento, se observa que las células mesenquimales comprendidas en las composiciones, mantenidas en medio de cultivo sin antibiótico, conservan la esterilidad después del transporte.
3. El fenotipo de las células mesenquimales comprendidas en las composiciones tras un procedimiento de transporte de 72 horas cumple con los criterios establecidos por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT): expresión de CD105 y CD90, en ausencia de marcadores típicamente hematopoyéticos tales como CD34, CD45 y HLA-DR. También son positivas para CD73, CD166 y no expresan CD14. Con porcentajes de expresión >90% para los marcadores positivos y ≤10% para los negativos.
4. Las células mesenquimales comprendidas en las composiciones mantienen la capacidad de reexpansión "in vitro” después de llevar a cabo un procedimiento de transporte hipotérmico de 72 horas, ya que pueden dividirse.
Ejemplo 5: reproducibilidad del método
El presente ejemplo pretende verificar la reproducibilidad del procedimiento, evaluar si dicho procedimiento proporciona un producto estandarizado adecuado para uso en terapia como medicamento, y confirmar que el producto obtenido cumple con un conjunto de especificaciones del producto final.
Los aspirados de médula ósea fueron la fuente celular para la obtención de las composiciones de la invención usadas en el ensayo, procesadas según los requisitos de donación establecidos por la Directiva 2006/17/CE y el RD 1301/2006 de España.
Los aspirados de médula ósea se procesaron en el plazo de 24 horas después de la extracción.
El rendimiento y la viabilidad celular mononucleares en las muestras se muestran en la tabla 8:
TABLA 8
El aislamiento de muestras de células madre mesenquimales, que van a ser usadas en el método de la invención, dura aproximadamente de 21 a 28 días, tal como se detalló anteriormente. En dichas muestras se seleccionó una fracción de células mononucleares (MNC) por el método de gradiente de densidad con Ficoll. Al final de este procedimiento, se realizó el recuento y los controles de viabilidad mediante el método de exclusión de azul tripano con cámara de Neubauer. En este punto, se seleccionaron las células mononucleares con una viabilidad superior al 70% para iniciar el procedimiento de obtención de células mesenquimales.
Después del procedimiento de selección, las MNC se sembraron a una densidad de 175.000 células/cm2 y se mantuvieron en cultivo a 37°C y el 10% de CO2. Cada 3 ó 4 días, se observó el aspecto de la célula con un microscopio invertido, y se registró el porcentaje de crecimiento. Si era inferior al 60-80% se realizó un cambio de medio, y si era superior al 80% se llevó a cabo disociación y expansión celular (pase), realizando subcultivos con el fin de aumentar y purificar las MSC sobre otras células que no se dividen presentes en la muestra.
Se realizó un estudio inmunofenotípico por citometría de flujo y se observó que las células mesenquimales de la muestra expresaban CD73, CD90, CD105 y CD166 en un porcentaje >90% y eran negativas para los marcadores CD14, CD34, CD45 y HLA-DR, ya que su expresión era ≤ 10%.
La tabla 9 muestra el porcentaje de expresión de los marcadores analizados mediante citometría de flujo en el momento de la obtención de la reserva celular de los dos donantes analizados:
TABLA 9
Las células obtenidas durante esta primera etapa se crioconservaron para obtener la muestra de células madre mesenquimales de la etapa (a) del método de la invención.
En este punto, se realizó una digestión enzimática con tripsina-EDTA permitiendo así obtener una suspensión celular que se crioconserva en FBS que contiene DMSO al 10% o con kits comerciales (CryoStor ® CS5) y se almacena en nitrógeno líquido a -196°C durante 24 días.
El procedimiento de restauración y revitalización dura aproximadamente de 7 a 10 días, permitiendo obtener las composiciones que contienen MSC según la invención.
El procedimiento de restauración comienza con la descongelación de un criovial incubado 1-2 minutos a 37°C o usando dispositivos automatizados tal como un instrumento de descongelación ThawSTAR® CFT2, y las células se sembraron a una densidad de 2.000 células/cm2.
Los controles realizados después de la descongelación de las muestras mostraron resultados satisfactorios, tal como se observa en la tabla 10, en cuanto a viabilidad y recuento celular y, por tanto, se inició el procedimiento de restauración celular para obtener las composiciones de la invención.
