CN112770628B

CN112770628B - 获得功能性间充质干细胞富集群体的方法、所获得的细胞以及包含其的组合物

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Publication number: CN112770628B
Application number: CN201980060870.9A
Authority: CN
Inventors: 安娜·桑切斯加西亚; 弗朗西斯科·哈维尔·加西亚-桑乔马丁; 维罗妮卡·加西亚迪亚兹; 梅塞德斯·阿尔贝卡萨瓦略斯; 桑德拉·古姆斯古铁雷斯
Original assignee: University Valladolid; Stosbine Ltd
Current assignee: University Valladolid; Stosbine Ltd
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2039-09-18
Also published as: US20210321606A1; IL281105B; CA3112505A1; CO2021003290A2; BR112021005257B1; JP2022501322A; IL281105A; ES2948810T3; KR102506822B1; AU2019341538B2; WO2020058324A1; BR112021005257A2; CL2021000656A1; PT3852525T; EP3852525A1; CA3112505C; AU2019341538A1; US20230247981A1; EP3852525B1; MX2021002932A

Abstract

一种获得包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物的方法，用于低温运输和在治疗中局部施用所述功能性间充质干细胞的富集群体。最后还描述了通过所述方法获得的所述功能性间充质干细胞的富集群体和包含其的组合物在通过局部或全身治疗来自体或同种异体治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病中的用途，特别是在骨关节疾病，如退行性椎间盘疾病、骨关节炎和骨修复的治疗中；在红斑狼疮、移植物抗宿主病和其他自身免疫性疾病的治疗中；以及在周围血管功能不全和其他心血管疾病的治疗中的用途。

Description

获得功能性间充质干细胞富集群体的方法、所获得的细胞以及包含其的组合物

技术领域

本发明提供了一种获得组合物的方法，该组合物包括从骨髓间充质干细胞的离体样品中获得的冷藏、恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于低温运输和在治疗中局部施用包含冷藏、恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体的所述组合物。最后，本发明涉及包含通过所述方法获得的冷藏、恢复和运输调节的功能性间充质干细胞富集群体的所述组合物在通过局部或全身治疗来自体或同种异体治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病中的用途，尤其是在骨关节炎疾病，例如退行性椎间盘疾病，骨关节炎和骨修复的治疗中；在红斑狼疮、移植物抗宿主病和其他自身免疫性疾病的治疗中；在周围血管功能不全和其他心血管疾病的治疗中。

发明背景

具有临床影响的晚期骨关节炎治疗的金标准是假体置换。这在年轻患者中尤其成问题，因为关节假体的持续时间有限，而且是昂贵的操作，这一问题证明了探索新的可能更有效的治疗方法的合理性。

骨髓中有一群非造血干细胞，称为基质祖细胞或间充质干细胞(MSC)。这些细胞的特征在于其多能性，即它们分化为其他细胞类型的能力。MSC具有成纤维细胞梭形形态群体，其表达CD73、CD90和CD105抗原，并显示缺乏造血抗原，单核细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的标志物。另外，当保持在适当的调节环境中时，它们保留了向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的体外分化能力。

根据其公认的再生和抗炎潜力，骨髓间充质干细胞(MSC)的关节内输注，例如在骨关节炎中的关节内输注，是这些新的研究领域之一。

在动物模型中对MSC的研究已证明，所述MSC在人体关节环境(如椎间盘、膝盖等)中输注后能够存活，并能够以剂量依赖性方式修复软骨。

因此，MSC具有再生受损或破坏的组织(例如骨骼、软骨和其他组织)的能力。此外，它们对T淋巴细胞的作用证明了它们调节免疫反应和控制炎症的能力。

MSC可以从不同的器官和组织获得，但是骨髓代表了其最佳和最容易获得的来源之一。

但是，骨髓中MSC的频率很低，仅占骨髓单核细胞的0.001％至0.01％。对于单次全身治疗，通常每公斤体重使用1.0×10⁶至2.0×10⁶个MSC，而在局部治疗中，局部给药的单剂量可高达20-40×10⁶个细胞，因此，该事实使得不可能从骨髓中原位直接收集如此大量的细胞。

冷藏可使骨髓间充质干细胞的一些等分试样仅以一剂施用，从而避免了对患者的连续干预并降低了部分制造成本。另外，它使我们最终可以进行不同剂量的治疗，从而提高了治疗的功效。

此外，与使用自体MSC相比，冷藏对于进行MSC的同种异体施用，降低成本并提供更有效的方式以治疗患者至关重要，而自体MSC需要从待治疗的同一患者新鲜制备，从而使治疗效率更低、更昂贵且后勤上更为复杂。

然而，冷藏不是一个直接的过程，通常会导致严重的细胞损伤，以及隐藏的损伤，这种损伤不会在细胞解冻时显现出来，而只是在后期才显现出来。这在其分化能力、其再生受损组织的能力以及进行所述再生的速度方面都损害了MSC的功能。此外，如果在施用MSC时冷冻保存剂(例如二甲基亚砜(DMSO))保持悬浮状态，则已经报告了不良反应，例如恶心、心动过速、心动过缓、低血压等。另一方面，以低至0.5％的浓度添加到细胞培养物中的DMSO会降低MSC的体外增殖速率。

另一方面，同种异体途径为患有自身免疫性疾病的患者提供了治疗的可能性，这些患者自身的细胞可能携带要治疗的疾病，因此没有治愈作用。此外，MSC的免疫原性远低于其他细胞类型，并且通常不会引发排斥反应，甚至针对供体的抗HLA抗原的产生通常也很低或无法检测到(J García-Sancho等人,Transplantation direct 3(9):e205)。

目前，有几项描述解冻后直接并且无预先处理，在血流中的冷藏的间充质细胞注射的工作。然而，总是优选将MSC局部接种在骨关节炎治疗的关节腔中，或接种在退行性椎间盘疾病中的椎间盘中，因为当采用同种异体治疗时，所有细胞都能够到达要治疗的部位，并且几乎不容易受到宿主免疫系统的攻击。另一方面，局部治疗要求事先去除冷冻保护剂，否则，冷冻保护剂(通常为二甲基亚砜(DMSO))会干扰MSC的增殖。即使去除了DMSO，也无法通过活力或代谢测定法检测到具有隐藏损伤的细胞，并且正如所解释的，一旦给药所述隐藏损伤就损害了它们的活力以及在其分化能力、其再生受损组织的能力以及进行所述再生的速度方面的功能。

例如，Marquez-Curtis等人(Cryobiology 71(2015)181-197)提供了有关用于冷藏和解冻间充质干细胞的不同条件/过程如何导致所获得的细胞产物的不同细胞活力和生长能力的综述。特别地，该综述提出了多种解决方案，以改善冷藏后获得的细胞产物的性质。一方面，Marquez-Curtis等人描述了调节使用二甲基亚砜(DMSO)的冷藏条件(冷冻速率、储存温度、冷冻保护剂的百分比)的不同方案，以改善解冻后的细胞产物质量并限制DMSO的毒性。另一方面，作者还提出了其他冷冻保护剂，例如：甘油；糖，例如海藻糖，棉子糖，乳糖，蔗糖等；抗氧化剂；凋亡抑制剂或其混合物；以及以下过程：玻璃化；在磁场中冷冻；等，以试图保持解冻后获得的细胞产物的质量，同时避免毒性问题，特别是来自使用DMSO的毒性问题。在综述冷藏的状态时，该文章指出，已知解冻后在活细胞的恢复中发生了重大损失，作者仅提出了多种可能的解决方案，其中包括培养解冻后的细胞(没有指明培养条件)，在冷藏之前培养细胞，使用化学调节剂(如白藜芦醇或salubrinal)以减少细胞凋亡，在这些建议中未提供任何具体指导。

Wei等人(Veterinary surgery,2018；47:19-29)还认识到DMSO的毒性问题，并承认去除DMSO的实际复杂性，指出使用所述冷冻保护剂会导致细胞损失并减少菌落形成单位的数量。从这个意义上讲，该文章指出了不同于DMSO的其他冷冻保护剂的开发，作为开发具有合适的表型、分化和活力概况(viability profile)的干细胞产品的向导，这些干细胞产品可在解冻后直接使用，避免了DMSO的毒性问题。

同样地，Yuan等人(Cryotherapy,2016:18:860-869)同意由于其毒性问题而需要替代DMSO，并提出

4.5(一种蛋白质补充剂)作为冷冻保护剂来替代DMSO并获得细胞产物，该细胞产物在解冻后直接具有合适的表型、分化和活力概况。

国际专利申请公开WO 2010/064054 A1也遵循相同的发展路线，其描述了常用冷冻保护剂DMSO的毒性。作为替代，该出版物提出了一种含有

和抗氧化剂6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(trolox)的组合物，以储存包括间充质干细胞在内的干细胞，并冷藏它们，无需DMSO作为冷冻保护剂。再次，文献WO 2010/064054 A1提出在解冻后直接使用细胞。

