CN109843305B - 治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体 - Google Patents

治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体 Download PDF

Info

Publication number
CN109843305B
CN109843305B CN201780063347.2A CN201780063347A CN109843305B CN 109843305 B CN109843305 B CN 109843305B CN 201780063347 A CN201780063347 A CN 201780063347A CN 109843305 B CN109843305 B CN 109843305B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mice
msc
btbr
particles
saline
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780063347.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109843305A (zh
Inventor
丹尼尔·奥芬
尼西姆·佩列茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ramot at Tel Aviv University Ltd
Original Assignee
Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ramot at Tel Aviv University Ltd filed Critical Ramot at Tel Aviv University Ltd
Publication of CN109843305A publication Critical patent/CN109843305A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109843305B publication Critical patent/CN109843305B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Abstract

本申请公开了一种在对象中治疗神经疾病(例如自闭症)的方法。所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的源自于间充质干细胞的微粒。

Description

治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体
技术领域
本发明在其某些实施方式中涉及用于治疗神经障碍的源自于间充质干细胞的粒子，并且更具体但不排他地涉及自闭症。
背景技术
自闭症谱系障碍(ASD)是一种神经发育障碍性疾病，以三种核心症状为特征：社会交往和沟通技巧严重缺陷，重复行为增加和认知缺乏灵活性(Blenner,Reddy,&Augustyn,2011)。尽管构成ASD基础的病理生理学仍不清楚，但最近的证据表明，各种不同的分子功能障碍例如神经发生(Wegiel等，2010)、神经免疫过程(Ashwood等，2011；Li等，2009)和神经营养因子可利用性(Nickl-Jockschat&Michel,2011)的缺陷参与其中。BTBR小鼠是一种显示出沟通和社交缺陷以及认知缺乏灵活性和重复行为增加的近交系(Bolivar等，2007)。在神经方面，BTBR遭受与患有自闭症的人类相关的海马神经发生降低(Stephenson等，2011)。已显示，向BTBR小鼠的侧脑室邻近室下区处移植MSC，能够有益于它们的自闭症样行为，例如提高对不熟悉的雄性小鼠的兴趣，减少重复行为和认知不灵活性(Segal-Gavish等，2015)。
精神分裂症(SCZ)是一种严重的神经发育障碍，在世界范围内的终生风险接近1％，并以阳性症状(例如妄想和幻觉)、阴性症状(例如情感冷淡、冷漠和社交退缩)和认知功能障碍为特征。SCZ由遗传因素和环境伤害的组合引起，包括产前感染、产时并发症和大麻使用。构成SCZ的长时间过程的基础的病理机制尚未被充分阐明。因此，当前用于SCZ的抗精神病药物治疗对被认为是这种灾难性疾病的核心特点的阴性症状和认知缺损的效果不足。
外泌体最初被认为是从网织红细胞移除不需要的膜蛋白的一种机制，但当前的研究显示，它们通过将遗传信息从一个细胞运载到另一个细胞而用于细胞之间的通讯。几项研究报道了MSC来源的外泌体具有与MSC相似的功能，例如修复组织损伤、抑制炎性应答和调节免疫系统(Yu等，2014)。外泌体可以被容易地示踪并且可以被靶向到特定区域，使得与细胞相比更容易跟踪它们的作用机制(Valadi等，2007)。此外，已显示外泌体在鼻内给药时对脑具有显著的生物学效应，例如降低炎性(Zhuang等，2011)。
US 20150190430教导了用于治疗阿兹海默氏病和帕金森氏症的MSC的外泌体。
WO2013150303教导了用于治疗ND障碍的神经干细胞的外泌体。
Yu等，Int J Mol Sci.2014Mar；15(3):4142–4157教导了用于治疗阿兹海默氏病的MSC的外泌体。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种在对象中治疗神经疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的源自于间充质干细胞(MSC)的粒子，从而在所述对象中治疗所述神经疾病，其中所述神经疾病不是阿兹海默氏病或帕金森氏症。
根据本发明的一个方面，提供了一种在对象中治疗自闭症谱系障碍(ASD)的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的源自于间充质干细胞的微粒，从而治疗所述自闭症谱系障碍。
根据本发明的一个方面，提供了一种在需要的对象中治疗中风的方法，所述方法包括向所述对象鼻内给药治疗有效量的源自于间充质干细胞的粒子，从而在所述对象中治疗中风。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述神经疾病是精神分裂症。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述给药包括鼻内给药。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述粒子选自外泌体、微囊泡、膜粒子、膜囊泡、核外颗粒体和外囊泡。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述粒子是外泌体。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述粒子是微粒。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述间充质干细胞源自于牙髓。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述间充质干细胞源自于骨髓。
根据所描述的优选实施方式中的其他特点，所述MSC是人类MSC。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和/或科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管与本文中所描述的相似或等效的方法和材料可用于本发明的实施方式的实践或试验，但下文中描述了示例性的方法和/或材料。在有冲突的情况下，以本专利说明书、包括定义为准。此外，所述材料、方法和实例仅仅是说明性的，并且不打算是必定限制性的。
附图说明
在本文中，参考附图描述了本发明的一些实施方式，它们仅仅是作为实例。现在具体参考附图进行详细说明，应该强调的是，示出的细节是示例性的，并出于对本发明的实施方式进行说明性讨论的目的。就此而言，伴有附图的描述使本领域技术人员明显看出可以如何实践本发明的实施方式。
在所述附图中：
图1.当静脉内、鼻内和立体定向给药时，用PKH26染色的MSC-外泌体。在给药后1小时对脑进行分析。立体定向给药得率为100％，鼻内给药为68.5％，静脉内给药为11.2％。
图2A-B.在神经元中发现鼻内MSC-外泌体。DAPI-NEUN-PKH26.X60。
图3A-C.在MSC-外泌体的鼻内给药后超声波发声的特异性改进。A.BTBR MSC-exo与盐水BTBR相比具有更多的超声波发声音节。B.所述组之间在社交接触(鼻与鼻和鼻与生殖器)方面没有显著差异，说明了对超声波发声的特异性效应。C.每个组的典型音节的可视化。BTBR MSC-exo在音节持续时间和复杂性的特点方面变得更接近于C57bl。**p<0.01，***p<0.001，SEM。
图4A-B.MSC-外泌体增加雄性与雄性社交(A)，并减少社交期间的重复行为(B)。试验每个组以获得基线行为(灰色)，并在治疗后3周再次试验(盐水或MSC-exo，黑色)。BTBRMSC-exo是在治疗之前和之后在花费于社交的时间和社交期间的重复行为方面具有显著差异的唯一的组(配对T-检验，SEM)。BTBR MSC-exo在治疗之前显著不同于C57bl盐水组，并且显著不同于BTBR盐水组(ANOVA1，SEM)。***p<0.001。