TABLA 10
El cultivo se mantuvo a 37±2°C y 10% de CO2. Cada 3-4 días se realizó un cambio de medio. Durante este procedimiento, el cultivo se monitorizó con el microscopio invertido y se comprobó que las células mesenquimales conservan su morfología fibroblástica después del procedimiento de crioconservación y descongelación.
Cuando el cultivo alcanzó el 80% de confluencia, las células madre mesenquimales se recuperaron por disociación enzimática con tripsina-EDTA.
La población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales recuperadas se resuspendió en la composición 3 del ejemplo 2, y el procedimiento de acondicionamiento se llevó a cabo en una jeringa de 5 ml en dosis de 20 ± 2 millones de células resuspendidas en 2 ml.
La población enriquecida de células mesenquimales funcionales se analizó mediante estudios citogenéticos para comprobar si presentaban alteraciones a nivel de cariotipo después del procedimiento de crioconservación y
descongelación. Los resultados obtenidos de este análisis no muestran aberraciones cromosómicas. Los resultados de los controles realizados se muestran en la tabla 11:
TABLA 11
El estudio inmunofenotípico realizado mediante citometría de flujo sobre la sustancia activa muestra que la población enriquecida de células mesenquimales funcionales de las composiciones obtenidas expresaba CD73, CD90, CD105 y CD166 en un porcentaje >90% y eran negativas para CD14, CD34, CD45 y HLA-DR, ya que su expresión era ≤10%. La tabla 12 muestra el porcentaje de expresión de los marcadores analizados mediante citometría de flujo en el momento de la obtención de la sustancia activa de los dos donantes analizados:
TA BLA 12
Además, en el estudio de potencia realizado se observó que las células se diferencian en tejido condrogénico. Se mantuvieron en cultivo durante 30 días con medio acondicionado y se llevó a cabo el estudio histológico mediante tinción con azul alcián que permite observar los polisacáridos ácidos que se encuentran en las células diferenciadas hacia cartílago. Los resultados de los controles realizados al producto final se muestran en la tabla 13.
TABLA 13
Las composiciones obtenidas, que contienen una población enriquecida de células madre mesenquimales funcionales obtenidas según el método de la invención, contenían 20 millones ± 2 millones de células resuspendidas en la composición 3 según el ejemplo 2.
En este caso, se eligió el envase de 10 millones en 1 ml, ya que es la densidad establecida para el tratamiento de la regeneración de disco. Dichas composiciones se envasaron en una jeringa de 5 ml que contenía 2 ml de suspensión celular, con una estabilidad de 72 horas a 2-8°C.
El recipiente que transportaba las composiciones de la invención se identificó con una etiqueta que incluía los datos del producto. Este recipiente se introdujo en una bolsa estéril y salió de la zona estéril hacia el área de acondicionamiento, donde se realiza el acondicionamiento secundario en una caja con la identificación correspondiente.
Las composiciones se transportaron en un envase isotérmico validado que aseguraba una temperatura mantenida entre 2 y 8°C durante un máximo de 168 horas, conteniendo, además, un registrador de datos que proporciona un gráfico de la temperatura del producto durante todo el procedimiento de transporte.
Además, durante todo el procedimiento de fabricación, se garantiza la fabricación aséptica de las composiciones. Ejemplo 6: evaluación de la viabilidad celular
Comparar el perfil de viabilidad celular de las células madre mesenquimales incluidas en las composiciones obtenidas según el método de la invención, con los métodos actuales de crioconservación.
Para ello, una primera muestra de células madre mesenquimales se crioconservó con DMSO al 10% y FBS, se restauró a 35-39°C con DMEM con 10% de CO2, y se acondicionó para el transporte para obtener la composición 3 según el método de la invención.
Una segunda muestra de células madre mesenquimales se congeló en Hypothermosol® FRS (¡que no contenía DMSO!) y se descongeló a temperatura ambiente (21-25°C).
Una tercera muestra de células madre mesenquimales se congeló en medio salino con DMSO al 10% y se descongeló a temperatura ambiente (21-25°C).