国际专利申请公开WO 2017/068140 A1描述了基于脂肪来源的细胞的干细胞疗法。该公开提出了一种方法，其中将从脂肪抽吸物(lipoaspirate)的基质血管部分获得的干细胞在生物反应器中培养，然后冷冻和解冻至少两次，并在解冻后直接施用。

因此，发现现有技术建议代替DMSO以避免所遇到的活力和毒性问题，以及解冻后直接使用细胞产品，以此作为开发细胞产物(包括冷藏后用于治疗的间充质干细胞产物)的一般指导。

另一方面，Alves等人(Tissue Engineering；part A,vol.19,numbers 7 and 8,2013)分析了MSC在离体培养过程中遭受的氧化应激的影响以及分化潜能的逐渐丧失和降低的临床疗效。为此，作者提出使用trolox作为抗氧化剂来防止所述氧化损伤。然而，作者得出的结论是，尽管补充trolox可以减低早期培养期间的氧化损伤，但抗氧化剂显示出的有益作用仍无法挽救体外扩增后的人MSC分化能力。

为此，很明显，开发有效且标准化的基于MSC的疗法的主要关键问题是确保对所述细胞的操作(如冷藏或扩增)不会损伤细胞，以致损害其活性，例如施用后增殖和分化的能力。

此外，必须以能够在运输过程中直至施用时保持其功能性和活力的组合物的形式配制MSC，其功能性和活力通常会在数小时内丧失。

本发明提供了一种获得冷藏的，恢复的和运输调节的功能性MSC的富集群体的方法，其被配制成被开发用于低温运输和局部施用的组合物，其解决了上述问题。

发明概述

本发明涉及一种用于获得组合物的方法，所述组合物包括适于在治疗中施用的冷藏、恢复和运输调节的功能性间充质干细胞富集群体，所述方法包括以下步骤：

a.将骨髓间充质干细胞的离体样品以5×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮在含有5％至10％二甲基亚砜的冷冻保护培养基中；

b.冷藏骨髓间充质干细胞样品，先将其冷却至-70℃至-90℃至少24小时，然后再将样品存储在液氮中；

c.通过执行以下步骤来恢复骨髓间充质干细胞样品：

c1.在1至5分钟内将温度逐步升高至高达35-39℃，以解冻骨髓间充质干细胞样品；

c2.用合适的培养基将样品稀释至初始样品体积的10至30倍；

c3.离心样品，丢弃上清液并将间充质干细胞沉淀重悬于合适的培养基中；

c4.选择活力至少为70％的间充质干细胞；

c5.将步骤(c4)中选择的间充质干细胞接种到塑料支持体上，并在35-39℃的适当培养条件下，以1000-5000个细胞/cm²的细胞浓度，用包含7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的合适培养基温育所述间充质干细胞，

c6.以固定时间间隔更换含有7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的新鲜的合适培养基，并在细胞占据支持体表面的80％至100％时从支持体分离冷藏和恢复的功能性间充质干细胞；

d.将在步骤(c6)中分离的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体悬浮于用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基中，以获得包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体的组合物，其中所述用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基是等渗培养基，其包含0.25至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。

本发明进一步涉及一种组合物，其包含通过本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体。

此外，本发明还涉及一种组合物，其包含通过本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，其用作药物。

发明内容

本发明涉及一种用于获得组合物的方法，所述组合物包含体外的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞(MSC)的富集群体，所述方法包括以下步骤：

a.将骨髓间充质干细胞的离体样品以5×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的细胞浓度悬浮在含有5％至10％二甲基亚砜的冷冻保护培养基中；

b.通过降温来冷藏骨髓间充质干细胞样品，先将其冷却至-70℃至-90℃至少24小时，然后再将样品存储在液氮中；

c.恢复骨髓间充质干细胞样品，执行以下步骤：

c1.在1至5分钟内将温度逐步升高至35-39℃，以解冻骨髓间充质干细胞样品；

c2.用合适的培养基将样品稀释至样品体积的10至30倍；

c3.离心样品，丢弃上清液并将间充质干细胞重悬于合适的培养基中；

c4.选择活力至少为70％的间充质干细胞；

c5.将步骤(c4)中选择的间充质干细胞接种到塑料支持体上，并在35-39℃的适当培养条件下，以1000-5000个细胞/cm²的浓度，用包含7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的合适培养基温育所述间充质干细胞，

c6.以固定时间间隔更换含有7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的新鲜的合适培养基，并在细胞占据支持体表面的80％至100％时从支持体分离冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体；

合适的培养基包含至少5％的胎牛血清，7.5％至10％的CO₂和所需量的^-HCO₃。从这个意义上说，在合适的培养基中CO₂和^-HCO₃的比例保持恒定，包括7.5％至10％的CO₂浓度和至少5％的胎牛血清。

优选地，所述方法进一步包括另外的步骤(c7)：选择冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，所述细胞：

-显示对塑料的附着；和

-表现出至少为70％的活力；和

-表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；和

-表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％的HLA-DR表达；和

-不具有染色体畸变特征；和

-表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。

出于本发明的目的，术语“等渗培养基”是指通过与细胞具有相同的有效摩尔渗透压浓度或不可渗透的溶质浓度来保持细胞体积的溶液，即具有与细胞内部相同的渗透压。因此，当细胞悬浮在所述溶液中时，等渗溶液允许水跨膜自由交换，并保持悬浮在其中的细胞的体积。

6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸或trolox是维生素E类似物。

在一个更优选的实施方案中，所述用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基是包含0.25mM至1mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基，是包含0.25mM至1mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二甲酸的无动物成分无血清无蛋白培养基。

在一个更优选的实施方案中，包含0.25mM至1mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基是包含以下成分的培养基：Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，氯化物17mM，磷酸二氢盐10mM，HCO₃ 5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露醇20mM，平均分子量为40000的葡聚糖6％，腺苷2mM，谷胱甘肽3mM，葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸1mM。

在另一个优选的实施方案中，所述等渗培养基包含第一组合物和第二组合物的1∶9至9∶1混合物(v/v)，所述第一组合物包含Na⁺130mM，K⁺4mM，Ca²⁺1.35mM，氯化物109mM和乳酸盐16mM，所述第二种组合物包含Na⁺159mM，K⁺5mM，Mg²⁺0.8mM，氯化物77mM，磷酸二氢盐28mM，柠檬酸盐10mM和乙酸盐32mM，所述等渗培养基补充有葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.1％至0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸0.25至1mM。

在一个更优选的实施方案中，所述等渗培养基包含所述第一组合物和所述第二组合物的1：9或1：4或1：3或1：1或3：1或4：1或9：1混合物(v/v)，并补充有葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.1％至0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸0.25至1mM。

在一个更优选的实施方案中，所述等渗培养基包含所述第一组合物和所述第二组合物的1：1混合物(v/v)，补充有葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸0.5mM。

在另一个更优选的实施方案中，所述等渗培养基包含葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸0.5mM。

在另一个更优选的实施方案中，所述等渗培养基包含人血清白蛋白0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸1mM。

本发明还涉及一种组合物，其包含根据本文上述体外获得间充质干细胞(MSC)功能群体的方法可获得的，适用于治疗中施用的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体。

本发明的一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本文上述方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，其用作药物，特别是用于治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病。

另一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本文上述方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞的富集群体，用于治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病，其中包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞群体的所述组合物可局部施用或在全身治疗中施用。

另一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本文上述方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于治疗骨关节疾病，骨修复；自身免疫性疾病和心血管疾病。

在一个实施方案中，骨关节疾病选自退行性椎间盘疾病、骨关节炎、半月板损伤和类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，自身免疫疾病选自红斑狼疮、移植物抗宿主病和系统性硬化病。

在一个实施方案中，心血管疾病选自周围血管功能不全、心肌梗死、卒中和缺血。

所述包含冷藏，恢复和运输调节的功能性MSC的富集群体的组合物能够在解冻后以及在至少72小时的2至8℃的低温运输过程中，保留新鲜MSC的功能。

出于本发明的目的，骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的非造血干细胞，其特征在于它们的中胚层多能性，并且因此能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。

根据本发明，术语“功能性间充质干细胞的群体”是指间充质干细胞样品，其包含一定量的间充质干细胞，所述间充质干细胞适用于治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病，其中，所述样品仅包含具有新鲜间充质干细胞功能特性的间充质干细胞，即显示对塑料的附着；表现出至少为70％的活力；表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％HLA-DR的表达；不具有染色体畸变特征；和表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。

出于本发明的目的，“功能性间充质干细胞的富集群体”是指一组至少0.5×10⁶个功能性间充质干细胞，其显示对塑料的附着；表现出至少为70％的活力；表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％HLA-DR的表达；不具有染色体畸变特征；和表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。

出于本发明的目的，术语“冷藏的细胞”是保持在-70℃或更低的温度下的细胞，由于低温保存，其具有基本上任何可能导致细胞损害基本上停止的代谢或化学活性。

出于本发明的目的，术语“冷藏和恢复的细胞”或“冷藏和恢复的间充质干细胞样品”和等同术语，是指先前已经根据本发明的方法在合适的培养物中冷藏，解冻，稀释，分离和培养的间充质干细胞，所述培养基包含至少5％的胎牛血清，在35-39℃下高水平的CO₂，其中所述冷藏和恢复的细胞以新鲜间充质干细胞的基本上所有代谢和化学活性为特征，并且具有至少70％的活力，更优选至少80％的活力，甚至更优选至少90％的活力。