图5.MSC-外泌体减少自我梳理的重复行为。试验每个组以获得基线行为(灰色)，并在治疗后3周再次试验(盐水或MSC-exo，黑色)。BTBR MSC-exo是在治疗之前和之后在自我梳理花费的时间方面具有显著差异的唯一的组(配对T-检验，SEM)。BTBR MSC-exo在治疗之前显著不同于C57bl盐水组，并且显著不同于BTBR盐水组(ANOVA1，SEM)。*p<0.05。
图6A-B.MSC-外泌体降低认知僵化。BTBR-exo小鼠更可能学会T-水迷宫测定法的逆转，并且更少可能恢复到在第一和第二天学会的模式(A)。BTBR-exo小鼠在它们的学习中更快，有4只小鼠到第6次试验为止学会了一致地行进在逆转的路径上。BTBR-盐水小鼠花费更多的时间学会，并且更少可能一致地转向正确的道路。在10次试验后。6只BTBR-盐水小鼠中的3只学会了新的路径，但它们之中仅仅2只能够可靠地遵循它。在每一次试验时组之间的比较是不显著的，但正确转向的总数在MSC-exo组中与盐水组相比明显更高，并且组的总成功数之间的差异是显著的(B)，(t＝0.026)。
图7.MSC-外泌体提高母性行为的学习。C57bl母亲鼠在平均9.9秒内将所有幼崽集合到掩蔽所(C57bl，白色)，处女鼠在180秒后不集合任何幼崽(c57bl，浅灰色)，并且与C57BL母亲鼠相处3天的处女鼠学会了在平均37秒内集合所有幼崽(C5bl，深灰色)。盐水给药的BTBR母亲鼠在180秒后未集合大多数幼崽。BTBR处女鼠在180秒后不集合任何幼崽。BTBR MSC-exo在与BTBR盐水母亲鼠相处2天后，在平均55秒内集合所有幼崽(SEM)。
图8A-B是说明了MSC-外泌体治疗的小鼠与对照相比在PCP注射后活性降低的图。
图9是说明了PCP亚慢性治疗对中枢信息处理的影响的图。条形图示出了在潜伏抑制任务的调制阶段中，在音调CS期间在未预先暴露(NPE)和预先暴露(PE)的对象中的僵直时间百分数。符号(*)和(**)分别是指P<0.05和P<0.01的统计显著性。所有的值都是平均值±SEM。
图10是说明了PCP亚慢性治疗对系统性安非他明(2.5mg/kg，i.p.)的易感性的影响的图。PCP治疗提高了对系统性安非他明的运动响应，正如通过小鼠在旷场中的移动距离(单位为cm)所度量的。仅示出了在40-min的活动峰之后的统计显著性。
图11是示出了三室社交取向试验的结果的图。测量花费在社交笼和非社交笼附近的时间。呈现的是偏好指数，指示了花费在社交刺激物附近的时间相对于花费在社交和非社交刺激物两者附近的时间的量。符号(*)和(**)分别是指P<0.05和P<0.01的统计显著性。所有的值都是平均值±SEM。
图12A是示出了在BTBR小鼠中MSC来源的外泌体但不是NSC来源的外泌体提高雄性与雄性的社交并减少社交期间的重复行为的图。与盐水治疗和NSC-exo治疗的小鼠相比，只有MSC-exo治疗的小鼠表现出花费于社交的时间的显著增加和重复行为的显著减少(未配对T-检验，*p<0.05，***p<0.001)。数据被呈现为平均值+SEM。
图12B是示出了在MSC-exo鼻内给药后存在超声波发声的显著改进的图。NSC-exo无效。
具体实施方式
本发明在其某些实施方式中涉及源自于间充质干细胞的粒子，其用于治疗神经障碍，并且更具体但不排他地涉及自闭症。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应该理解，本发明在其应用中不必定受限于在下面的描述中陈述或由实施例示例的具体细节。本发明可以具有其他实施方式或能够以各种不同方式实践或执行。
外泌体最初被认为是从网织红细胞除去不需要的膜蛋白的一种机制。然而，最近的研究显示，它们也通过将遗传信息从一个细胞运载到另一个细胞而用于细胞间通讯。外泌体主要含有蛋白质以及RNA和大量微RNA。大约25％的这些蛋白质和RNA在细胞生产和维护中发挥作用。
本发明人调查了间充质干细胞来源的外泌体是否对神经疾病具有有益效果。
在第一种情况下，本发明人使用近交系小鼠BTBR T1tf/J(BTBR)调查了间充质干细胞来源的外泌体对自闭症的效果，所述小鼠合并有与自闭症的三种诊断性症状——社会交际和沟通技巧的严重缺陷、重复行为增加和认知不灵活性——相关的多种行为表型。BTBR小鼠与C57BL对照相比表现出社交途径的选择性减少、互动社交减少和青春期玩闹受损。
本发明人已显示，鼻内给药间充质干细胞来源的外泌体(在本文中也被称为MSC-exo)的小鼠在社交领域表现出显著改善。用MSC来源的外泌体治疗的雄性BTBR小鼠与治疗前它们自己的基线行为相比和与其他盐水治疗的雄性相比，表现出提高的对其他陌生雄性的社交兴趣(图4A-B)。它们花费于社交的时间与c57bl组相当。在雄性对雌性超声波发声(USV)通讯中，用MSC-exo治疗的小鼠与盐水治疗组相比具有对雌性明显更高的USV数(图3A-C)。BTBR小鼠的自闭症样行为的第二个核心症状是花费在挖掘和梳理的重复行为上的时间增加。在这里，本发明人显示了用MSC来源的外泌体治疗的小鼠与它们的基线相比，在社交期间和被隔离时在重复行为上花费更少时间(图5)。BTBR小鼠的自闭症样行为的第三个核心症状是认知僵化。本发明人显示了在T-水迷宫测定法期间，MSC来源的外泌体治疗的小鼠与盐水治疗组相比在救生平台的逆转条件期间具有明显更少的错误(图6A-B)。
本发明人还检查了MSC来源的外泌体对幼崽找回行为的影响。已知在产仔后，母亲鼠为新生幼崽筑巢，并且当幼崽脱离时，母亲鼠立即查找它并将它带回巢。处女鼠不找回脱离的幼崽，但如果处女鼠与母亲鼠相处几天，则处女鼠可以学会幼崽找回行为，因此变成有经验的处女鼠(Marlin,Mitre,D’amour,Chao,&Froemke,2015)。在这里，本发明人显示BTBR母亲鼠和BTBR有经验处女鼠都不像c57bl母亲鼠那样表现出基线幼崽找回行为。然而，当用MSC来源的外泌体治疗时，BTBR有经验处女鼠具有与c57bl有经验处女鼠相同的幼崽找回行为(图7)。
在第二种情况下，本发明人使用基于起到NMDA谷氨酸受体拮抗剂作用的苯环己哌啶(PCP)的药理学大鼠模型，调查了间充质干细胞来源的外泌体对精神分裂症的影响。
图8A-B和10说明，当用PCP给药时，用间充质干细胞来源的外泌体治疗的小鼠对系统性安非他明给药显示出降低的运动响应。图9示出了在PCP处理的小鼠中MSC来源的外泌体对中枢信息处理的正面效果，通过评估听觉惊跳反射来分析。此外，在这个模型中外泌体治疗的小鼠显示出对社交刺激物的最高偏好(图11)。
合在一起，本发明人已证实了间充质干细胞来源的外泌体在具有非常不同的病因学的两种神经障碍中的阳性效果。因此，本发明人提出了间充质干细胞来源的外泌体可以充当有用的治疗剂用于普遍的神经疾病。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种在对象中治疗神经疾病的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的源自于间充质干细胞的粒子，其中所述神经疾病不是阿兹海默氏病或帕金森氏症，从而在所述对象中治疗所述神经疾病。
术语“间充质干细胞”是指多能基质细胞，其可以分化成各种不同的细胞类型，包括：成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。
在它们的多能状态下，间充质干细胞通常表达下述标志物：CD105，CD166，CD29，CD90和CD73，并且不表达CD34、CD45和CD133。
间充质干细胞可以从各种不同的组织分离，包括但不限于骨髓、脂肪组织、牙髓、口腔黏膜、外周血和羊水。
分离、纯化和扩增间充质干细胞(MSC)的方法在本领域中是已知的，并包括例如由Caplan和Haynesworth在美国专利号5,486,359中以及Jones E.A.等，2002，骨髓多能间充质祖细胞的分离和表征(Isolation and characterization of bone marrowmultipotential mesenchymal progenitor cells)，Arthritis Rheum.46(12):3349-60中所公开的那些方法。
优选地，间充质干细胞培养物通过如下方法产生：将BM抽出物(通常20ml)用等体积的Hank's平衡盐溶液(HBSS；GIBCO Laboratories,Grand Island,NY,USA)稀释，并将所述稀释的细胞在约10ml Ficoll柱(Ficoll-Paque；Pharmacia,Piscataway,NJ,USA)上分层。在以2,500x g离心30分钟后，从界面取出单核细胞层并悬浮在HBSS中。然后将细胞以1,500x g离心15分钟并重悬浮在完全培养基(MEM，一种不含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的培养；GIBCO)中，所述培养基增补有20％源自于为MSC的快速生长而选择的批次的胎牛血清(FCS)(Atlanta Biologicals,Norcross,GA)、100单位/ml青霉素(GIBCO)、100μg/ml链霉素(GIBCO)和2mM L-谷氨酰胺(GIBCO)。将重悬浮的细胞在10cm培养皿(Corning GlassWorks,Corning,NY)中，在约25ml培养基中铺板，并在37℃和5％加湿CO2下温育。在培养基中24小时后，舍弃非粘附细胞并将粘附细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分清洗两次。每3或4天将培养基用新鲜的完全培养基更换，共约14天。然后用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA(胰蛋白酶/EDTA，GIBCO)在37℃处理5min来收获粘附细胞，在6-cm板中重新铺板并另外培养14天。然后将细胞用胰蛋白酶处理，并使用细胞计数装置例如血细胞计数器(HausserScientific,Horsham,PA)计数。通过离心回收培养的细胞，并用5％DMSO和30％FCS以1至2X106个细胞/ml的浓度重悬浮。将各约1ml的等分试样缓慢冷冻并储存在液氮中。