Los valores son medias /- DE de 3 donantes. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Tal como se observa en la figura 3, las células madre mesenquimales incluidas en las composiciones obtenidas según el método de la invención proporcionaron una viabilidad superior al 80% incluso después de 72 horas de almacenamiento (barras negras). Por otro lado, las células madre mesenquimales crioconservadas en Hypothermosol ® FRS, sin DMSO y descongeladas a temperatura ambiente (barras con líneas diagonales), proporcionaron una viabilidad inferior al 50% después de sólo 24 horas de almacenamiento. Los resultados de viabilidad de células crioconservadas con DMSO en solución salina y descongeladas directamente sin restauración, según la etapa de la invención, fueron aún más bajos. Sólo las composiciones obtenidas según la invención mostraron una estabilidad y viabilidad adecuadas para uso terapéutico pospuesto.
Ejemplo de referencia 7: evaluación del perfil de crecimiento celular de células madre mesenquimales recién obtenidas en presencia de DMSO
Se analizó el perfil de crecimiento celular de las células madre mesenquimales en presencia de DMSO para evaluar el efecto del DMSO en los métodos actuales de crioconservación, que usan las células directamente después de la descongelación y pueden estar contaminadas con DMSO.
Para este fin, se hizo crecer una muestra de MSC recién preparadas en DMEM con FBS, 10% de CO2 y diferentes concentraciones de DMSO, tal como se muestra.
La figura 4 muestra que el DMSO interfiere significativamente con el crecimiento a concentraciones tan bajas como el 0,3%, lo que sugiere que incluso una pequeña contaminación con DMSO, tal como la producida durante el uso en las etapas de congelación-descongelación, puede obstaculizar el crecimiento.
Ejemplo 8: evaluación del perfil de crecimiento celular
También se evaluó el crecimiento celular de una composición que comprendía células madre mesenquimales funcionales crioconservadas, restauradas y acondicionadas para el transporte, obtenidas según el método de la invención después de la descongelación, restauración y transporte de 72 horas a 4°C (CRT).
Para este fin, se crioconservó una muestra de células madre mesenquimales con DMSO y FBS al 10%, se restauró a 35-39°C con DMEM con 10% de CO2 durante 7 días, se acondicionó para el transporte para obtener la composición 3 según el método de la invención y se incubó en hipotermia (2-8°C) durante 72 horas y posteriormente se cultivó como en la figura 4.
La figura 5 muestra cómo el perfil de crecimiento de las células madre mesenquimales incluidas en las composiciones obtenidas en el método de la invención es similar al de las células cultivadas sin DMSO (figura 4). Esto significa que el procedimiento de restauración descrito en este documento elimina cualquiera de las posibles interacciones y toxicidad encontradas en el uso de DMSO durante la crioconservación, a la vez que proporciona un perfil de viabilidad celular significativamente mejorado incluso después de 72 h de almacenamiento hipotérmico tras la restauración y acondicionamiento en la disolución de transporte, según el método de la invención.
La estabilidad, la viabilidad y el perfil de crecimiento celular de las composiciones obtenidas según el método de la invención permiten su almacenamiento y su uso pospuesto en terapia y resuelven los problemas de toxicidad del DMSO cuando son administradas. El método de la invención también permite obtener células madre mesenquimales con un fenotipo, crecimiento celular y perfil de viabilidad adecuados, en número suficiente para dosis terapéuticas, resolviendo los problemas descritos en la técnica previa. Los resultados óptimos requieren no sólo las composiciones adecuadas en cada una de las etapas descritas, procedimientos de Crioconservación, Reconstitución y Acondicionamiento para el transporte, sino la adecuada secuencia y duración de cada etapa elemental.