出于本发明的目的，术语“冷藏，恢复和运输调节的细胞”或“冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞”和等同术语，是指先前已经在合适的培养基(包含至少5％胎牛血清，在35-39℃下高水平的CO₂)中冷藏并恢复，并且在分离后在包含适当等渗培养基的悬浮液中针对运输调节的间充质干细胞，所述等渗培养基用于在2-8℃下运输和储存，包含trolox0.25mM至1mM。从这个意义上说，出于本发明的目的，术语“调节的”等同于“针对运输调节的”或“运输调节的”或“用于在2-8℃下运输和储存而调节的”。

术语“包括”被解释为意味着它包括一组特征，但是它不排除其他特征的存在，只要它们不会使权利要求不可行。为此，出于本发明的目的，术语“包括”可以由术语“由……组成”和术语“基本上由……组成”代替。以这种方式，当术语“包括”指一组特征A、B和C时，应解释为最终包括不同于A、B和C的其他特征，只要它们不会使权利要求不可行，但也可以解释为仅包括所述特征A、B和C，或仅基本上包括所述特征，因此，“包括”应解释为还包括由特征A、B和C组成的组以及基本上由特征A、B和C组成的组。

用于本发明方法的间充质干细胞源自离体骨髓单核细胞。所述离体骨髓单核细胞包括几种类型的离体骨髓干细胞，包括离体造血干细胞、离体间充质干细胞、离体内皮祖细胞和其他前体干细胞。创伤后，细胞生长因子可能能够促进骨髓MSC的组织分化，因此使受损器官的修复和器官功能的恢复成为可能。

MSC以对培养物中塑料的强力附着为特征。该附着能力用于从骨髓单核细胞中分离和纯化所述MSC。

优选地，在10至15天内进行用于获得组合物的方法，所述组合物包含适于在治疗中施用的，冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体。

在一个优选的实施方案中，骨髓间充质干细胞的离体样品包含至少8×10⁶个骨髓间充质干细胞。

在一个优选的实施方案中，骨髓间充质干细胞的离体样品包含8×10⁶至10×10⁶个骨髓间充质干细胞。

优选地，离体样品包含具有至少90％活力的骨髓间充质干细胞。

优选地，离体样品包含8×10⁶至10×10⁶个间充质干细胞，其活力至少为90％，CD90、CD 166、CD73和CD105的表达≥90％，且CD14、CD34、CD45和HLA-DR的表达≤10％。

在一个优选的实施方案中，将离体骨髓间充质干细胞样品提供在塑料支持体中，使用酶法将其与塑料支持体分离，并重悬于合适的培养基中。

优选的塑料支持体是亲水性塑料支持体或带负电荷的塑料支持体。在一个优选的实施方案中，所述优选的塑料支持体包含亲水基团。在一个优选的实施方案中，所述优选的塑料支持体是具有亲水特性的经组织处理的塑料支持体。所述优选的塑料支持体的商业实例是Corning

支持体。

在一个优选的实施方案中，在步骤(a)之前进行以下步骤：

i.在塑料支持体中用合适的培养基洗涤离体骨髓间充质干细胞样品；

ii.加入酶溶液并在所用培养基合适的条件下温育；

iii.通过添加等体积的培养基使酶溶液失活；

iv.离心并丢弃上清液。

在一个优选的实施方案中，在步骤(i)中用于洗涤细胞的合适培养基是Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)。

在另一个优选的实施方案中，步骤(i)在选自以下的培养基中进行：Iscove的改良的Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(IMDM)，Eagle的最低必需培养基的低血清培养基(Reduced Serum Media of Eagle’s Minimum Essential Media)，Eagle的最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)，具有核苷、葡萄糖等的改良的Eagle的最低必需培养基(modified Eagle’s Minimum Essential Medium withnucleosides,glucose,etc.)、或任何其他合适的培养基。

在一个优选的实施方案中，当合适的培养基是DMEM时，步骤(ii)包括添加酶溶液，并在35-37℃，10％CO₂下，更优选在37℃下温育5至10分钟。

在任何情况下，技术人员将认识到哪些是可能的培养基和条件，以及可能进行步骤(i)的培养的改进。

优选地，步骤(ii)中使用的酶溶液包含Hanks平衡盐溶液中的0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸四钠(EDTA)。

步骤(ii)中使用的酶溶液的商业实例是胰蛋白酶-EDTA 1X溶液(Sigma 9417C)。

优选地，步骤(iv)包括将样品在15至25℃下以300至500g离心5至10分钟，更优选在20℃下以400g离心5分钟。

在一个优选的实施方案中，步骤(a)包括提供8×10⁶至10×10⁶个间充质干细胞样品，其活力至少为90％，CD90、CD 166、CD73和CD105的表达≥90％，并且CD14、CD34、CD45和HLA-DR的表达≤10％。

优选地，步骤(a)中使用的骨髓间充质干细胞的离体样品是通过包括以下步骤的方法获得的：

I.提供至少30ml过滤的骨髓抽吸物的离体样品；

II.对离体骨髓抽吸物进行抗凝剂处理；

III.从离体骨髓抽吸物中选择单核细胞；

IV.选择活力高于70％的单核细胞；

V.将单核细胞以1.5×10⁶至2×10⁶个细胞/cm²的密度接种在塑料支持体中的适当培养基中，并在适当的培养条件下进行温育；

VI.以规则时间间隔测量附着在塑料支持体上的间充质干细胞的细胞生长百分比和外观，以及

VI.1当细胞生长百分比低于60％时更换培养基，除去上清液；或者

VI.2如果细胞生长百分比高于80％，则分离附着在塑料支持体上的间充质干细胞样品；

VI.3进行多达2代的传代培养，以增加和纯化所述间充质干细胞，并且如果生长百分比高于80％，则从每个传代培养物中分离附着到塑料支持体上的间充质干细胞。

优选地，在8至10天内进行从骨髓抽吸物离体样品获得步骤(a)的骨髓间充质干细胞离体样品的方法。

在一个实施方案中，步骤(II)中使用的抗凝剂是肝素。

在一个实施方案中，步骤(III)包括通过密度梯度从离体骨抽吸物中选择单核细胞。

优选地，步骤(III)包括使用包含ficoll的溶液通过密度梯度从离体骨抽吸物中体外选择单核细胞，包括：

III.1将ficoll溶液缓慢加入离体骨髓抽吸物样品中；

III.2在没有制动的情况下在300至500g，15至25℃下离心至少30分钟；

III.3用合适的介质分离和洗涤界面；

III.4离心并丢弃上清液；

III.5用合适的介质洗涤沉淀；

III.6离心并丢弃上清液；

III.7将沉淀与单核细胞重悬于合适的培养基中；

在一个优选的实施方案中，步骤I包括以比例2∶3(体积：体积)将Ficoll溶液缓慢加入离体骨髓抽吸物样品中。

在一个优选的实施方案中，用含有0.5人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行洗涤。

在另一个优选的实施方案中，在步骤III.3中用生理盐水溶液进行洗涤。

在另一个优选的实施方案中，用林格溶液进行洗涤。

优选地，步骤III.4包括将样品在15至25℃下以300至500g离心5至10分钟，更优选在20℃下以400g离心5分钟。

优选地，步骤III.6包括将样品在15至25℃下以300至500g离心5至10分钟，更优选在20℃下以400g离心5分钟。

在一个优选的实施方案中，步骤(IV)中选择的单核细胞具有高于70％，更优选高于80％，最优选高于90％的活力。

优选地，单核细胞活力使用染料排斥试验来确定。所述染料排斥试验基于以下原理：活细胞具有完整的细胞膜，该细胞膜排斥某些染料，例如锥虫蓝，而死细胞则不排斥。在该试验中，将细胞悬浮液简单地与染料混合，然后目视检查以确定细胞是否吸收或排斥染料。因此，排斥染料的细胞是活细胞。

在一个优选的实施方案中，步骤V在选自以下的培养基中进行：Iscove的改良的Dulbecco培养基(IMDM)，Eagle的最低必需培养基的低血清培养基，Eagle的最低必需培养基，具有核苷、葡萄糖等的改良的Eagle的最低必需培养基、或任何其他合适的培养基。

在一个优选的实施方案中，进行步骤V，以1.5×10⁶至2×10⁶个细胞/cm²的密度将单核细胞接种在塑料支持体中的含有至少5％胎牛血清(FBS)的DMEM中，并在35-39℃在7.5％至10％的CO₂下温育。培养基优选包含至少5％的胎牛血清，7.5％至10％的CO₂和所需量的^-HCO₃。

在另一个优选的实施方案中，进行步骤V，以1.5×10⁶至2×10⁶个细胞/cm²的密度将单核细胞接种在塑料支持体中的含有至少5％FBS和0.5％庆大霉素的DMEM中，并在35-39℃在7.5-10％的CO₂下温育。