为了扩增间充质干细胞级分，将冷冻的细胞在37℃融化，用完全培养基稀释并通过离心回收，以除去DMSO。将细胞重悬浮在完全培养基中，并以约5,000个细胞/cm2的密度铺板。在培养24小时后，除去非粘附细胞并使用胰蛋白酶/EDTA收获粘附细胞，通过狭窄的巴斯德吸管进行解离，并优选地以约1.5至约3.0个细胞/cm2的密度重新铺板。在这些条件下，MSC培养物可以生长约50的群体倍增值并扩增约2000倍[Colter DC.等，来自于人类骨髓的塑料粘附细胞培养物中回收利用的干细胞的快速扩增(Rapid expansion ofrecycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bonemarrow)，Proc Natl Acad Sci USA.97:3213-3218,2000]。
本发明的某些实施方式使用的MSC培养物优选地包含由形态学特点定义的三组细胞：小且无颗粒的细胞(在下文中被称为RS-1)，小且有颗粒的细胞(在下文中被称为RS-2)和大且具有中等颗粒的细胞(在下文中被称为成熟MSC)。这些细胞在培养物中的存在和浓度，可以通过使用例如免疫荧光、原位杂交和活性测定法鉴定各种不同的细胞表面标志物的存在或不存在来测定。
正如提到过的，本发明设想了将源自于间充质干细胞的粒子用于治疗神经疾病。
当在本文中使用时，术语“粒子”是指合并有生物物质例如蛋白质和/或RNA的分立的实体。应该认识到，本发明的这一方面的粒子不是生物细胞。
所述粒子可以通过几种手段中的任一种从MSC衍生，例如通过从MSC分泌、出芽或扩散。例如，所述粒子可以从MSC生产、渗出、发射出或脱落。在所述MSC在细胞培养物中的情况下，所述粒子可以被分泌到细胞培养基中。
所述粒子具体来说可以包含囊泡。所述粒子可以包含外泌体。本文描述的粒子可以包含本文中描述的外泌体的任一种或多种性质。
所述粒子可以包含由脂质双层限制的囊泡或扁平球体。所述粒子可以具有40-100nm的直径。所述粒子可以通过内体膜的向内出芽来形成。所述粒子可以具有约1.13-1.19g/ml的密度，并且可以漂浮在蔗糖梯度上。所述粒子可以富含胆固醇和鞘磷脂以及脂筏标志物例如GM1、GM3、阀蛋白和src蛋白激酶Lyn。所述粒子可以包含在间充质干细胞或间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)中存在的一种或多种蛋白质，例如MSC或MSC-CM特征性或特异性的蛋白质。它们可以包含RNA例如miRNA。
根据特定实施方式，所述粒子是外泌体。
当在本文中使用时，术语“外泌体”是指在多泡体(MVB)与质膜融合后从细胞释放出的细胞外囊泡。
所述外泌体可以(a)具有50nm至100nm之间的尺寸，正如通过电子显微术所确定的；(b)包含分子量>100kDa的复合体，其包含<100kDa的蛋白质；(c)包含分子量>300kDa的复合体，其包含<300kDa的蛋白质；(d)包含分子量>1000kDa的复合体；(e)具有2nm至200nm之间的尺寸，正如通过针对0.2pM滤膜过滤并针对分子量截留值为10kDa的膜浓缩所确定的；或(f)低于100nm的流体力学半径，正如通过激光衍射或动态光散射所确定的。
所述粒子可以是可从间充质干细胞(MSC)或间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)分离的物质。所述粒子可以至少负责所述MSC或MSC-CM的活性。所述粒子可以负责并执行所述MSC或MSC-CM的绝大多数或所有的功能。例如，所述粒子可以是MSC或MSC-CM的替代品(或生物替代品)。
所述粒子优选地具有间充质干细胞的至少一种性质。所述粒子可以具有生物学性质，例如生物学活性。所述粒子可以具有MSC的任何生物学活性。所述粒子可以例如具有MSC的治疗或恢复活性。
所述粒子可以以多种方式生产或分离。这种方法可以包括从间充质干细胞(MSC)分离所述粒子。这种方法可以包括从间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)分离所述粒子。
所述粒子可以例如通过在所述粒子的任何性质的基础上与非结合性组分分开来分离。例如，所述粒子可以在分子量、尺寸、形状、组成或生物学活性的基础上分离。
在分离期间、之前或之后，可以对条件培养基进行过滤或浓缩或两者。例如，它可以通过膜，例如具有一定尺寸或分子量截留值的膜过滤。它可以经历切向力过滤或超滤。
例如，可以使用在本文献中别处的用于分子量的测定法中所描述的使用具有适合的分子量或尺寸截留值的膜的过滤。
所述任选被过滤或浓缩或两者的条件培养基，可以经历其他分离手段例如柱层析。例如可以使用具有各种不同柱的高效液相色谱(HPLC)。所述柱可以是尺寸排阻柱或结合柱。
所述粒子的一种或多种性质或生物学活性，可用于在间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)的分级期间追踪它的活性。例如，光散射、折射率、动态光散射或UV-可见光检测器，可用于跟踪所述粒子。例如，在分级期间可使用治疗活性或心脏保护活性来追踪所述活性。
下面的段落提供了可以如何获得间充质干细胞粒子例如外泌体的具体实例。
间充质干细胞粒子可以通过将间充质干细胞在培养基中培养以调制它来生产。所述培养基可以包含DMEM。所述DMEM可以不包含酚红。所述培养基可以增补有胰岛素、转铁蛋白或硒蛋白(ITS)或其任何组合。它可以包含FGF2。它可以包含PDGF AB。FGF2的浓度可以为约5ng/ml FGF2。PDGF AB的浓度可以为约5ng/ml。所述培养基可以包含谷氨酰胺-青霉素-链霉素或-巯基乙醇或其任何组合。
所述细胞可以培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天，例如3天。所述条件培养基可以通过从培养基分离细胞来获得。所述条件培养基可以例如以500g离心。它可以通过膜过滤来浓缩。所述膜可以包括>1000kDa的膜。所述条件培养基可以被浓缩约50倍或更多倍。
所述条件培养基可以经历液相色谱例如HPLC。所述条件培养基可以通过孔径排阻来分离。可以使用任何孔径排阻基质例如Sepharose。作为实例，可以使用TSK保护柱SWXL，6x40mm或TSK gel G4000SWXL，7.8x300mm。洗脱缓冲液可以包含任何生理培养基例如盐水。它可以包括含有150mM NaCl的pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液。层析系统可以以0.5ml/min的流速来平衡。洗脱模式可以是等度的。可以使用在220nm处的UV吸收值来追踪洗脱的进展。可以使用准弹性光散射(QELS)检测器来检查级分的动态光散射(DLS)。
可以保留已发现表现出动态光散射的级分。例如，发现通过如上所述的通用方法产生并以11-13分钟、例如12分钟的保留时间洗脱的级分表现出动态光散射。该峰中的粒子的rh为约45-55nm。这些级分包含间充质干细胞粒子例如外泌体。
所述粒子可以具有大于2nm的尺寸。所述粒子可以具有大于5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm的尺寸。所述粒子可以具有大于100nm，例如大于150nm的尺寸。所述粒子可以具有基本上200nm或更大的尺寸。
所述一个或多个粒子可以具有例如2nm至20nm、2nm至50nm、2nm至100nm、2nm至150nm或2nm至200nm的尺寸范围。所述一个或多个粒子可以具有20nm至50nm、20nm至100nm、20nm至150nm或20nm至200nm之间的尺寸。所述一个或多个粒子可以具有50nm至100nm、50nm至150nm或50nm至200nm之间的尺寸。所述一个或多个粒子可以具有100nm至150nm或100nm至200nm之间的尺寸。所述一个或多个粒子可以具有150nm至200nm之间的尺寸。
所述尺寸可以通过各种不同手段来确定。原则上，所述尺寸可以通过尺寸分级和通过具有相关尺寸截留值的膜过滤来确定。然后可以通过使用SDS-PAGE或通过生物学测定法追踪组分蛋白的分离，来确定所述粒子尺寸。
所述尺寸可以包括流体力学半径。所述粒子的流体力学半径可以低于100nm。它可以在约30nm至约70nm之间。所述流体力学半径可以在约40nm至约60nm之间，例如约45nm至约55nm之间。所述流体力学半径可以为约50nm。
所述粒子的流体力学半径可以通过任何适合的手段来确定，例如激光衍射或动态光散射。
所述粒子可以包含由间充质干细胞分泌的一种或多种蛋白质或多核苷酸。所述粒子可以包含存在于间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)中的一种或多种蛋白质或多核苷酸。在特定实施方式中，所述粒子可以包含源自于MSC的miRNA。