Claims (13)
1. Método para obtener una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales adecuada para administración en terapia, comprendiendo dicho método las etapas de:
a. suspender una muestra ex vivo de células madre mesenquimales de médula ósea en un medio crioprotector que comprende dimetilsulfóxido a del 5% al 10% a una concentración de 5x106 a 10x106 células/ml;
b. crioconservar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea, enfriándolas en primer lugar de desde -70°C hasta -90°C durante al menos 24 horas antes de almacenar la muestra en nitrógeno líquido;
c. restaurar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea, realizando las siguientes etapas:
c1. descongelar la muestra de las células madre mesenquimales de médula ósea aumentando progresivamente la temperatura hasta 35-39°C durante de 1 a 5 minutos;
c2. diluir la muestra de 10 a 30 veces el volumen de muestra inicial con un medio de cultivo adecuado; c3. centrifugar la muestra, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células madre mesenquimales en un medio de cultivo adecuado;
c4. seleccionar las células madre mesenquimales con una viabilidad de al menos el 70%; c5. sembrar las células madre mesenquimales seleccionadas en la etapa (c4) sobre un soporte de plástico e incubar dichas células madre mesenquimales con un medio de cultivo adecuado que comprende del 7,5% al 10% de CO2 y suero bovino fetal al menos al 5% a una concentración celular de entre 1000 y 5000 células/cm2, con condiciones de cultivo adecuadas a 35-39°C, c6. reemplazar con medio de cultivo recién preparado adecuado que comprende del 7,5% al 10% de CO2 y suero bovino fetal al menos al 5%, a intervalos regulares de tiempo y aislar las células madre mesenquimales del soporte cuando las células ocupen del 80 al 100% de la superficie del soporte; c7. seleccionar las células madre mesenquimales que:
- muestran adherencia al plástico; y
- presentan una viabilidad de al menos el 70%; y
- presentan una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105; y
- presentan una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%; y - no presentan aberraciones cromosómicas; y
- presentan capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
d. suspender las células madre mesenquimales aisladas en la etapa (c7) en un medio adecuado para el transporte y almacenamiento a 2-8°C para obtener una composición que comprende células madre mesenquimales funcionales, en el que dicho medio adecuado para el transporte y almacenamiento a 2-8°C es un medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM.
2. Método según la reivindicación 1, en el que el medio crioprotector de la etapa (a) comprende suero bovino fetal y DMSO a del 5 al 10%.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el medio crioprotector de la etapa (a) es un medio libre de proteínas, libre de suero y libre de componentes animales, que comprende DMSO al 5% o al 10%.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa (b) comprende crioconservar la muestra de células madre mesenquimales de médula ósea a una velocidad de 1°C/min de desde -70°C hasta -90°C durante al menos 25 horas antes de almacenar la muestra en nitrógeno líquido.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM, es un medio libre de proteínas, libre de suero, libre de componentes animales.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio isotónico que comprende ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 mM a 1 mM comprende una mezcla 1:9 a 9:1 (v/v) de una primera composición que comprende Na+130 mM, K+ 4 mM, Ca2+1,35 mM, cloruro 109 mM y lactato 16 mM, y una segunda composición que comprende Na+ 159 mM, K+ 5 mM, Mg2+ 0,8 mM, cloruro 77 mM, fosfato de dihidrógeno 28 mM, citrato 10 mM y acetato 32 mM, complementada con glucosa 5 mM, y albúmina sérica humana a del 0,1% al 0,5%.
7. Composición que comprende una población de al menos 0,5x106 células madre mesenquimales y ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico de 0,25 a 1 mM, obtenible según el método de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas células madre mesenquimales retienen durante al menos 72 horas durante transporte hipotérmico a 2-8 oC, la funcionalidad de células madre mesenquimales frescas, incluyendo:
- mostrar adherencia al plástico;
- presentar una viabilidad de al menos el 70%;
- presentar una expresión >90% de CD90, CD 166, CD73 y CD105;
- presentar una expresión ≤10% de CD14, CD34, CD45 y HLA-DR ≤10%;
- no presentar aberraciones cromosómicas; y
- presentar capacidad para diferenciarse en osteoblastos, adipocitos y condrocitos.
8. Composición según la reivindicación 7, para uso como medicamento.
9. Composición según la reivindicación 7, para uso en el tratamiento autólogo o alógeno de enfermedades osteoarticulares, enfermedades autoinmunitarias y enfermedades cardiovasculares.
10. Composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en donde dicha composición es administrada a una densidad celular de 1*106 a 10x106 células/ml y de 0,5 a 90 millones de células.
11. Composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que las enfermedades osteoarticulares se seleccionan de entre el grupo que consiste en discopatía degenerativa, osteoartritis, lesiones de menisco y artritis reumatoide.
12. Composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que las enfermedades autoinmunitarias se seleccionan de entre el grupo que consiste en lupus eritematoso, enfermedad de injerto contra huésped y esclerosis sistémica.
13. Composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en la que las enfermedades cardiovasculares se seleccionan de entre el grupo que consiste en insuficiencia vascular periférica, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular e isquemia.
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