支持体。

在任何情况下，技术人员将认识到哪些是可能的培养基和条件，以及可能进行步骤(V)的培养的改进。

优选地，在步骤VI中，如果细胞生长百分比小于60-80％，则更换培养基。

优选地，在步骤VI中，如果其大于80％，则通过进行多达2代的传代培养使细胞培养物进行细胞解离和扩增，以增加和纯化MSC的细胞系。

在一个优选的实施方案中，步骤(VI.3)包括如果细胞生长百分比高于80％，则从每种传代培养物中分离附着到塑料支持体上的间充质干细胞；其中分离包括：

i.在塑料支持体中用合适的培养基洗涤骨髓间充质干细胞样品；

ii.加入酶溶液并在所用培养基适当条件下温育；

iii.通过添加等体积的培养基使酶溶液失活；

iv.离心并丢弃上清液。

在一个优选的实施方案中，当合适的培养基是DMEM时，步骤(ii)包括添加酶溶液，并在35至39℃，10％CO₂下温育5至10分钟。

优选地，步骤(ii)中使用的酶溶液是含有0.05％胰蛋白酶和0.02％和0.05％乙二胺四乙酸钠的溶液。优选地，步骤(ii)中使用的酶溶液在包含Hanks平衡盐溶液中的0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸四钠(EDTA)。

优选地，步骤(iv)的离心在15至25℃下以300-500g进行30分钟。

在任何情况下，技术人员将认识到哪些是可能的不同培养基和条件，以及可能进行步骤(VII)的间充质干细胞分离的改进。

在一个优选的实施方案中，用于步骤(a)的以上获得的间充质干细胞的离体样品具有至少90％的活力，CD90、CD 166、CD73和CD105的表达≥90％，并且CD14、CD34、CD45和HLA-DR的表达≤10％。

在一个优选的实施方案中，离体骨髓抽吸物样品包含超过3000个白细胞/μl。

在优选的实施方案中，离体骨髓抽吸物样品是离体髂嵴骨髓抽吸物样品。

在一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含含有胎牛血清和5至10％DMSO的培养基。

在另一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含5％的DMSO和95％的胎牛血清。

在另一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含10％的DMSO和90％的胎牛血清。

在另一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含含有5％DMSO的无动物成分无血清无蛋白培养基。

在另一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含含有10％DMSO的无动物成分的无血清无蛋白质的培养基。

在一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含5至10％的DMSO和95至90％的等渗组合物，所述等渗组合物包含Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，氯化物17mM，磷酸二氢盐10mM，HCO₃ ^-5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露醇20mM，平均分子量为40000的葡聚糖6％，腺苷2mM，谷胱甘肽3mM，葡萄糖5mM。

在一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含5％的DMSO和95至90％的等渗组合物，所述等渗组合物包含Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，氯化物17mM，磷酸二氢盐10mM，HCO₃ ^-5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露醇20mM，平均分子量为40000的葡聚糖6％，腺苷2mM，谷胱甘肽3mM，葡萄糖5mM。

在一个优选的实施方案中，步骤(a)的冷冻保护培养基包含10％的DMSO和95至90％的等渗组合物，所述等渗组合物包含Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，氯化物17mM，磷酸二氢盐10mM，HCO₃ ^-5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露醇20mM，平均分子量为40000的葡聚糖6％，腺苷2mM，谷胱甘肽3mM，葡萄糖5mM。

在一个优选的实施方案中，步骤(b)包括以1℃/min的速度将骨髓间充质干细胞样品冷藏至-70℃至-90℃至少25小时，然后将其保存在液氮中。

优选地，恢复冷藏的间充质干细胞的步骤(c)根据确定的治疗日期开始，该日期可以长达6至20年。

优选地，步骤(c1)在15至20分钟内快速进行。

优选地，步骤(c1)包括通过在1至5分钟内将温度逐渐升高至35-39℃来解冻冷藏的间充质干细胞，同时保持受控的升温速度。步骤(c1)中解冻冷藏的间充质干细胞的合适设备是

CFT2。

在一个优选的实施方案中，步骤(c2)的合适培养基是含有至少5％胎牛血清和7.5％至10％CO₂的Dulbecco的改良Eagle培养基。培养基优选包含至少5％的胎牛血清，7.5％至10％的CO₂和所需量的^-HCO₃。

在另一个优选的实施方案中，步骤(c2)的合适培养基选自Iscove的改良的Dulbecco培养基(IMDM)，Eagle的最低必需培养基的低血清培养基，Eagle的最低必需培养基，具有核苷、葡萄糖等的改良的Eagle的最低必需培养基，或包括7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的任何其他适当培养基。

在任何情况下，技术人员都会认识到哪种是可能的包含至少5％的FBS和高水平的CO₂和^-HCO₃的培养基，35-39℃的条件以及可能进行步骤(c2)的培养的改进。

优选地，步骤(c3)包括将样品离心，丢弃上清液并将间充质干细胞以1×10⁶至5×10⁶个细胞/ml的浓度重悬于合适的培养基中。优选地，所述合适的培养基包含7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清。

优选地，步骤(c3)包括将样品在15至25℃下以300至500g离心5至10分钟，更优选在20℃下以400g离心5分钟。

优选地，在步骤(c4)中，使用染料排斥试验确定间充质干细胞的细胞活力。

优选地，在步骤(c4)中，使用锥虫蓝测定间充质干细胞的细胞活力。

所述染料排斥试验基于以下原理：活细胞具有完整的细胞膜，该细胞膜可排斥某些染料，例如锥虫蓝，伊红或丙锭，而死细胞则不排斥。在该试验中，将细胞悬浮液简单地与染料混合，然后目视检查以确定细胞是否吸收或排斥染料。因此，排斥染料的细胞是活细胞。

优选地，步骤(c6)包括以规则的时间间隔更换新鲜的适当培养基，所述适当培养基含有高水平的CO₂，优选至少5％的胎牛血清和7.5％至10％的CO₂，并在细胞占据支持体表面的80％至100％时从支持体分离冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体。

在一个优选的实施方案中，步骤(c5)和(c6)的合适培养基是Dulbecco的改良的Eagle培养基，其含有7.5％至10％的CO₂，所需量的^-HCO₃和至少5％的胎牛血清。

在另一个优选的实施方案中，步骤(c5)和(c6)的合适的培养基选自Iscove的改良的Dulbecco培养基(IMDM)，Eagle的最低必需培养基的低血清培养基，Eagle的最低必需培养基，或具有7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的任何其他适当培养基。

优选地，将步骤(c5)和(c6)的培养物在包含至少5％胎牛血清的合适培养基中在7.5％至10％的CO₂下保持在35-39℃。培养基另外包含所需量的^-HCO₃。

优选地，将步骤(c5)的培养物保持在对于所选培养基而言适当的培养条件下。

在任何情况下，技术人员将认识到哪些是可能的培养基和35-39℃的条件，以及可能进行步骤(c5)和(c6)的培养的的改进，所述改进包括高水平的CO₂和至少5％胎牛血清。

优选地，在步骤(c5)中，每3至4天更换培养基，直到细胞占据生长表面的80-100％，从而获得10000至40000细胞/cm²的产量。优选地，步骤(c5)在10至15天内进行。

在一个优选的实施方案中，步骤(c6)包括当细胞占据支持体表面的80％至100％时，从支持体分离冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体，其中分离包括：

i.在塑料支持体中用合适的培养基洗涤冷藏的恢复的和功能性间充质干细胞样品；

ii.加入酶溶液并在所用培养基适当条件下温育；

iii.通过添加等体积的培养基使酶溶液失活；

iv.离心并丢弃上清液。

在一个优选的实施方案中，在步骤(i)中用于洗涤细胞的合适培养基是Dulbecco的改良的Eagle培养基(DMEM)。

在一个优选的实施方案中，当合适的培养基是DMEM时，步骤(ii)包括添加酶溶液，并在35至39℃在7.5％至10％的CO₂下温育5至10分钟。

优选地，步骤(ii)中使用的酶溶液是含有0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸的溶液。优选地，步骤(ii)中使用的酶溶液包含Hanks平衡盐溶液中的0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸四钠(EDTA)。

在任何情况下，技术人员将认识到哪些是可能的不同培养基和合适的条件，以及可能进行步骤(c6)的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体的分离的改进。

优选地，步骤(iv)的离心在15至25℃下以300至500g进行10至30分钟，更优选在20℃下以400g进行10分钟。

在一个优选的实施方案中，在步骤(c6)中分离的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体具有≥80％的活力。

在一个优选的实施方案中，在步骤(c6)中分离的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体具有≥90％的活力。

在一个优选的实施方案中，所述用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基是等渗培养基，其包含0.25mM至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(trolox)。

在一个更优选的实施方案中，包含0.25mM至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基是包含0.25mM至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的无动物成分无血清无蛋白培养基。