例如，所述粒子可以包含10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多或70％或更多的这些蛋白质和/或多核苷酸。所述粒子可以包含基本上约75％的这些蛋白质和/或多核苷酸。所述蛋白质可以通过参考蛋白质名单或基因名单的基因产物来确定。
正如提到过的，本发明的这一方面的粒子可用于治疗神经疾病。
可以治疗的对象包括哺乳动物对象，例如人、小鼠、大鼠、猴、狗和猫。
术语“神经疾病”是指脑、脊髓和/或连接它们的神经的疾病。
根据一个实施方式，所述疾病是记忆疾病。
在优选实施方式中，所述疾病是神经发育障碍例如自闭症或精神分裂症。
根据另一个实施方式，所述疾病是行为疾病例如精神分裂症、注意力缺陷多动障碍、自闭症、图雷特综合征、强迫症以及神经系统的变性的神经行为相关的症状，例如帕金森氏症、特发性震颤、亨廷顿病、阿兹海默氏病、多发性硬化症和器质性精神病。
在一个实施方式中，所述神经疾病不是帕金森氏症或阿兹海默氏病(AD)。
在另一个实施方式中，所述神经疾病不是中风。
根据特定实施方式，所述神经疾病是自闭症谱系障碍(ASD)。
正如提到过的，本发明的实施方式的粒子可用于制备药物(被可互换地称为药物组合物)，其中将这种药物配制成用于治疗神经疾病。
可以使用各种不同的移植方法将本发明的粒子给药到被治疗的个体，所述移植方法的本质取决于植入位点。
术语或短语“移植”、“细胞替换”或“嫁接”注射在本文中可互换使用，并且是指将本发明的粒子引入到靶组织例如脑、灰质等。所述粒子从其获得的间充质干细胞可以源自于受体(同种异体)或源自于非同种异体或异种供体。
所述粒子可以被直接移植到脊髓中(鞘内)、静脉内移植、直接移植到脑中或其组合，使得它到达脑。在一个实施方式中，所述粒子被非侵入性例如鼻内递送。也考虑到了其他给药模式，例如系统性给药。
对于70kg的人来说，每次治疗可以给药(例如鼻内)的粒子(例如外泌体)的示例性剂量可以在1x106–1x1020之间，更优选地在1x109–1x1015之间。
在本文描述的任何方法中，所述粒子可以自身给药，或者优选地作为还包含可药用载体的药物组合物的一部分给药。
当在本文中使用时，“药物组合物”是指本文中描述的粒子与其他化学组分例如适合于制药的载体或赋形剂的制备物。药物组合物的目的是为了便于所述粒子向对象的给药。
在后文中，术语“可药用载体”是指对对象不引起显著刺激并且不废止被给药的化合物的生物学活性和性质的载体或稀释剂。载体的非限制性实例是丙二醇，盐水，乳液，缓冲液，培养基例如DMEM或RPMI，含有清除自由基、提供pH缓冲、胶体渗透压/渗透压支持、能量底物和在低温下平衡细胞内状态的离子浓度的低温储存培养基，以及有机溶剂与水的混合物。
通常，所述药物载体保留所述组合物中的粒子数目(例如减少不超过90％)至少24小时、至少48小时或甚至至少96小时。
在本文中，术语“赋形剂”是指添加到药物组合物以进一步便于化合物的给药并在移植/注射之前将细胞生存力在预定的温度下维持适合时间段的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括白蛋白、血浆、血清或脑脊液(CSF)、抗氧化剂例如乙酰基半胱氨酸(NAC)或白藜芦醇。
根据本发明的优选实施方式，所述药物载体是缓冲剂的水性溶液或培养基例如DMEM。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂来说，治疗有效量或剂量最初可以从体外和细胞培养物测定法来估算。优选地，将药剂配制成在动物模型中获得所需浓度或滴度。这种信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。
本文中描述的活性成分的毒性和治疗效能，可以通过标准的制药程序在体外、在细胞培养物或实验动物中确定。
从这些体外和细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可用于配制在人类中使用的剂量范围。进一步的信息可以从临床研究获得，参见例如Salem HK等，Stem Cells2010；28:585-96；和Uccelli等，Lancet Neurol.2011；10:649-56。
所述剂量可以随着使用的剂型和利用的给药途径而变。准确的配方、给药途径和剂量可以由各个医生根据患者的状况来选择(参见例如Fingl等，1975，在《治疗剂的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)Ch.1p.1中)。
对于注射来说，可以将所述药物组合物的活性成分配制在水性溶液中，优选在生理相容的缓冲液例如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液和上文中描述的其他药剂。
剂量和时间间隔可以个性化调整到所述活性药剂足以有效地治疗所述神经障碍的水平。获得所需效果所必需的剂量取决于个体特征和给药途径。
取决于待治疗的病症的严重性和响应性，粒子的给药可以是单次或多次给药，并且取决于何时实现疾病状态的减弱，疗程持续几天到几周或几个月。
待给药的粒子的量当然依赖于待治疗的个体、疾患的严重性、给药方式、处方医师的判断等。给药的剂量和时间安排将对个体状况变化的仔细和连续的监测有应答。
在给药后，可以追踪所述粒子以便确保它们到达靶位点。这可以使用例如金纳米粒子来进行，参见WO 2013186735 A3。
在至少某些实施方式中，本发明的粒子可以以单元剂量形式预包装在即用型注射器中。所述注射器可以标注有粒子的名称和它们的来源。所述标签也可以包含与所述粒子的功能相关的信息。所述注射器可以被包装在也标注有与粒子相关的信息的包装物中。
在至少某些实施方式中，本发明的粒子可以与可用于治疗神经障碍的治疗剂共同给药，所述治疗剂例如神经节苷脂、抗生素、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子和抗代谢物小分子药剂和神经递质分子的前体例如L-DOPA。另外或可选地，本发明的粒子在至少某些实施方式中可以与能够改善所述神经疾病的至少一种症状的其他细胞共同给药。
当在本文中使用时，术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“具有”和它们的词形变化形式意味着“包括但不限于”。
术语“由……构成”意味着“包括并限于”。
术语“基本上由……构成”意味着所述组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但前提是所述另外的成分、步骤和/或部分不实质性改变所请求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征。
当在本文中使用时，没有具体数目的指称包括复数指称物，除非上下文明确陈述不是如此。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，本发明的各种不同实施方式可能以范围的格式陈述。应该理解，采取范围格式的描述仅仅是出于方便和简洁，并且不应被解释为对本发明范围的刚性限制。因此，范围的描述应该被认为具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围的描述例如1至6，应该被认为具体地公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数字例如1、2、3、4、5和6。不论所述范围的宽度如何，这一点都适用。
当在本文中指明数值范围时，它意味着包括在所指明的范围内的任何提到的数值(分数或整数)。短语“范围在第一个指明数字到第二个指明数字之间”和“范围从第一个指明数字至第二个指明数字”在本文中可互换使用，并且意味着包括所述第一和第二个指明数字以及它们之间的所有分数和整数数值。
当在本文中使用时，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于为化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或者容易从已知的方式、手段、技术和程序开发出来的那些方式、手段、技术和程序。
当在本文中使用时，术语“治疗”包括废止、显著抑制、减缓或逆转病症的发展，显著改善病症的临床或美学症状，或显著预防病症的临床或美学症状的出现。
应该认识到，本发明的为清晰起见在分开的实施方式的背景中描述的某些特点，也可以组合提供在单一实施方式中。相反，本发明的为简洁起见在单一实施方式的背景中描述的各种不同特点，也可以分开地或以任何适合的子组合或视为合适的方式提供在本发明的任何其他描述的实施方式中。在各个不同实施方式的背景中描述的某些特点不应被视为那些实施方式的必不可少的特点，除非所述实施方式没有这些要素就不能起作用。
在上文中描述和在权利要求书部分中提出权利要求的本发明的各种不同实施方式和特点，在下面的实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考下面的实施例，其与上面的描述一起，以非限制性方式说明了本发明的某些实施方式。