在一个更优选的实施方案中，包含0.25mM至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基是包含以下成分的培养基：Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，氯化物17mM，磷酸二氢盐10mM，HCO₃ ^-5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露糖醇20mM，平均分子量为40000的葡聚糖6％，腺苷2mM，谷胱甘肽3mM，葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.5％，6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸1mM。

在另一个优选的实施方案中，所述等渗培养基包含第一组合物和第二组合物的1：9至9：1混合物(v/v)，所述第一组合物包含Na⁺130mM，K⁺4mM，Ca²⁺1.35mM，氯化物109mM和乳酸盐16mM，所述第二种组合物包含Na⁺159mM，K⁺5mM，Mg²⁺0.8mM，氯化物77mM，磷酸二氢盐28mM，柠檬酸盐10mM和乙酸盐32mM，所述等渗培养基补充有葡萄糖5mM，人血清白蛋白0.1％至0.5％和6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸0.25至1mM。

适当的商品化等渗培养基是

补充有1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸和0.1％至0.5％的人血清白蛋白。

溶液包含Na⁺100mM，K⁺42.5mM，Ca²⁺0.05mM，Mg²⁺5mM，Cl^-17.1mM，磷酸二氢盐10mM，碳酸氢盐5mM，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)25mM，乳糖酸盐100mM，蔗糖20mM，甘露醇20mM，葡萄糖5mM，腺苷2mM和谷胱甘肽3mM。

优选地，所述方法进一步包括另外的步骤(c7)，选择冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，所述功能性间充质干细胞：

-显示对塑料的附着；和

-表现出至少为70％的活力；和

-表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；和

-表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％HLA-DR的表达；和

-不具有染色体畸变特征；和

-表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。

优选地，将根据本发明的方法获得的，适于在治疗中施用的，包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体的组合物在等温包装中运输，以在一年中的所有时间和气候条件下确保2-8℃的恒定温度至少要>72小时。与本发明的方法一起使用的包装的实例是

包装系统。

包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体的组合物即使经过多达十次复制也保持稳定。

一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体。

另一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，其用作药物。另一个实施方案涉及根据本发明的方法可获得的，包含根据本发明的方法获得的，适于在治疗中施用的，包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞群体的组合物的用途，所述组合物用于制备药物。

另外，本发明涉及一种组合物，其包含根据本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病。

另一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病，其中包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的所述组合物可局部施用或在全身治疗中施用。

另一个实施方案涉及一种组合物，其包含根据本发明的方法可获得的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于治疗骨关节疾病，骨修复；自身免疫性疾病和心血管疾病。

在一个实施方案中，骨关节疾病选自退行性椎间盘疾病，骨关节炎，半月板损伤和类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，心血管疾病选自周围血管功能不全、心肌梗死、卒中和缺血。在一个优选的实施方案中，该疾病是视神经缺血性病症。

出于本发明的目的，术语“自体治疗”或“自体疗法”是指一种治疗，其中在本发明方法的步骤(a)中使用的骨髓间充质干细胞是来自于与根据本发明使用功能性间充质干细胞的富集群体或使用包含功能性间充质干细胞的富集群体的组合物的人相同的人的骨髓间充质干细胞。

出于本发明的目的，术语“同种异体或同种异体治疗”或“同种异体疗法”是指一种治疗，其中在本发明方法的步骤(a)中使用的骨髓间充质干细胞是来自于与根据本发明使用功能性间充质干细胞的富集群体或使用包含功能性间充质干细胞的富集群体的组合物的人不同的人的骨髓间充质干细胞。

因此，根据本文上文所述，根据本发明的方法可获得的，包含冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞的组合物，用于制备用于通过局部或全身治疗来治疗对间充质干细胞疗法敏感的疾病的自体或同种异体治疗的药物，所述疾病特别是骨关节疾病、骨关节炎、自身免疫性疾病和心血管疾病。

本发明的一个实施方案涉及一种根据本发明的方法可获得的组合物，其包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用作以5×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的浓度施用的药物。

本发明的一个实施方案涉及一种根据本发明的方法可获得的组合物，其包含冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，根据适应症，用作以5×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的细胞密度和50万到9000万个细胞的剂量施用的药物。

本发明的一个实施方案涉及一种根据本发明的方法可获得的组合物，其包含本文上文所述的冷藏，恢复和运输调节的功能性间充质干细胞的富集群体，用于自体治疗骨关节疾病，骨修复；自身免疫性疾病和心血管疾病。

另一个实施方案涉及治疗骨关节疾病，骨修复；自身免疫性疾病和心血管疾病的方法，包括将治疗量的组合物施用给需要其的受试者，所述组合物包含冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞的富集群体，其中所述包含所述富集群体的组合物可根据本公开中描述的方法获得。

附图简述

图1：在低温条件下(2-8℃)储存3天期间，根据本发明的组合物2和参考组合物1以及包含林格乳酸盐溶液且补充有葡萄糖和人血清白蛋白的组合物对细胞活力的影响。数据为5个不同供体的平均值±sem

图2：在低温条件下(2-8℃)储存3天期间，根据本发明的组合物2和组合物3以及参考组合物1和包含林格氏乳酸盐溶液且补充有葡萄糖和人血清白蛋白的组合物对细胞活力的影响。数据为5个不同供体的平均值±sem

图3：由以下获得的细胞存活率与时间的关系：(1)根据本发明，包含冷藏在FBS+10％DMSO中的MSC的组合物，在35-39℃下用包含10％CO₂的培养基恢复，并运输调节以获得组合物3(实心条形)；(2)根据WO2010/064054，包含含有trolox的

中的MSC的组合物，该组合物被冷藏并解冻并在室温(20-25℃)下保持指示的时间(具有斜线的条形)；(3)包含林格乳酸盐液中的MSC和10％DMSO的组合物，该组合物被冷藏并解冻(白色条形)。数值是3个供体的平均值+/-SD。所有测量均一式三份进行。

参考图4：DMSO对间充质干细胞生长的影响。含有0％，0.1％，0.3％，1％和5％DMSO的新鲜间充质干细胞以每平方厘米1000个细胞的浓度接种，并在37℃下生长所示时间。数值为3个供体的平均值±SD。

图5：在低温运输(2-8℃)72小时后，包含根据本发明方法获得的冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞的组合物3的生长曲线。一式三份数值的平均值±SD。不同供体的3个类似实验的代表。

实施例

在实施例以及附图和通用方案中说明了本发明。除非另外指出，否则以下方案中使用的取代基和整数如本发明的实施方案中所定义。阐述该部分以帮助理解本发明，但是不应解释为以任何方式限制权利要求书中所阐述的本发明。

根据本发明的方法获得并用于实施例的包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物已经在遗传学和分子生物学研究所(Instituto de Biología y GenéticaMolecular，IBGM)的细胞生产单位使用良好生产规范(GMP)进行了加工，遵循西班牙药品管理局AEMPS批准的标准操作程序(PEI Num.10-134和PEI num 15-007)。

实施例1：根据本发明的方法获得功能性间充质干细胞群体

进行协议化的抗凝程序的骨髓抽吸物是用于获得MSC的细胞来源，所述MSC用于获得实施例组合物。提取后的24小时内处理骨髓抽吸物。

获得MSC的过程大约需要21到28天。

在第一步，使用Ficoll密度梯度选择单核细胞级分(MNC)。随后，通过锥虫蓝排斥技术进行了细胞活力研究：单核细胞(MNC)必须具有≥70％的活力才能开始培养。将MNC接种到含有DMEM+20％FBS的培养瓶中(如果预计会出现细菌污染问题，添加0.5％庆大霉素)，并在10％CO₂下于37℃温育。每3或4天，用倒置显微镜观察细胞单层的外观和汇合(细胞所占培养表面的百分比)。如果汇合小于60-80％，则更换培养基。如果汇合大于80％，则将细胞培养物进行细胞解离和扩增(传代)，然后进行传代培养，以增加数量并纯化MSC细胞系。

将在第一代传代过程中获得的细胞清洗、定量并悬浮在冷藏培养基中。细胞浓度设置为每1ml冷藏培养基5-10×10⁶个MSC，所述冷藏培养基由90％FBS+10％DMSO(冷冻保存剂)制成。

逐步进行冷藏程序，将细胞在-80±8℃下保持24-72小时。在这段时间之后，将细胞在标称-196℃的液氮下储存直至使用。

根据确定的治疗日期安排了样品的恢复(包括再扩增)，治疗日期可能是长达6至20年后。

在恢复过程中，考虑到必须将样品适当调剂至其培养温度(37℃)，因此需要在15-20分钟内快速去除冷冻保护剂。

最后，将细胞重悬于完全培养基中以进行计数和细胞活力研究，但不包括活力低于70％的细胞批次。

一旦知道了恢复的存活细胞的数目，取出5×10⁵个细胞样品进行细胞遗传学分析，在本实施例中如下所见。剩余溶液以每平方厘米1000-5000个细胞的浓度接种。

将该培养物保持在37℃，10％CO₂的条件下。每4天更换一次培养基，直到细胞占据生长表面的80-100％。此时，用胰蛋白酶-EDTA进行解离。自解冻以来，恢复(包括再扩增时间)持续10-15天。

细胞活力大于80％，并且在约12小时内没有变化。

实施例2：根据本发明的方法获得的包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物

研究了在实施例1中获得的冷藏和恢复的功能性间充质干细胞的富集群体的功能特征中，几种组合物在低温条件下(2-8℃)保存3天对细胞活力的影响。三种不同的介质：林格-乳酸盐溶液，SSP+血小板添加剂溶液和

用于调节MSC的运输，其组成如表1所示。

结合以下三种溶液，研究了以下功能作用：

1.增加培养基中的K浓度，以利于K⁺通过膜Na/K ATPase泵入细胞并恢复碱金属离子梯度，所述碱金属离子梯度由于降低温度抑制了质膜Na/K ATPase而消散。另外，为了稳定质膜，增加了培养基中Mg²⁺的含量。

2.增加了缓冲能力(磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸氢盐和HEPES)以更好地保持pH值。乳酸盐和乙酸盐的存在还通过减少代谢过程中质子的产生而起作用。

3.通过添加可通过不同代谢途径起作用的代谢底物(例如葡萄糖、乙酸盐和腺苷)来促进培养基的营养效力。

4.加入透不过质膜的渗透液，如乳糖酸盐，蔗糖，甘露醇或葡聚糖，以阻止胶体渗透细胞溶解。

5.最后，通过补充含有谷胱甘肽和可溶性维生素E类似物6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸(trolox)的培养基，增加了抗氧化能力。

研究了这些添加剂中每一种的有益活性，以显示改良的效果是否是积极的。表1中显示了测试的不同溶液：

表1

图1和2显示了在低温条件下(2-8℃)储存3天期间几种组合物对细胞活力的影响。

常用的运输溶液、补充有葡萄糖和人血清白蛋白的林格乳酸盐溶液(在图1和2中用圆圈显示)，可使冷藏和恢复的MSC稳定12小时，但不适用于更长的时间。

SSP+(血小板添加剂溶液，Ringwald等人，2006，Transfusion Med Rev,vol 20,num 2,158-164)与补充有葡萄糖和人血清白蛋白的林格乳酸盐溶液的组合(组合物1，在图1和2中用空心三角形显示)也没有充分提高在低温条件下(2-8℃)储存3天的细胞的活力，但是，当向该溶液中添加trolox以获得组合物2(在图1和2中用菱形显示)时，稳定性会显著提高，如图1和2所示，其中所述组合物在72小时后提供了超过80％的活力。

含有trolox的组合物3也提供了与图2中所看到的相似性能(用实心三角形显示)。

即使在4℃下放置7天后，使用组合物2和3保存似乎仍然是足够的。

实施例3：在实施例1中获得的包含功能性间充质干细胞的富集群体的组合物的活力和表征

根据本发明的方法，如实施例1所述获得细胞后，直接按照实施例2，进行了来自七个不同供体的7批次的用含有trolox的等渗培养基制备的包含功能性MSC富集群体的组合物：组合物3的研究，并评估了一组参数，以便：

-证明根据本发明的方法在实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体适用于治疗

-证明实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体保留了细胞治疗学会(ISCT)定义的MSC的典型特征(Dominici等人,Cryotherapy,2006,vol 8,No 4,315-317)；(Wuchter等人,Cryotherapy,2015,17:128-139)，和

-证明在实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体中不存在表型和基因型畸变。

测得的参数为：

1.通过附着能力测量的细胞形态；

2.以每平方厘米细胞的扩增(生长)能力测量的细胞性能；

3.使用锥虫蓝测量的细胞活力；

4.免疫表型分析，其分析CD73、CD90、CD105和CD166的阳性表达和CD14、CD34、CD45和HLA-DR的阴性表达；

5.根据本发明的方法获得的组合物的无菌性；和

6.检查结构异常和遗传畸变的细胞遗传学研究。

形态：在所有评估的7个案例中，细胞培养物均显示出成纤维细胞方面的贴壁细胞。

细胞性能：表2显示了获得的实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体(实施例1中处理的MSC)和未经过本发明的方法处理的对照MSC(对照MSC)的每平方厘米细胞数。

表2

细胞/cm²的平均数，18391对17377(表2中的最后一行)没有显著差异，表明本发明的方法没有影响细胞的生长。

活力：表3显示了在实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体(处理的MSC)和未经过本发明的方法处理的对照MSC(对照MSC)的所获得的细胞活力。

表3

活力得到了很大程度的保留，在对照和实施例1中获得的细胞中发现的值之间没有显著差异(98对95；参见表3的最后一行)。

在所有情况下，细胞活力必须≥70％。

免疫表型分析：

在2006年，ISCT提出了三个定义间充质细胞的标准：首先，这些细胞必须在培养物中附着；第二，在不存在造血抗原如CD34和CD45的情况下表达CD90和CD105抗原；以及第三，间充质细胞必须能够“体外”分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。另外，由于该群体不具有特征表型，因此应分析其他附着分子，例如CD73、CD166的存在以及CD14和HLA-DR的缺失。

通过流式细胞术分析表面抗原，对功能性间充质干细胞的富集群体进行表型控制，这使我们能够验证间充质干细胞特异性标志物的存在。

制备了在2ml PBS中的一百万个功能性间充质干细胞的悬浮液，分配在4个试管中(250,000个细胞/管，体积为500μl)，并用下表4中所示的抗体模式标记。使用的剂量由制造商推荐。

表：用于细胞计数分析的抗体组合模式

表4

将试管在黑暗中于4℃温育20分钟。此时间之后，加入2.5ml PBS进行洗涤并在2000rpm下离心5分钟。除去上清液，并将细胞沉淀重悬于500μl PBS中，然后使样品通过流式细胞仪。

分析表明，实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体和未经过本发明的方法处理的对照MSC(新鲜MSC)均表达CD73、CD90、CD105和CD166(＞90％)，而CD14、CD34、CD45和HLA-DR均为阴性(<10％)。

另一方面，我们研究了免疫表型研究中使用的标志物在七个供体中的表达百分比(见表5)。

表5

所获得的细胞的无菌性。

产品无菌性评估中获得的结果符合既定的验收标准。在任何情况下，均未观察到微生物生长(通过自动系统-Bact/Alert中的CO₂产生来检测且符合《欧洲药典专论》(European Pharmacopoeia Monograph)6.2.27)，并且采用基于PCR/NAT的程序未检测到支原体的存在，符合《欧洲药典专论》6.2.7。

细胞遗传学研究。

除上述所有以外，获得了实施例1中获得的功能性间充质干细胞富集群体的核型，并进行评估以排除该药物可能的染色体畸变。

在对实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体的细胞遗传学研究中，没有通过G带(分辨率为400带)证实的结构异常。

总之，从本实施例中获得的结果，我们可以得出以下结论：

1.实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体(处理的MSC)和未通过本发明的方法处理的对照MSC(对照MSC)均为成纤维细胞状的贴壁细胞。

2.实施例1中获得的功能性间充质干细胞富集群体中每平方厘米获得的细胞数与对照中的相同，且足以进行质量控制以及获得足够的治疗剂量。

3.实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体(处理的MSC)和未经过本发明的方法处理的对照MSC(对照MSC)的活力相同，并且高于固定的下限(≥70％)。

4.实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体(处理的MSC)和未通过本发明的方法处理的对照MSC(对照MSC)的表型均符合国际细胞治疗学会(ISCT)确立的标准：表达CD105和CD90，没有典型的造血标志物，例如CD34、CD45和HLA-DR。细胞(无论是对照细胞还是处理的细胞)也对CD73、CD166呈阳性，并且不表达CD14。考虑到获得的表达百分比，并遵循ISCT确定的参数(Wuchter等人，2015)，我们为所考虑的阳性标志物(如CD73、CD90、CD105和CD166)建立了表达≥90％的接受标准，对于CD14、CD34、CD45和HLA-DR等标志物表达≤10％则被认为呈阴性。

5.总而言之，本发明的方法不改变或转化通过所述方法获得的功能性MSC的富集群体的特征，因此与未通过本发明的方法处理的MSC(以前使用的新鲜细胞)是生物等同的，所述以前使用的新鲜细胞在多种适应症中显示出显著的治疗价值(Orozco,Transplantation,2011,92:822-828；Orozco,Transplantation,2013,95(12):1535-1541；Vega,Transplantation 2015,99:1681-1690；Noriega,Transplantation 2017,101:1945-1951)。

6.实施例1中获得的功能性间充质干细胞的富集群体在冷藏过程后不表现出基因型畸变。

7.实施例1中获得的功能性间充质干细胞富集群体中不存在染色体畸变特征，这使我们得出结论：当MSC经历多达10次复制时仍保持稳定。

实施例4：在72小时的运输后根据本发明的方法获得的包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物的表征

测试的目标是：

-评估在72小时的运输过程后，根据本发明的方法获得的，包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物的无菌性、活力和免疫表型。