总的来说，在本文中使用的命名和在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中被充分解释。参见例如《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:Alaboratory Manual)，Sambrook等(1989)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第I-III卷，Ausubel,R.M.主编(1994)；Ausubel等，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal，《分子克隆实用指南》(A PracticalGuide to Molecular Cloning)，John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等，《重组DNA》(Recombinant DNA)，Scientific American Books,New York；Birren等主编，《基因组分析实验室指南丛书》(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)，Vols.1-4,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中阐述的方法；《细胞生物学实验指南》(CellBiology:A Laboratory Handbook)，Volumes I-III Cellis,J.E.主编.(1994)；《动物细胞的培养——基本技术手册》(Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique)，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；《免疫学现代方法》(Current Protocols inImmunology)，第I-III卷，Coligan J.E.主编(1994)；Stites等主编，《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)(第八版)，Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi主编，《细胞免疫学选用方法》(Selected Methods in CellularImmunology)，W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可用的免疫测定法广泛描述在专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)，Gait,M.J.主编(1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，Hames,B.D.和Higgins S.J.主编(1985)；《转录和翻译》(Transcription and Translation)，Hames,B.D.和Higgins S.J.主编(1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)，Freshney,R.I.主编(1986)；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells and Enzymes)，IRLPress,(1986)；《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)，Perbal,B.,(1984)和《酶学方法》(Methods in Enzymology)，Vol.1-317,Academic Press；《PCR方案：方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications)，Academic Press,San Diego,CA(1990)；Marshak等，《蛋白质纯化和表征策略——实验室课程手册》(Strategies for Protein Purification and Characterization-A LaboratoryCourse Manual)，CSHL Press(1996)；所有这些文献通过参考并入本文，如同在本文中完全阐述。其他通用参考文献被提供在整个本文件中。其中的程序据信在本领域中是公知的，并且出于方便读者而提供。其中包含的所有信息通过参考并入本文。
实施例1
MSC来源的外泌体用于治疗自闭症
材料和方法
间充质干细胞(MSC)制备：人类MSC购自Lonza(Basel,Switzerland)。将细胞如以前所述进行培养和扩增(Sadan等，2012)。
纯化方案：外泌体通过下述过程来纯化：获取培养物流体，并将它以300g离心10分钟。回收上清液并以2000g离心10分钟。再一次回收上清液，并以10000g离心30分钟。取出上清液，通过0.22um滤器，并以100000g离心70分钟。将含有外泌体和蛋白质的沉积物在PBS中清洗，然后以100000g离心70分钟。将含有纯化的外泌体的沉积物重悬浮在200ul灭菌PBS中。每次离心在4摄氏度下进行。
每只小鼠给药的粒子数目＝8.5x109个粒子/ul。
染色方案：通过将2ul pKH 26在500ul稀释剂中混合，产生储用溶液。从所述储用液，取100ul添加到50ul PBS中的外泌体。5分钟后，向上述混合物添加100ul无外泌体血小板，然后在4摄氏度下以100g离心90分钟。将沉积物重悬浮在200ul PBS中。使用MaestroCRi获取全脑荧光成像，激发滤光片为523nm，发射滤光片为560nm。
动物：BTBR T1tf/J小鼠从最初购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)的成对成年小鼠繁殖。在5周龄时，将第一组同窝雄性小鼠随机指派到盐水鼻内给药(盐水，n＝7)或MSC-exo鼻内给药(MSC-exo，n＝7)。在5周龄时，将第一组同窝雌性小鼠随机指派给盐水鼻内给药(盐水，n＝9)或MSC-exo鼻内给药(MSC-exo，n＝6)。
C57bl/6小鼠从最初购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)的成对成年小鼠繁殖。在5周龄时，将第一组同窝雄性小鼠通过鼻内给药提供盐水(盐水，n＝7)。在5周龄时，将第一组同窝雌性小鼠随机指派给盐水鼻内给药(盐水，n＝7)和无盐水(无，n＝11)。
小鼠在每个笼子中以3-5只同窝仔畜为一组饲养。在外泌体给药之前，首先在5-7周时试验小鼠的基线行为，外泌体给药发生在7-9周。(隔天给药5ul外泌体或盐水共14天，总量为35ul)。
在外泌体给药后三周，将6只BTBR-MSC-exo处女鼠与1只BTBR-盐水妊娠雌鼠放在一起，用于母性行为学习。将5只BTBR-盐水处女鼠与一只C57-盐水妊娠雌鼠放在一起，用于母性行为学习。
行为试验：
旷场：将小鼠置于45X45X45cm旷场中总共20分钟。使用Ethovision v10.11测量移动的总距离和花费在中心的时间的量。
超声波发声：雄性对雌性的超声波发声使用Avisoft-RECORDER v.4.2.21记录程序来试验。设置包括250kHz的采样频率和16比特的格式。为了产生声谱图，将记录转移到Avisoft-SASLab Pro 5.2.07版，并进行快速傅里叶变换(FFT)。声谱图使用FFT产生，长度为256个点，时间窗交叠为50％(100％框架，FlatTop窗口)。BTBR T1tf/J和C57bl/6雄鼠两者都遇到C57bl/6雌鼠。将每只雄鼠在分开的笼子中放置1小时，然后将雌鼠放置在所述笼子中。记录相遇的前5分钟的超声波发声并拍摄下来，用于雄性-雌性社交分析。
相互二元社交试验：相互二元社交试验(Silverman等，2012)使用5周龄雄性C57BL/6陌生小鼠作为社交刺激物来进行。将陌生小鼠与试验小鼠一起放置在40X40X20cm笼子中。两只小鼠都记录20分钟；最后10min由对治疗不知情的观察者定量。在试验之前将两只小鼠隔离1小时。使用Cowlog V3软件对由试验小鼠启动的社交接触进行评分(Helsinki University,Helsinki,Finland)。评分由小鼠在社交行为中接近陌生小鼠的持续时间决定。对下述社交行为进行定量：鼻对鼻嗅探(即接近陌生小鼠的前部)，鼻对生殖器嗅探(即接近陌生小鼠的后部)，攻击(即试验小鼠发动与陌生小鼠的战斗)和回避(即在陌生小鼠发动互动时，试验小鼠故意避开它的时候)。在社交期间，也观察并定量花费在重复行为、即梳理和挖掘上的时间。
非社交期间的重复行为：将小鼠单独置于维度为40X40X20cm的舞台20min；最后10分钟对梳理和挖掘进行定量。当观察梳理行为时，将所述小鼠置于不含木屑的干净笼子中以防止挖掘。当观察挖掘行为时，不测量自我梳理。
母性行为学习：试验4只c57bl母亲鼠和3只BTBR母亲鼠收集幼崽并将它们带回巢的潜伏时间。每只母亲鼠使用3只幼崽试验。如果母亲鼠在幼崽被放置在巢外后180秒未将它们带回巢，则被认为是失败。每只母亲鼠与三只处女鼠(学习处女鼠)共笼几天。BTBR盐水和C57盐水处女鼠与C57bl母亲鼠和它的幼崽相处一段时间，BTBR MSC-exo雌鼠与BTBR雌鼠和它的幼崽相处一段时间。也试验了从未暴露于幼崽的一组处女鼠(BTBR处女鼠，c57bl处女鼠)。在试验期间，将所有雌鼠从笼子取出，并在每次试验结束时，将小鼠放回它们的笼子被给予15分钟的重新适应时间。每只幼崽在试验时为2至4日龄之间。试验使用SAMSUNG11mp相机摄影。