-表明在进行72小时的运输过程后，所述组合物的MSC保持体外再扩增能力，即相同的体外生长能力。

作为获得根据本发明的方法处理的MSC的细胞来源，使用了来自3个不同供体的骨髓抽吸物，并对其进行了协议抗凝过程。抽吸物样品在提取后的24小时内进行处理。

根据如实施例1中所述的本发明的方法，获得了包含功能性MSC的富集群体的组合物。将获得的功能性MSC的富集群体悬浮于本文上述实施例3的组合物3中，并在5ml注射器中以重悬于2ml中的20±2百万个细胞的剂量进行包装过程，用于退行性椎间盘疾病(DDD)治疗。对于在骨关节炎中的使用，细胞的剂量应为悬浮于8ml中的4000万个细胞。

根据本发明的方法获得的包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物具有间充质细胞的特征性免疫表型，存在CD90、CD105、CD166和CD73抗体，并且不存在CD14、CD34、CD45、HLA-DR标志物。

为了将所获得的组合物用于医疗用途而分发，其细胞活力需要大于90％，并且在进行运输模拟后，其发出后72小时内(产品失效日期)所分发的组合物的活力必须大于80％，因为产品在2-8℃下具有72小时的稳定性。

治疗剂量为最终体积2ml中20±2×10⁶个细胞。通过包含制备产品的数据的标签来鉴别包含组合物的容器。

组合物在ORCA设备中运输，该设备是经过验证的等温包装，可确保在一年中的所有时间和气候条件下，确保2至8℃的恒定温度保持至少168小时。另外，该包装不需要在冷藏车辆中运输。另外，每个盒子都装有一个数据记录器(热记录器)，该记录器提供了整个运输时间内产品被保持温度的图。

包装由一个4.4L的盒子组成，其外部尺寸为345×317×308mm，重量为7.2kg。

为了证明根据本发明在本实施例中获得的悬浮有组合物3的组合物，在72小时的运输过程后保持稳定，并保持细胞治疗协会(ISCT)(Dominici等人，Cryotherapy,2006,vol9,No 4,315-317)定义的MSC的无菌性、活力和表型特征，进行了3个批次的研究，以评估以下参数：

-运输温度

-细胞活力

-免疫表型分析

-不育

-生长动力学测试，以验证细胞在运输过程后保持复制能力。

ORCA等温包装允许运输温度可在2至8℃的范围内保持72小时。

细胞活力

在运输过程后72小时，用锥虫蓝排斥法评估了细胞活力。所有试验均一式三份进行。表6示出了所分析的供体的初始活力和在72小时获得的平均活力±标准差。

表6

在所有情况下，72小时的细胞活力均≥80％，因此符合本研究确定的标准。

免疫表型分析

流式细胞术分析表明，在分发组合物后72小时，测试的细胞表达CD73、CD90、CD105和CD166，并且在所有组合物的表达模式中对于CD14、CD34、CD45和HLA-DR均呈阴性。表5示出了在组合物装运时和产品装运后72小时通过流式细胞术分析的标志物的表达百分比。在运输过程后所有供体均显示间充质细胞表型。

表7

生长动力学测试

在运输过程后进行培养时，我们进行了生长动力学测试，记录了不同时间间隔的细胞数量。这些结果表明，在被分析的三个供体中，功能性MSC的富集群体在72小时的运输过程后仍保持复制能力。

无菌性

在模拟运输之后评估组合物的无菌性。在获得包含功能性间充质干细胞富集群体的组合物72小时后，开始3个细胞扩增过程。用不含抗生素的培养基将这些扩增维持11天。三种培养物均未显示出微生物污染的迹象，均呈现足够的生长动力学，因此保持无菌性。

根据本研究获得的结果，我们可以得出以下结论：

1.在72小时的运输过程之后，用本发明的方法获得的组合物中的间充质细胞的活力为≥80％。

2.在生长动力学的研究中，观察到包含在组合物中且保持在不含抗生素的培养基中的间充质细胞在运输后保持了无菌性。

3.在72小时的运输过程之后，组合物中包含的间充质细胞的表型符合国际细胞疗法学会(ISCT)建立的标准：在没有典型的造血标志物例如CD34、CD45和HLA-DR的情况下，表达CD105和CD90。它们也对CD73、CD166呈阳性，且不表达CD14。阳性标志物的表达百分比≥90％，阴性标志物的表达百分比≤10％。

4.在进行72小时的低温运输过程后，包含在组合物中的间充质细胞保持“体外”再扩增能力，因为它们能够分裂。

实施例5：方法的重现性

本实施例旨在验证该过程的可重复性，评估所述过程是否提供了适合作为药物产品用于治疗的标准化产品，并确认所获得的产品符合一组最终产品规格。

骨髓抽吸物是用于获得测试中使用的本发明组合物的细胞来源，根据指令2006/17/EC和西班牙RD1301/2006设定的捐赠要求进行处理。

提取后24小时内处理骨髓抽吸物。

样品中单核细胞的产量和活力示于表8中：

表8

如上所述，用于本发明方法的间充质干细胞样品的分离大约需要21至28天。通过密度梯度法用Ficoll在所述样品中选择一部分单核细胞(MNC)。在此过程结束时，利用Neubauer Chamber使用锥虫蓝排斥法进行计数和活力控制。此时，选择活力大于70％的单核细胞以开始获得间充质细胞的过程。

选择过程后，将MNC以175,000个细胞/cm²的密度接种，并在37℃和10％CO₂的条件下培养。每3或4天，用倒置显微镜观察细胞的外观，并记录生长百分比。如果小于60％至80％，则更换培养基，如果超过80％，则进行解离和细胞扩增(传代)，进行传代培养以相对于样品中存在的其他非分裂细胞增加和纯化MSC。

通过流式细胞术进行免疫表型研究，表明样品中的间充质细胞以≥90％的百分比表达CD73、CD90、CD105和CD166，并且对于CD14、CD34、CD45和HLA-DR标志物呈阴性，因为它们的表达≤10％。

表9显示了在获得两个被分析供体的细胞原种(stock)时通过流式细胞术分析的标志物的表达百分比：

标志物	表达	供体1	供体2
				CD14	≤10％	0.07％	0％
CD34	≤10％	0.04％	0.05％
				CD45	≤10％	0％	0.04％
CD73	≥90％	100％	98.53％
				CD90	≥90％	99.92％	99.33％
CD105	≥90％	99.73％	91.08％
				CD166	≥90％	98.21％	99.19％
HLA-DR	≤10％	0.04％	0.05％

表9

将在第一步骤中获得的细胞冷藏，以获得本发明方法的步骤(a)的间充质干细胞样品。

此时，用胰蛋白酶-EDTA进行酶消化，从而获得细胞悬浮液，将其冷藏在含有10％DMSO的FBS中或使用商业试剂盒(

CS5)并在-196℃的液氮中保存24天。

恢复和复苏的过程持续约7至10天，从而获得包含根据本发明的MSC的组合物。

通过在37℃温育1-2分钟解冻冷冻管，或使用诸如

CFT2解冻仪之类的自动化设备开始恢复过程，然后以2,000个细胞/cm²的密度接种细胞。

样品解冻后进行的控制在活力和细胞计数方面显示出令人满意的结果，如表10所示，因此开始细胞恢复过程以获得本发明的组合物。

表10

培养物保持在37±2℃和10％CO₂的条件下。每3-4天进行一次培养基更换。在此过程中，用倒置显微镜监测培养物，并证实在冷藏和解冻过程后，间充质细胞保持其成纤维细胞形态。

当培养物达到80％的汇合时，通过利用胰蛋白酶-EDTA的酶解离作用回收间充质干细胞。

然后将回收的功能性间充质干细胞的富集群体重悬于实施例2的组合物3中，并在5ml注射器中以重悬于2ml中的20±2百万个细胞的剂量进行包装过程。

通过细胞遗传学研究分析了功能性间充质细胞的富集群体，以验证它们在冷藏和解冻过程后是否在核型水平上表现出改变。从该分析获得的结果未显示染色体畸变。执行的控制结果示于表11中：

活性物质质量控制(QC)	供体1	供体2
			支原体检测	无	无
活力	93％	97％
			细胞计数	23,077,500个细胞	24,897,500个细胞
无菌性	无菌	无菌
			核型	无染色体畸变	无染色体畸变
累积群体加倍(PD)	1.86	1.97
			免疫表型	符合	符合

表11

通过流式细胞术对活性物质进行的免疫表型研究表明，获得的组合物的功能性间充质细胞的富集群体以≥90％的百分比表达CD73、CD90、CD105和CD166，而对于CD14、CD34、CD45和HLA-DR呈阴性，因为其表达≤10％。表12示出了从两个被分析的供体获得活性物质时通过流式细胞术分析的标志物的表达百分比：

标志物	表达	供体1	供体2
				CD14	≤10％	0.04％	0％
CD34	≤10％	0％	0％
				CD45	≤10％	0.36％	0.04％
CD73	≥90％	99.28％	97.75％
				CD90	≥90％	98.25％	99.67％
CD105	≥90％	97.99％	98.75％
				CD166	≥90％	100％	100％
HLA-DR	≤10％	0.09％	0.14％