T-水迷宫测定法：T-水迷宫(Guariglia&Chadman,2013；Karvat&Kimchi，2013)是一种T形有机玻璃仓室，具有尺寸为22X3X11cm的三个臂和尺寸为11X3X11cm的中心区。迷宫充满15cm深的水，保持在25±1℃。将边长为3cm的平台浸没在水下，使得顶部比水平面低0.5cm。在3天实验的每一天，每只动物进行10次试验，总共30次试验。将动物面朝中心区放置在起始臂中，并给予90秒来找到平台。当动物爬上平台时，允许它在其上停留5秒。如果小鼠在90秒内未找到平台，将它轻轻导向平台并允许在其上停留15秒。试验间时间间隔>5min。在第一和第二天，将平台放置在右臂中，而在第三天，将它放置在相反的左臂中；起始臂每天都是一致的。在小鼠在8/10的试验中获得成功之前不允许它们开始逆转试验，导致一些小鼠具有额外的学习日，并最多总共40次试验。从小鼠入水之时直至它站在平台上，测量到达平台所花费的时间的量、错误次数和转向正确或不正确道路的倾向性。
结果
MSC-外泌体的鼻内给药的高效率：在PKH26染色的外泌体的静脉内、鼻内和立体定向给药之间进行比较。使用校正的总细胞荧光(CTCF)计算来估算不同给药策略的效率(McCloy等，2014)。相对于立体定向注射的荧光定量显示，在脑中发现68.5％的鼻内给药的外泌体，但仅发现11.2％的静脉内外泌体(图1)。DAPI和NeuN免疫染色显示，所述外泌体出现在细胞中和它们的膜上(图2A-B)。
MSC-外泌体改进雄性对雌性的超声波发声：超声波发声被认为是雄性与雌性小鼠之间的交配沟通形式。沟通困难是自闭症中的核心症状，因此，评估了治疗对这种行为类型的效果。BTBR盐水小鼠在与雌鼠沟通的前5分钟发出317个音节(SEM＝39.4)，而BTBR MSC-exo在同样的时间内发出571个音节，提高180％(SEM＝74)，而C57bl小鼠(对照)在前5分钟发出854.5个音节(SEM＝65.2)(图3A，ANOVA1，F＝19.2，P<0.001)。嗅探雌鼠的生殖器或脸花费的时间没有显著差异，意味着所述效果似乎特异性影响超声波发声而不是对雌性信息素的兴趣(图3B)。定性来说，从声谱图可以看出，与BTBR盐水组相比BTBR MSC-exo发声变得更加复杂且长，使它们更类似于C57bl(图3C)。
MSC-外泌体改进雄性与雄性社交和社交期间的重复行为：在MSC-exo或盐水给药之前和之后，试验小鼠的雄性对雄性社交。对象内分析显示BTBR MSC-exo组在治疗后显著改善，并在与陌生雄性的社交接触中花费更长时间，而BTBR盐水和C57bl盐水组不受影响(图4A，配对t-检验，t<0.0001)。组间比较分析显示，在治疗前在BTBR MSC-exo和BTBR盐水的基线行为之间不存在差异，并且它们两者都显著不同于c57bl盐水的基线行为(ANOVA1，F＝14.4，p<0.01)。在治疗后，BTBR MSC-exo显著不同于BTBR盐水组(ANOVA1，F＝9.44，p<0.01)。
也测量了社交期间的重复行为。对象内分析显示BTBR MSC-exo组在治疗后显著改善，并在重复行为中花费更少时间，而BTBR盐水和C57bl盐水组不受影响(图4B，配对t-检验，t<0.001)。组间比较分析显示，在治疗前在BTBR MSC-exo和BTBR盐水的基线行为之间不存在差异，并且它们两者都显著不同于c57bl盐水的基线行为(ANOVA1，F＝13.71，p<0.001)。在治疗后，BTBR MSC-exo与BTBR盐水组和C57bl组没有显著差异，但BTBR MSC-exo在治疗之前和之后存在显著变化。
MSC-外泌体减少自我梳理和挖掘：也测量了在没有社交时的自我梳理和挖掘。在MSC-exo或盐水给药之前和之后试验小鼠的雄性与雄性社交。在梳理试验中，对象内分析显示BTBR MSC-exo组在治疗后显著改善，并花费更少的时间自我梳理，而BTBR盐水和C57bl盐水组没有变化(图4A，配对t-检验，t<0.05)。组间比较分析显示，在治疗前在BTBR MSC-exo和BTBR盐水的基线行为之间不存在差异，并且它们两者都显著不同于c57bl盐水的基线行为(ANOVA1，F＝12.4，p<0.05)。在治疗后，BTBR MSC-exo显著不同于BTBR盐水组(ANOVA1，F＝13.83，p<0.01)。
MSC-外泌体在T-水迷宫中改善认知僵化：使用T-水迷宫测定法分析学习行为和认知僵化。由于c57bl与BTBR小鼠之间不同的游泳能力，它们在试验中的行为不可比，因此将c57bl小鼠排除。总的来说，BTBR MSC-exo治疗的小鼠在所有10次试验中在逆转学习中犯明显更少的错误(图6A)。分析每个逆转条件试验的成功率显示，在试验4中，MSC-exo治疗的小鼠与盐水组相比在正确转向方面具有更高的成功率(图6B)。
MSC-exo改进母性行为学习：所有C57bl母亲鼠在平均9.9秒内将所有幼崽(12/12)收集回巢(SEM＝1.08)。C57bl处女鼠在180秒内均不收集回任何幼崽。C57bl处女鼠学习组在平均38.3sec的时间收集回所有幼崽(SEM＝11.9)。试验的3只BTBR母亲鼠中只有1只收集幼崽，但在150sec后它尚未将它们带回巢，而是将它们放置在随机地点；与C57bl母亲鼠和学习处女鼠相比它的行为是杂乱无章的。BTBR处女鼠在180秒内均不收集任何幼崽。BTBR学习处女鼠均不收集任何幼崽，即使在与C57bl母亲鼠相处几天后。BTBR MSC-EXO在平均55.7秒的时间收集所有幼崽(SEM＝12.8)，有趣的是，BTBR MSC-exo与本身不能找回幼崽的BTBR母亲鼠相处了几天。
实施例2
MSC来源的外泌体用于治疗精神分裂症
材料和方法
对安非他明诱导的超动活动的敏感性：所述实验分几个阶段进行。在第一阶段中，将30只C54/bl小鼠随机分配到3个组：盐水处理组，PCP处理组和PCP+外泌体治疗组(治疗组)。PCP组每日接受10mg/kg PCP的皮下注射共14天。同时，盐水组接受等体积的盐水注射，外泌体组接受PCP注射一剂通过鼻内给药的2μl外泌体。其他组使用相同技术接受2μl盐水。在注射结束后一周，小鼠经历行为试验。
所有组都经历系统性安非他明注射，在旷场试验中监测120分钟，并平均每5分钟测量活动指数。
潜伏抑制。在PCP处理的小鼠中通过评估听觉惊跳反射来分析外泌体对中枢信息处理的影响。将来自于每个组的3只小鼠指派到非预先暴露(NPE)组，并将7只小鼠指派到预先暴露(PE)组。向PE小鼠呈现50次30-s音调刺激物(条件刺激物-CS)的展示，而未预先暴露的(NPE)对象被禁闭在仓室中同等的时间段，没有任何刺激物展示。紧接着，PE和NPE两组经历调制，包括CS与非条件刺激物(US)之间的三次配对，所述US是音调刺激物后立即投送设置在0.3mA的1-s足部电击。24小时后，进行试验阶段。在最初的360s适应期后，发送音调CS并持续90s，在其中评估对所述音调刺激物的条件僵直的时间。
在三室社交中的社交：将3组小鼠如下处理：
1.盐水组(n＝19)，
2.PCP组(n＝17)，
3.PCP+外泌体(n＝18)。
结果
对安非他明诱导的超动活动的敏感性：在安非他明注射后，所有安非他明处理的小鼠的自主活动增加，并在注射后约40min达到峰值。在整个测量期间，在PCP处理的对象中系统性安非他明的增强效果明显更加显著。
如图8A-B和10中所示，PCP处理的小鼠(无外泌体治疗)与盐水处理的阴性对照组相比更加活跃并移动更长距离，并且也比外泌体治疗的组更加活跃。这在40min后，在安非他明激发的活动达到峰值之后最为明显。
潜伏抑制：在试验阶段期间没有发现对象之间的差异(结果未示出)。在调制期间，盐水处理组和外泌体治疗组两者，在它们在PE和NPE组的僵直响应之间显示出显著差异，而PCP处理组没有显示出NPE的僵直的显著增加NPE(图9)，表明了在PCP处理的小鼠中LI效果的降低和外泌体治疗的正面效果。
对安非他明诱导的超动活动的敏感性：所有安非他明处理的小鼠的自主活动增加，并在注射后约40min达到峰值。在大部分测量期间，在PCP处理的对象中系统性安非他明的增强效果明显更加显著。如图10中所示，接受外泌体鼻内给药的盐水处理组(第4组)不受影响(与盐水组(1)没有显著差异)。PCP处理的小鼠(第2组)与盐水处理的对照组(第1组)相比更加活跃并移动更长距离，并且也比外泌体治疗的组(第3组)更加活跃。这在40min后，在安非他明激发的活动达到峰值之后最为明显。
在三室社交中的社交：在三室范例中，PCP处理的小鼠(n＝17)显示出对空笼(即无社交刺激物)比对陌生小鼠居住的笼子(社交刺激物)更高的偏好性，正如由偏好指数所揭示的。盐水处理组(n＝19)表现出对小鼠居住的笼子的偏好性，而外泌体治疗的小鼠(n＝18)对社交刺激物显示出最高偏好性(图11)。
实施例3
在自闭症的BTBR模型中来自于骨髓来源的MSC与神经元干细胞的外泌体的比较
材料和方法
NSC来源的外泌体：使用神经干细胞系(CTX0E03)(ReNeuron)。
治疗组：小鼠接受MSC-exo(N＝5)、NSC-exo(N＝5)或盐水(N＝7)的鼻内给药共12天，每天5μL(2.5μL x2)，每隔天给药(每只小鼠总共30μL)。
结果
如图12A-B中所示，MSC来源的外泌体与盐水处理组相比增加社交、减少重复行为并增加沟通，而神经元干细胞来源的外泌体(NSC-exo)治疗的小鼠与盐水处理组相比没有表现出相同的行为差异(ANOVA1，F2,14＝4.28，p<0.05，Bonfferoni)。
尽管本发明已结合其特定实施方式进行了描述，但对于本领域技术人员来说显然许多替选方式、修改和改变是显而易见的。因此，打算包含落于权利要求书的精神和广阔范围之内的所有这些替选方式、修改和改变。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在这里整体通过参考并入本说明书，其程度等同于每个单个的出版物、专利或专利申请被具体且个别地指明通过参考并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或指明不应被解释为承认这些参考文献可用作本发明的先有技术。在使用章节标题的情况下，它们不应被解释为必然是限制性的。

Claims (8)

1.源自于间充质干细胞(MSC)的外泌体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗神经发育障碍，其中所述神经发育障碍是精神分裂症，并且其中所述药物组合物是通过鼻内给药使用。
2.源自于间充质干细胞(MSC)的外泌体在制备药物组合物中的应用，所述药物组合物用于治疗自闭症谱系障碍(ASD)，其中所述药物组合物是通过鼻内给药使用。
3.权利要求1或2所述的应用，其中所述间充质干细胞源自于牙髓。
4.权利要求1或2所述的应用，其中所述间充质干细胞源自于骨髓。
5.权利要求1或2所述的应用，其中所述间充质干细胞源自于脂肪组织。
6.权利要求1或2所述的应用，其中所述MSC是人类MSC。
7.权利要求1或2所述的应用，其中所述MSC是同种异体的。
8.权利要求1或2所述的应用，其中所述MSC是非同种异体的。
CN201780063347.2A 2016-08-14 2017-08-14 治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体 Active CN109843305B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662374852P 2016-08-14 2016-08-14
US62/374,852 2016-08-14
PCT/IL2017/050899 WO2018033911A1 (en) 2016-08-14 2017-08-14 Mesenchymal cell-derived exosomes to treat neurological disorders

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109843305A CN109843305A (zh) 2019-06-04
CN109843305B true CN109843305B (zh) 2023-03-10

Family

ID=61196484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780063347.2A Active CN109843305B (zh) 2016-08-14 2017-08-14 治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11129852B2 (zh)
EP (1) EP3496730B1 (zh)
JP (1) JP7014449B2 (zh)
CN (1) CN109843305B (zh)
AU (1) AU2017311684B2 (zh)
CA (1) CA3033951A1 (zh)
ES (1) ES2925527T3 (zh)
IL (1) IL264825B (zh)
PL (1) PL3496730T3 (zh)
SG (1) SG11201901272WA (zh)
WO (1) WO2018033911A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3773506A4 (en) 2018-03-29 2021-12-22 Technion Research & Development Foundation Limited VESICLES INCLUDING A PTEN INHIBITOR AND THEIR USES
PT3852525T (pt) * 2018-09-20 2023-06-02 Univ Valladolid Método para obter uma população enriquecida de células estaminais mesenquimais funcionais, células obtidas a partir do mesmo e composições compreendendo as mesmas
JP6830286B1 (ja) 2020-06-26 2021-02-17 デクソンファーマシューティカルズ株式会社 精巣機能改善剤および精巣機能改善方法
EP4183866A1 (en) 2020-07-17 2023-05-24 Dexon Pharmaceuticals Inc. Composition, binding inhibitor, medical device, and method for preventing covid-19
EP4212163A1 (en) 2020-09-08 2023-07-19 Dexon Pharmaceuticals Inc. Cytokine storm inhibitor, method for using cytokine storm inhibitor, and method for screening for cytokine inhibitor
JP6974892B1 (ja) 2021-05-27 2021-12-01 デクソンファーマシューティカルズ株式会社 癌悪液質の改善剤および癌悪液質の改善方法
WO2023223312A1 (en) 2022-05-15 2023-11-23 Nurexone Biologic Ltd. Anti-pten rna interference oligonucleotides and uses thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101184499A (zh) * 2005-02-23 2008-05-21 阿尔扎公司 活性剂向中枢神经系统的鼻内施用
WO2013124817A2 (en) * 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. MicroRNAS FOR THE GENERATION OF ASTROCYTES
CN103561751A (zh) * 2010-11-15 2014-02-05 李昭男 由人类滋养层干细胞生成神经干细胞
WO2015038075A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Agency For Science, Technology And Research Method

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
US5486359A (en) 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
WO2009087361A1 (en) 2008-01-04 2009-07-16 Lydac Neuroscience Limited Microvesicles
EP2254586B1 (en) 2008-02-22 2015-04-08 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Mesenchymal stem cell particles
KR20100054711A (ko) 2008-11-14 2010-05-25 메디포스트(주) 간엽 줄기세포 또는 이의 배양액을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN103037872B (zh) 2010-03-26 2015-12-02 国立大学法人名古屋大学 损伤部位治疗用组合物
JP5608927B2 (ja) 2010-04-13 2014-10-22 国立大学法人名古屋大学 歯髄幹細胞を用いた神経疾患治療用組成物
GB201011589D0 (en) 2010-07-09 2010-08-25 Reneuron Ltd Therapeutic cells
WO2012020307A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 The University Court Of The University Of Glasgow Therapeutic uses of microvesicles and related micrornas
WO2012156968A2 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Ariel - University Research And Development Company, Ltd. Use of mesenchymal stem cells for the improvement of affective and cognitive function
BR112014024541A2 (pt) * 2012-04-03 2017-08-08 Reneuron Ltd micropartículas de células tronco
WO2013186735A2 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Bar-Ilan Research And Development Company Ltd. Photothermal detection