表12

另外，在进行的效能研究中，观察到细胞分化为软骨形成组织。将它们在条件培养基中培养30天，并通过爱茜蓝(Alcian Blue)染色进行组织学研究，这使我们能够观察到发现于朝向软骨的分化细胞中的酸性多糖。表13示出了对最终产品进行控制的结果。

表13

获得的包含根据本发明的方法获得的功能性间充质干细胞富集群体的组合物，包含重悬于实施例2的组合物3中的2千万±2百万个细胞。

在这种情况下，选择1ml中1千万的包装，因为它是为治疗椎间盘再生而建立的密度。将那些组合物包装在含有2ml细胞悬浮液的5ml注射器中，在2-8℃下具有72小时的稳定性。

装有本发明组合物的容器用包括产品数据的标签标识。然后将该容器放入无菌袋中，并离开无菌区到达调节区域，在该调节区域中，在具有相应标识的盒子中进行二次包装。

组合物在经过验证的等温包装中运输，该包装可确保2至8℃的温度保持长达168小时，还包含一个数据记录器，该记录器可提供整个运输过程中产品温度的图。

另外，在整个制造过程中，确保了组合物的无菌制造。

实施例6：细胞活力的评估

为了将根据本发明的方法获得的组合物中包括的间充质干细胞的细胞活力概况与目前的冷藏方法进行比较。

为此，将间充质干细胞的第一样品用10％DMSO和FBS冷藏，在35-39℃下用含有10％CO₂的DMEM恢复，并运输调节以得到根据本发明方法的组合物3。

将间充质干细胞的第二样品冷冻在

FRS(不含DMSO！)中，并在室温(21-25℃)下解冻。

将间充质干细胞的第三样品冷冻在含有10％DMSO的盐水培养基中，并在室温(21-25℃)下解冻。

数值是3个供体的平均值+/-SD。所有测量均一式三份进行。

如图3所示，即使在保存72小时后，包括在根据本发明的方法获得的组合物中的间充质干细胞仍具有超过80％的活力(黑色条形)。另一方面，在没有DMSO的

FRS中冷藏并在室温下解冻(带斜线的条形)的间充质干细胞在保存24小时后仅具有低于50％的活力。在盐水中用DMSO冷藏并且不根据本发明步骤进行恢复而直接解冻的细胞的活力结果甚至更低。只有根据本发明获得的组合物显示出足够的稳定性和活力以用于推迟的治疗用途。

参考实施例7：评估在DMSO存在下新鲜间充质干细胞的细胞生长概况

分析了在DMSO存在下间充质干细胞的细胞生长概况，以评估DMSO在当前冷藏方法中的效果，该方法在解冻后直接利用细胞，并可能被DMSO污染。

为此，如所示，将新鲜制备的MSC样品在含有FBS，10％CO₂和不同浓度DMSO的DMEM中生长。

参考图4显示，在浓度低至0.3％的情况下，DMSO会显著干扰生长，表明即使是少量的DMSO污染(例如在冻融步骤中使用时产生的污染)也可能会阻碍生长。

实施例8：评估细胞生长概况

还针对包含根据本发明方法获得的功能性冷藏，恢复和运输调节的间充质干细胞的组合物评估了在解冻，恢复和在4℃(CRT)运输72小时后的细胞生长。

为此，将间充质干细胞样品用10％DMSO和FBS冷藏，在35-39℃下用含有10％CO₂的DMEM恢复7天，运输调节以得到根据本发明方法的组合物3，并在72小时内在低温(2-8℃)温育，然后如图4所示进行培养。

图5显示了本发明的方法中获得的组合物中所包括的间充质干细胞的生长概况与不用DMSO培养的细胞的生长概况如何相似(图4)。这意味着此处所述的恢复过程消除了在冷藏过程中使用DMSO所发现的任何可能的相互作用和毒性，同时即使在冷藏72小时后，根据本发明的方法在运输溶液中恢复和调节，仍提供显著改善的细胞活力概况。

根据本发明的方法获得的组合物的稳定性、活力和细胞生长概况允许其在治疗中的储存和推迟使用，并且解决了施用时DMSO毒性的问题。本发明的方法还允许获得具有合适表型、细胞生长和活力概况的间充质干细胞，其数量足以用于治疗剂量，从而解决了现有技术中描述的问题。最佳结果不仅需要在所述的每个步骤(冷藏、恢复和运输调节程序)中具有适当的成分，而且还需要每个基本步骤都具有适当的顺序和持续时间。

Claims

1.一种获得组合物的方法，所述组合物包含适于在治疗中施用的功能性间充质干细胞，所述方法包括以下步骤：

b.冷藏骨髓间充质干细胞样品，先将其冷却至-70℃至-90℃至少24小时，然后再将所述样品存储在液氮中；

c.通过执行以下步骤来恢复骨髓间充质干细胞样品：

c1.通过在1至5分钟内将温度逐步升高至高达35-39℃，解冻骨髓间充质干细胞样品；

c2.用适合所述样品的培养基将所述样品稀释至初始样品体积的10至30倍；

c3.离心样品，丢弃上清液并将间充质干细胞的沉淀重悬于适合所述样品的培养基中；

c4.选择活力至少为70％的间充质干细胞；

c5.将步骤(c4)中选择的间充质干细胞接种到塑料支持体上，并在35-39℃的适当培养条件下，以1000-5000个细胞/cm²的细胞浓度，用包含7.5％至10％CO₂和至少5％的胎牛血清的适合培养所述间充质干细胞的培养基温育所述间充质干细胞，

c6.以规则时间间隔更换含有7.5％至10％的CO₂和至少5％的胎牛血清的新鲜的适合培养所述间充质干细胞的培养基，并在细胞占据所述支持体表面的80％至100％时从支持体分离所述充质干细胞；

c7.选择如下的间充质干细胞：

-显示对塑料的附着；和

-表现出至少为70％的活力；和

-表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；和

-表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％的HLA-DR表达；和

-不具有染色体畸变的特征；和

-表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力；和

d.将在步骤(c7)中分离的间充质干细胞悬浮于用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基中，以获得包含功能性间充质干细胞的组合物，其中所述用于在2-8℃下运输和储存的适当培养基是等渗培养基，其包含0.25至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的冷冻保护培养基包含胎牛血清和5％至10％的DMSO。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的冷冻保护培养基是包含5％或10％的DMSO的无动物成分且无蛋白的培养基。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(b)包括在将样品保存在液氮中之前，将所述骨髓间充质干细胞的样品以1℃/min的速度从-70℃至-90℃冷藏至少25小时。

5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述包含0.25至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基是无动物成分且无蛋白的培养基。

6.根据权利要求1至2中任一项的方法，其中包含0.25至1mM的6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸的等渗培养基包含第一组合物和第二组合物的1：9至9：1混合物(v/v)，所述第一组合物包含Na⁺130mM，K⁺4mM，Ca²⁺1.35mM，氯化物109mM和乳酸盐16mM，所述第二种组合物包含Na⁺159mM，K⁺5mM，Mg²⁺0.8mM，氯化物77mM，磷酸二氢盐28mM，柠檬酸盐10mM和乙酸盐32mM，所述等渗培养基补充有葡萄糖5mM和人血清白蛋白0.1％至0.5％。

7.根据权利要求1至6的方法可获得的组合物，其包含至少0.5×10⁶个间充质干细胞的群体和0.25mM至1mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基苯并二氢吡喃-2-羧酸，其中所述间充质干细胞在2-8℃的低温运输过程中保持新鲜间充质干细胞的功能性至少72小时，所述新鲜间充质干细胞的功能性包括：

-显示对塑料的附着；和

-表现出至少为70％的活力；和

-表现出≥90％的CD90、CD 166、CD73和CD105表达；和

-表现出≤10％的CD14、CD34、CD45和≤10％HLA-DR的表达；和

-不具有染色体畸变的特征；和

-表现出分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。

8.根据权利要求7的组合物在制造药物中的用途。

9.根据权利要求7的组合物在制造用于骨关节疾病、自身免疫疾病和心血管疾病的自体或同种异体治疗的药物中的用途。

10.根据权利要求8或9中任一项的用途，其中所述组合物以1×10⁶至10×10⁶个细胞/ml的细胞密度和50万至9千万个细胞施用。

11.根据权利要求9的用途，其中所述骨关节疾病选自退行性椎间盘疾病、骨关节炎、半月板损伤和类风湿性关节炎。

12.根据权利要求10的用途，其中所述骨关节疾病选自退行性椎间盘疾病、骨关节炎、半月板损伤和类风湿性关节炎。

13.根据权利要求9的用途，其中所述自身免疫疾病选自红斑狼疮、移植物抗宿主病和系统性硬化病。

14.根据权利要求10的用途，其中所述自身免疫疾病选自红斑狼疮、移植物抗宿主病和系统性硬化病。

15.根据权利要求9的用途，其中所述心血管疾病选自周围血管功能不全、心肌梗死、卒中和缺血。

16.根据权利要求10的用途，其中所述心血管疾病选自周围血管功能不全、心肌梗死、卒中和缺血。