EP3270984A4 (en) * 2015-03-16 2019-04-17 Duncan Ross TREATMENT METHOD WITH MEMBRANE-INCLUDED VESICLE

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101184499A (zh) * 2005-02-23 2008-05-21 阿尔扎公司 活性剂向中枢神经系统的鼻内施用
CN103561751A (zh) * 2010-11-15 2014-02-05 李昭男 由人类滋养层干细胞生成神经干细胞
WO2013124817A2 (en) * 2012-02-22 2013-08-29 Brainstem Biotec Ltd. MicroRNAS FOR THE GENERATION OF ASTROCYTES
WO2015038075A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Agency For Science, Technology And Research Method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Systemic administration of exosomes released from mesenchymal stromal cells promote functional recovery and neurovascular plasticity after stroke in rats;Hongqi Xin et al.;《 Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism》;20130821;1-5页，摘要 *
细胞移植治疗小儿严重脑损伤及神经残疾专家共识;栾佐;《中华细胞与干细胞杂志(电子版)》;20151101(第04期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201901272WA (en) 2019-03-28
IL264825B (en) 2022-08-01
US11129852B2 (en) 2021-09-28
US20210361717A1 (en) 2021-11-25
ES2925527T3 (es) 2022-10-18
WO2018033911A1 (en) 2018-02-22
AU2017311684B2 (en) 2023-05-04
CA3033951A1 (en) 2018-02-22
EP3496730A4 (en) 2020-05-06
AU2017311684A2 (en) 2019-03-28
EP3496730B1 (en) 2022-05-25
EP3496730A1 (en) 2019-06-19
IL264825A (zh) 2019-04-30
JP7014449B2 (ja) 2022-02-01
PL3496730T3 (pl) 2022-09-26
JP2019524824A (ja) 2019-09-05
AU2017311684A1 (en) 2019-03-07
US20190209621A1 (en) 2019-07-11
CN109843305A (zh) 2019-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109843305B (zh) 治疗神经障碍的间充质细胞来源的外泌体
Tajiri et al. Intravenous transplants of human adipose-derived stem cell protect the brain from traumatic brain injury-induced neurodegeneration and motor and cognitive impairments: cell graft biodistribution and soluble factors in young and aged rats
Nizzardo et al. Minimally invasive transplantation of iPSC-derived ALDHhiSSCloVLA4+ neural stem cells effectively improves the phenotype of an amyotrophic lateral sclerosis model
Bouchez et al. Partial recovery of dopaminergic pathway after graft of adult mesenchymal stem cells in a rat model of Parkinson's disease
Marei et al. Human olfactory bulb neural stem cells expressing hNGF restore cognitive deficit in Alzheimer's disease rat model
EP1811018A1 (en) Brain disposition marrow progenitor
US10870830B2 (en) Method for culturing differentiation-promoting and -sustaining spheroid form of tonsil-derived stem cells
JP7138959B2 (ja) 神経前駆細胞集団を作出する方法
Zhang et al. Human amniotic epithelial cell transplantation promotes neurogenesis and ameliorates social deficits in BTBR mice
JP2021098738A (ja) 外傷性脳損傷後のバイオブリッジ形成時に発現する組成物
US20240060048A1 (en) Method for promoting and improving properties of adipose tissue, tissue and cells obtained by said method
EP4180517A1 (en) Pre-conditioned mesenchymal stem cells and preparations and applications thereof
Zhdanova et al. Effect of intranasal administration of multipotent mesenchymal stromal cell exosomes on memory of mice in Alzheimer’s disease model
KR20190123709A (ko) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도
Wang et al. Pre-clinical study of human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of traumatic brain injury: safety evaluation from immunogenic and oncogenic perspectives
Jung et al. Iron oxide nanoparticle-incorporated mesenchymal stem cells for Alzheimer’s disease treatment
Chen et al. Neural stem cells in the treatment of Alzheimer’s disease: Current status, challenges, and future prospects
TWI672147B (zh) 以外源性粒線體爲有效成份之組合物、其用途及修復細胞之方法
Bhatti et al. Stem cells in the treatment of Alzheimer's disease–Promises and pitfalls
Romero-García et al. Extracellular Vesicles and Cellular Ageing
Elia EFFECTS OF MICROVESICLES DERIVED FROM BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS IN EXPERIMENTAL MODELS OF ALZHEIMER¿ S DISEASE
Yoon et al. Trametinib activates endogenous neurogenesis and recovers neuropathology in a model of Alzheimer’s disease
TW202330908A (zh) 用於治療阿茲海默症的醫藥組合物
Iannoto A role for T cells in the induction of memory deficit in mice with Alzheimer’s-like disease
KR20230140802A (ko) 줄기세포의 기능 강화용 조성물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant