CN111925983A - 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents
一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111925983A CN111925983A CN202010821052.0A CN202010821052A CN111925983A CN 111925983 A CN111925983 A CN 111925983A CN 202010821052 A CN202010821052 A CN 202010821052A CN 111925983 A CN111925983 A CN 111925983A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- human adipose
- derived mesenchymal
- stem cells
- exosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 119
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 107
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 20
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 18
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 18
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 18
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 17
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 claims description 10
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 abstract description 15
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 abstract description 3
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004217 heart function Effects 0.000 abstract description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 69
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 15
- BNJOZDZCRHCODO-UHFFFAOYSA-N dimethyloxalylglycine Chemical compound COC(=O)CNC(=O)C(=O)OC BNJOZDZCRHCODO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 8
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 8
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 8
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 8
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 7
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 6
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 6
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 6
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 6
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 6
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 6
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 6
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 6
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 206010011086 Coronary artery occlusion Diseases 0.000 description 3
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003601 intercostal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 230000003680 myocardial damage Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003516 pericardium Anatomy 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 208000001778 Coronary Occlusion Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010052337 Diastolic dysfunction Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000962067 Gallus gallus Neuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102100026018 Interleukin-1 receptor antagonist protein Human genes 0.000 description 1
- 101710144554 Interleukin-1 receptor antagonist protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010071436 Systolic dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003519 biomedical and dental material Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 208000026758 coronary atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 1
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000003205 diastolic effect Effects 0.000 description 1
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000010856 establishment of protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 108091043612 miR-146b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 210000002487 multivesicular body Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000000062 pectoralis major Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000001147 pulmonary artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000036391 respiratory frequency Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5428—IL-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提出了一种用于治疗心肌梗死的高表达IL‑10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，涉及生物技术领域。该制备方法包括如下步骤：培养过表达IL‑10的人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到所述外泌体。本发明的优点在于，通过培养过表达IL‑10的人脂肪间充质干细胞，制备得到过表达IL‑10的人脂肪间充质干细胞外泌体，该过表达IL‑10的人脂肪间充质干细胞外泌体含有大量IL‑10和其他多种RNA及细胞因子，有效修复梗死的心肌细胞，增强心脏功能，降低代偿性心肌负荷，缓解心衰，为心肌梗死提供一种治疗药物或者治疗策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病，是由于脂质代谢不正常，血液中的脂质沉着在原本光滑的动脉内膜上，并逐渐堆积形成白色斑块，引起血管腔狭窄或阻塞，严重可导致冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死，造成心肌梗死。发生心肌梗死后，部分心肌细胞由于缺血缺氧难以修复，使得心脏功能降低，代偿性心肌负荷增加，久而久之会造成心衰等严重并发症。冠心病发病时，冠状动脉会闭塞20-30分钟，这样的心肌损伤通常为可逆性的，但是随时间推移，坏死的心肌量会逐渐增加。如果冠状动脉闭塞时间延长至2-6小时，受累心肌边缘会有波浪状纤维形成，超过6小时至梗死后3天，心肌会呈凝固性坏死、间质充血、水肿和中性粒细胞浸润。如果有足够量的心肌受累，可诱发心室舒张和收缩功能障碍，产生一系列的血流动力学变化。
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。由于心肌梗死的高致死率以及干细胞较强的分化能力，以干细胞为基础的细胞治疗成为心肌梗死的研究热点。虽然利用干细胞治疗心肌梗死理论上安全可行，但是细胞移植后在损伤区域分布的数量及滞留率是否足以治疗或保护心肌梗死细胞还有待研究。众所周知，细胞在移植后凋亡较快，凋亡过程中产生的活性物质是否致瘤也不明确。因此，深入研究干细胞对心肌梗死产生的治疗或保护作用以及寻找干细胞治疗心肌梗死的新的靶点和方法具有重要意义。
脂肪间充质干细胞是干细胞中优势较明显的一种，相对于其他干细胞，具有一些特殊的优点：如取材方便、来源广泛、更强的增殖、分化能力、成瘤率低以及不涉及社会和道德伦理等方面的争议。多项研究表明，脂肪间充质干细胞分泌物中含有大量的细胞因子和蛋白等，可用于多种疑难杂症的治疗，是一种来源极为广泛，取材简单且方便的新型生物医学材料。然而，目前脂肪间充质干细胞也存在普通干细胞常见的一些问题，比如虽然脂肪间充质干细胞含有较多的生物活性因子，但这些生物活性因子的含量低、性质不稳定、在病灶区域滞留率低，这些问题都极大程度的限制了脂肪间充质干细胞在临床上的广泛应用。
外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的膜囊泡，其中包含DNA片段、mRNA、功能蛋白及转录因子等多种具有生物活性的物质，外泌体的膜结构还可表达多种抗原、抗体分子，这些生物活性物质进入靶细胞，可参与调节靶细胞内的多种生理生化过程，进而产生各种生物学效应。外泌体的发现，为干细胞以及脂肪间充质干细胞心肌梗死方面的进一步应用提供了思路。虽然目前有研究表明，干细胞来源的外泌体在心肌梗死方面作用显著，其能够抑制心机细胞凋亡、促进新生血管生成、改善心肌梗死后心肌细胞的功能。但由于不同来源的干细胞的表达的外泌体中生物活性物质有很大差异，脂肪间充质干细胞来源的外泌体是否表达能治疗心肌梗死的活性物质还需要较多研究证明。
白介素-10(IL-10)是一种多细胞源、多功能的细胞因子，能参与调解细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的验证与免疫抑制因子。有研究表明，IL-10可以促进IL-1受体拮抗剂表达，有利于抗动脉粥样硬化，提示其可能在冠心病治疗中发挥一定的作用。外源性补充IL-10可作为冠状动脉粥样硬化性心脏病引起的心肌梗死的新途径。但外源性IL-10在受损区域的留滞率和机体本身的排异反应都会影响其功能，如何使IL-10能在心肌梗死受损区域稳定的发挥作用，还有待进一步研究。
本发明通过构建SD大鼠，验证过表达IL-10的脂肪间充质干细胞来源的外泌体对心肌细胞的保护作用，并以此构建脂肪间充质干细胞系，为过表达IL-10的脂肪间充质干细胞来源的外泌体用于治疗心肌梗死提供技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，制备的人脂肪间充质干细胞外泌体可有效修复心肌梗死细胞。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：培养过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到前述外泌体。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，前述过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞通过如下方式制备而成：制备IL-10过表达载体，将IL-10过表达载体转染入前述人脂肪间充质干细胞，筛选鉴定，得到过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，将IL-10过表达载体转染入前述人脂肪间充质干细胞所用工具包括腺病毒、慢病毒、Lip2000和Lip3000。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，前述鉴定筛选包括向前述人脂肪间充质干细胞中加入700μg/mL的G418，培养10～14天。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，前述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、接种和传代培养制得，消化前述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.06～0.16％的IV型胶原酶和质量百分数为0.015～0.02％的BSA。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，前述人脂肪间充质干细胞为P2～P8代。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，消化前述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1％的IV型胶原酶和质量百分数为0.02％的BSA，消化的时间为30～35min。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，培养前述人脂肪间充质干细胞的培养液为体积百分数为10％的无外泌体的胎牛血清培养基。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，接种时，所述人脂肪间充质干细胞接种的密度为2～6×104/cm2。
在本发明的一些实施例中，上述高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，对所述上清液进行超速离心时，前述差速离心包括以1500g离心10min后再以10000g离心10min。
相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
本发明提供的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，通过采用特定的方法分离培养人脂肪间充质干细胞，再向该人脂肪间充质干细胞稳定过表达IL-10，并以特定的方式收集外泌体，整个过程简单方便，得到的外泌体效果稳定，同时，由于过表达了IL-10，使得制得的外泌体修复能力相对于未过表达IL-10的外泌体大大增强。由于梗死的心肌细胞较难修复，以至于心脏功能降低，代偿性心肌负荷增加，最终造成心衰等严重并发症等问题，但本发明提供的外泌体富含多种生物活性成分，可有效缓解心肌梗死后心肌细胞的损伤，其效果优于未转染IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1中酶解液浓度筛选结果I；
图2是本发明实施例1中不同酶解液筛选结果II；
图3是本发明实施例1中原代细胞的鉴定结果；
图4是本发明实施例2和5中不同提取条件下的外泌体相对表达量；
图5是本发明实施例2和5中不同来源人脂肪间充质干细胞外泌体的鉴定结果；
图6是本发明实施例3中传代细胞的鉴定结果；
图7是本发明实施例4中稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞中IL-10的表达情况；
图8为本发明实施例7的结果示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
本申请实施例提供一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：培养过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到所述外泌体。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例的目的在于，分离培养人脂肪间充质干细胞。
1.材料
准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪，已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD29+、CD44+、CD90+、CD34-和CD45-的单克隆抗体。
2.方法
2.1人脂肪间充质干细胞的分离
(1)无菌条件下收集脂肪组织约15mL，去除脂肪组织表面的结缔组织包膜及血管；
(2)迅速剪碎至糊状，加入不含外泌体的培养基3mL，不含外泌体的培养基中包含终浓度为0.06～0.16％的IV型胶原酶和0.015～0.02％的BSA，37℃恒温120r/min振荡消化30～35min，随时观察组织消化状态，期间每隔5～8min取出混匀，终止消化后用100目和200目筛网依次过滤，去除未消化组织，收集滤液；不同的消化条件对分离出的原代细胞的的活性及后续的增殖率影响较大，因此，本实施例中探讨不同消化条件对细胞活性和细胞增殖率的影响。消化条件分组如下：
表1消化条件
(3)将步骤(2)中所获得的滤液以1500r/min离心15min，弃上清，得到沉淀；
(4)将沉淀用37℃PBS轻轻吹打清洗2～3遍，再向沉淀中加入含体积分数为10％的无外泌体的胎牛血清的培养基重悬，2～6×104cells/cm2的密度接种，于37℃、5％CO2、100％相对湿度的培养箱中培养，培养12～14h后，首次换液，换液动作要轻，防止刚贴壁的细胞被换下，之后每48h更换1次新鲜培养基并用显微镜观察细胞形态。
2.2细胞增殖率分析
于固定时间向细胞中加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，于37℃培养箱孵育4h后吸除上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜。摇床震荡10min，酶联免疫检测细胞490nm波长检测各孔光密度(OD)值。计算均值，以时间为横坐标，(特定时间点光密度-第0天光密度)/第0天光密度*100％，即为不同时间点细胞的增殖率，以此为纵坐标绘制生长曲线。
2.3细胞表面标志蛋白检测
显微镜下观察细胞状态及细胞融合度，待细胞状态良好且融合度超过95％时，消化细胞，待细胞边缘开始脱离培养板后，加入培养基中止消化，离心后取沉淀，再用新鲜培养基重悬细胞调整细胞浓度，准备多个离心管，分别加入含1×106个细胞的细胞悬液，再分别加入粘附分子受体表达标记物CD29+和CD44+、干细胞标记物CD90+以及造血细胞标记物CD34-和CD45-，孵育后上机检测。
3.结果
3.1不同消化条件得到的h-MSCs的细胞活性
消化结果如图1所示，由图1可知，0.1％IV型胶原酶组的细胞活性显著(P<0.05)高于0.12％IV型胶原酶，极显著高于其他组的细胞活性(P<0.01)，当加入0.015～0.02％的BSA进行消化时，0.015％BSA能一定程度提高得到的h-MSCs的细胞活性，但不具有统计学上的显著差异，0.02％BSA能显著提高0.1％IV型胶原酶消化的h-MSCs的细胞活性(P<0.05)。
3.2不同消化条件得到的h-MSCs的细胞增殖率
细胞增殖率结果如图2所述(除4、7和8组外，其他组未示出)，相对于0.1％IV型胶原酶组，虽然加入0.015～0.02％的BSA进行消化时，对h-MSCs的细胞活性无统计学意义上的提升，但添加0.02％的BSA能极显著提升相应时间点h-MSCs的早期增殖(第1～3d，尤其是1～2d)(P<0.01)，0.015％的BSA能显著提升h-MSCs的早期增殖(第1～3d，尤其是1～2d)(P<0.05)，并且添加一定量的BSA能一定程度延长h-MSCs的对数期。
由此可见，消化酶液中IV型胶原酶的浓度优选为0.1％IV型胶原酶，而BSA的浓度优选为0.02％。
3.3h-MSCs鉴定结果
电镜观察细胞形态发现，该细胞为成纤维样，呈涡旋状。取0.1％IV型胶原酶+0.02％的BSA组培养5d后的细胞，以流式测量h-MSCs表面标志蛋白CD29+、CD44+、CD90+、CD34-和CD45-，结果如图3所示，由此可见，该细胞高表达粘附分子受体表达标记物CD29+和CD44+、干细胞标记物CD90+，低表达造血细胞标记物CD34-和CD45-，该结果符合国际细胞治疗协会对MSCs的鉴定标准。因此，本实施例分离的细胞为h-MSCs。
实施例2
本实施例的目的在于，分离并提纯人脂肪间充质干细胞来源的人脂肪间充质干细胞外泌体，包括如下步骤：
1.材料方法
准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪，已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40的单克隆抗体以及二甲基乙二酰基甘氨酸。
2.收集人脂肪间充质干细胞外泌体
(1)收集人脂肪间充质干细胞，接种，用无外泌体的血清培养基在37℃、5％CO2条件下开始培养；
(2)培养12h后，换入含有300μmol/L二甲基乙二酰基甘氨酸的无人脂肪间充质干细胞外泌体的血清培养基，继续培养36h，收集细胞培养液；
(3)将步骤(2)中得到的细胞培养液于4℃进行差速离心，即在1500g条件下离心10min，再以10000g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质后，得到上清液；
(4)将步骤(3)中的上清液进行超速离心，即在100000g超速离心2h，收集沉淀，即获得目的微球；
(5)向步骤(4)中的目的微球中加入生理盐水重悬，得到重悬液，再将重悬液用0.22μm过滤膜过滤，去除凋亡小体和微泡，再将过滤后的目的微球进行纯化，得到纯化后的人脂肪间充质干细胞外泌体(EVs)，将纯化后的人脂肪间充质干细胞外泌体灭菌后即得到人脂肪间充质干细胞外泌体；
(6)电子显微镜鉴定上述人脂肪间充质干细胞外泌体；并利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定。
3.结果
3.1本实施例分组信息
本实施例中，按照下述方式进行分组探索添加二甲基乙二酰基甘氨酸及差速离心对外泌体含量的影响，“+”表示按照加入二甲基乙二酰基甘氨酸或差速离心，“-”代表不添加二甲基乙二酰基甘氨酸或者按照常规方式离心。具体如表2所示：
表2分组信息
| 组别 | 二甲基乙二酰基甘氨酸 | 差速离心 |
| A | - | - |
| B | + | - |
| C | - | + |
| D | + | + |
3.2外泌体表达量及电镜检查结果
由图4可知，相对于不添加二甲基乙二酰基甘氨酸，不采用差速离心的A组，添加二甲基乙二酰基甘氨酸并利用差速离心的D组能有效提升人脂肪间充质干细胞外泌体的含量(P<0.01)。使用电子显微镜对步骤(6)中得到的人脂肪间充质干细胞外泌体的形态进行鉴定，结果显示，人脂肪间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形，有完整薄膜结构，直径在40～120nm。
3.3Elisa检测结果
利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定，EVs标记物包括CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40，检测结果表示(如图5所示)，该人脂肪间充质干细胞外泌体能表达外泌体标志物CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD 40。由此可见，本实施例制备的外泌体为人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
需要注意的是，本实施例中涉及的人脂肪间充质干细胞培养步骤未说明的地方，则与实施例1相同。
实施例3
本实施例的目的在于培养h-MSCs细胞系。
1.材料
准备人体脂肪(手术后废弃的正常人体脂肪，已签署知情同意书)、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD29+、CD44+、CD90+、CD34-和CD45-的单克隆抗体。
2.h-MSCs传代
(1)按实施例1中所示方法收集脂肪组织，以0.1％IV型胶原酶+0.02％BSA组的消化条件消化后，按照实施例1中所述方法培养细胞至80％～90％融合时，用0.25％胰酶-0.02％EDTA消化，离心后得到细胞沉淀；
(2)将细胞沉淀用新鲜无外泌体的培养基重悬，按照1:2～4传代，培养至P10，每代细胞分别命名为P1-h-MSCs、P2-h-MSCs、P3-h-MSCs、P4-h-MSCs、P5-h-MSCs、P6-h-MSCs、P7-h-MSCs、P8-h-MSCs、P9-h-MSCs和P10-h-MSCs；
(3)收集P2-h-MSCs、P5-h-MSCs、P8-h-MSCs和P10-h-MSCs，分别消化后制成单细胞悬液，分别通过流式细胞仪检测细胞表面分子标记CD29+、CD44+、CD90+、CD34-和CD45-的表达。
3.结果
3.1不同传代比例对细胞增殖率的影响
不同传代条件的细胞传代时间和细胞增殖率如表3所示，由表3可知，按照1:3比例传代，细胞的增殖率显著大于同期按1:2传代比例得到的细胞的增殖率(P<0.05)，极显著高于同期按1:4传代比例得到的细胞的增殖率(P<0.01)，由此可见，按1:3传代能得到最佳传代时间间隔和细胞增殖率，利于后期试验的进行。
表3不同传代条件的细胞传代时间和细胞增殖率
3.2不同代细胞的细胞标志物表达情况
流式检测结果表明，如图6所示，本实施例培养的人脂肪间充质干细胞的细胞形态良好，P2～P8中CD29+、CD44+和CD90+高表达，CD34-和CD45-基本不表达，P10中CD29+、CD44+和CD90+表达开始下降，但CD34-和CD45-依然不表达。由此可见，本实施例提供的分离培养方法和传代方法，能得到稳定的人脂肪间充质干细胞，至少可顺利传到至P8。
本实施例通过选择适宜的消化体系消化脂肪组织，并通过贴壁筛选，形成了一种简单高效的分离培养人脂肪间充质干细胞的方法。结果显示，本实施例特定比例的胶原酶浓度和消化条件可以有效分离纤维结缔组织与脂肪组织，并提高原代细胞的浓度、纯度和活性，使原代细胞至少能稳定传代至P8。
实施例4
本实施例的目的在于，构建稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。
1.构建IL-10过表达载体
(1)在NCBI数据库中查找人IL-10的编码区，利用primer 5.0设计引物，并送往华大基因合成，得到引物组；
(2)利用RNA试剂盒提取人白细胞mRNA，再通过反转录试剂盒合成cDNA，以cDAN为模板，利用步骤(1)中得到的引物组，通过RT-PCR扩增IL-10编码区，酶切回收IL-10编码区目的片段，将该目的片段克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Myc-his(A)，筛选阳性克隆，将阳性克隆送至生物公司测序，将测序正确的阳性克隆的菌液保存备用；
(3)将步骤(2)得到的菌液按1:50的体积比接种至新鲜培养基中，37℃震荡培养过夜，收集菌液，将菌液离心后取沉淀，得到菌体沉淀，利用质粒抽提试剂盒按照说明书提取菌体沉淀中的质粒，将得到的质粒利用PCR鉴定，鉴定正确的质粒即为IL-10过表达载体pcDNA3.1-IL-10；
2.人脂肪间充质干细胞G418浓度筛选
(1)取实施例3中的人脂肪间充质干细胞，优选P2～P8代，解冻复苏后，以2～6×104cells/cm2的密度接种，于37℃、5％CO2、100％相对湿度的培养箱中培养；
(2)待步骤(1)中细胞培养至贴壁后，将细胞分为pcDNA3.1-IL-10转染组(过表达IL-10)和pcDNA3.1空载组，分别换入含有0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、700μg/mL、1100μg/mL和1500μg/mL G418的新鲜培养基，每隔3天换入对应浓度的新鲜培养基，连续观察7天，其中700μg/mL组导致未转染组细胞完全死亡，由此可见，后续筛选可以将700μg/mL作为筛选浓度。
3.人脂肪间充质干细胞转染
(1)取实施例3中的人脂肪间充质干细胞，优选P2～P8代，解冻复苏后，以2～6×104cells/cm2的密度接种，于37℃、5％CO2、100％相对湿度的培养箱中培养；
(2)待细胞汇合度达到80％～90％时，制备转染混合液，转染混合液制备过程如下，将0.3μg IL-10溶于100μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀，制成A液体，再将10μLLipofectamine 2000TM溶于100μL Opti-MEM无血清培养基，混匀，得到B溶液，室温静置5min，将A液和B液混合制成转染复合体，并将细胞培养基换为Opti-MEM无血清培养基，再将转染复合体滴入细胞，培养4～6h后换成完全培养基继续培养3d；
(3)按步骤(2)中细胞按照1:3传代，加入含700μg/mL G418的新鲜培养基，每隔3天换入对应浓度的新鲜培养基，筛选10～14d，没有转染入pcDNA3.1-IL-10的人胚胎间充质干细胞死亡，转染入pcDNA3.1-IL-10的人胚胎间充质干细胞出现抗性克隆；
(4)将步骤(3)中克隆消化稀释后进行扩大培养，最终得到稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞；
(5)取部分扩大培养的细胞分别提取总RNA和蛋白，利用RT-qPCR和WesternBlotting检测IL-10表达情况。结果如图7所示，表明稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞构建成功。
实施例5
本实施例的目的在于，制备稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体。
1.材料方法
PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40的单抗、二甲基乙二酰基甘氨酸和实施例4中稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。
2.收集稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体
(1)收集实施例4提供的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞，接种，在无外泌体的血清培养基在37℃、5％CO2条件下开始培养；
(2)培养12h后，换入含有300μmol/L二甲基乙二酰基甘氨酸的无外泌体的血清培养基，继续培养36h，收集细胞培养液；
(3)将步骤(2)中得到的细胞培养液于4℃进行差速离心，即在1500g条件下离心10min，再以10000g离心10min去除细胞碎片和大分子蛋白质后，得到上清液；
(4)将步骤(5)中的上清液进行超速离心，即在100000g超速离心2h，收集沉淀，即获得目的微球；
(5)向步骤(4)中的目的微球中加入生理盐水重悬，得到重悬液，再将重悬液用0.22μm过滤膜过滤，去除凋亡小体和微泡，再将过滤后的目的微球进行纯化，得到纯化后的外泌体(EVs)，将纯化后的外泌体灭菌后即得到外泌体；
(6)电子显微镜鉴定上述人脂肪间充质干细胞外泌体；并利用Elisa对得到的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定。
3.结果
3.1外泌体表达量及电镜检查结果
分组信息如表2所示。由图4可知，相对于不添加二甲基乙二酰基甘氨酸，不采用差速离心的A组，添加二甲基乙二酰基甘氨酸并利用差速离心的D组能有效提升稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞的外泌体的含量(P<0.01)。
3.2Elisa检测结果
利用Elisa对得到的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体进行鉴定，EVs标记物包括CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD40，检测结果表示(如图5所示)，该稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体能表达外泌体标志物CD9、CD63、CD81、α-actinin-4和CD 40。
实施例6
本实施例的目的在于，构建心肌梗死SD大鼠模型。
心肌梗死SD大鼠模型具体构建方法如下：
(1)饲养SPF级SD雄性大鼠至2～3月龄，体重为2.59±21g；
(2)利用水合氯醛溶液(10％w/v)进行腹腔注射麻醉，每只SD雄性大鼠麻醉时水合氯醛溶液(10％w/v)的用量为0.3mL/100g；
(3)调整麻醉后的SD雄性大鼠的呼吸频率至70次/分，吸气/呼气比值至1:3，潮气量约为3mL/100g，同时进行呼吸机辅助呼吸；
(4)冠脉结扎：在麻醉后的SD雄性大鼠的左侧胸部常规脱毛并消毒，依次切开皮肤、浅筋膜和深筋膜，用止血钳钝性分离胸大肌和前锯肌交界处，在靠胸骨缘处用止血钳钝性分离第3-4肋间进胸，剪断第3-4肋软骨，撑开肋间露出心脏，用两个带橡皮圈的小拉钩拉开手术切口两侧组织，用湿润的棉签小心推开心脏周围的肺组织，扩大手术视野，用镊子提起心包壁层，再用眼科剪小心剪开心包，棉签向上推开胸腺即可清楚暴露左冠状静脉，以左冠状静脉为标志，用7-0眼科无创带线缝合针穿过其深部，进针深度为0.5～1.0mm并打结，在大鼠左心耳与肺动脉圆椎间，距主动脉根部约3mm结扎冠状动脉；
(5)术后处理：术毕，将步骤(4)中大鼠放入小饲养笼中，30℃条件下苏醒，每只存活的大鼠放入小饲养笼中单独饲养(主要防止术后因为大鼠的伤口或者血腥味相互打斗)，共饲养7d，术后肌肉注射青霉素预防感染并给予姜黄素腹腔注射治疗。将饲养7d后的小鼠分组备用。
实施例7
本实施例的目的在于，验证实施例5提供的外泌体对心肌梗死SD大鼠模型中梗死心肌组织修复的影响。
将实施例6中存活的心肌梗死SD大鼠均分为3组，编号为A、B、C、D、E，分别注射生理盐水、实施例1提供的脂肪间充质干细胞、实施例2提供的人脂肪间充质干细胞外泌体、实施例4提供的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞和实施例5提供的外泌体。A组为心肌梗死模型组，每次按0.5ml/只注射生理盐水；B组为人脂肪间充质干细胞组，按照0.5ml/只注射实施例1提供的人脂肪间充质干细胞悬液，人脂肪间充质干细胞悬液中细胞密度为5×105cells/ml；C组按0.5ml/只注射实施例2提供的外泌体；D组按0.5ml/只注射实施例4提供的稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞，细胞密度为5×105cells/ml；E组按0.5ml/只注射实施例5提供的外泌体。A～E五组分别处理3次，每隔5d处理一次。
处理结果如图8和表4所示。图8中A～E图以及表4中的A～E组均分别对应本实施例中A～E组。
表4不同处理方式处理心肌梗死SD大鼠后的结果
由图8可知，A组注射生理盐水后，梗死面积远远大于注射脂肪间充质干细胞的B组，而B组和D组的梗死面积又远大于C组和E组的梗死面积(p<0.05)，同时，E组的梗死面积显著小于C组的梗死面积，结合表4，可以得知，实施例2和5提供的外泌体可以明显促进梗死后心肌组织修复，且效果优于脂肪间充质干细胞，差异显著，其中，以实施例4中提供的外泌体的效果最优。
外泌体作为一种膜囊泡，可以通过生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子、基因和RNA等起到一定的作用。干细胞本身是具有极大的医用价值的生物材料，也有较多的干细胞被应用于心肌梗死、心理衰竭等心脏疾病及心脏相关的疾病，目前的研究仍然面临一些障碍，比如细胞在损伤区留置率比较低，细胞植入人体后存活率也比较低。并且，实际上多数研究仅仅停留在细胞水平，由于其技术本身的缺陷，比如某些技术参数的限制，使得这些研究无法进入动物水平验证其心机保护的作用。然而，本发明提供的稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体，选用人脂肪间充质干细胞，通过特定的细胞培养、离心和过滤等步骤，获得了能克服前述缺陷的人脂肪间充质干细胞来源稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体，该人脂肪间充质干细胞稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体含有对心肌梗死后心肌细胞修复的多种有益因子，最显著的就是IL-10，由于是外源性过表达，因此IL-10会比普通外泌体中IL-10高得多，此外还包括其他抑炎因子IL-7、HGF以及TGF-β等，活性促生长因miR-145、VEGF、EGFR、PDGF和miR-146b等，这些因子协同作用以保护受损细胞，其具体作用机制如下，主要通过4种方式发挥细胞间信息传递及生物学功能：
(1)稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体作为信号复合物，可以通过细胞表面的配体作用，直接刺激受体细胞，激发受体细胞内信号级联，引发一系列的生化和生理过程；
(2)稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体在细胞间转移受体，将受体转移至靶细胞，促进抑炎因子和活性促生长因子的作用，加速受损心肌细胞的恢复；
(3)稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒，进一步促进受体细胞的恢复；
(4)稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体通过mRNA、microRNA或转录因子向受体细胞传递遗传信息。稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体被受体细胞吸收后，其内载有的脂质、蛋白质、mRNA、microRNA等抑炎及生命活性因子可以通过改变受损心肌细胞转录和翻译程序影响蛋白修饰和定位，调节信号级联通路、关键酶反应以及细胞自动调节等方式影响受体细胞的细胞表型和功能，从而对心肌细胞起到修复及保护作用；
(5)通过稳定过表达IL-10，进一步增强稳定过表达IL-10的脂肪干细胞外泌体的修复功能。心肌梗死是造成冠状动脉粥样硬化的重要原因之一，早期、及时的复通梗死动脉可防止梗死范围进一步扩大。炎性反应、炎性因子的释放和调节在心肌梗死的发生、发展过程中发挥着重要作用。正常心肌细胞不产生TNF-α等炎性因子，心肌受损后TNF-α的浓度随心肌梗死程度增加，引发心肌细胞凋亡和心肌坏死等。在心肌梗死部位集聚稳定过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞来源的外泌体，使得IL-10在心肌受损区域大量集聚，由于外泌体本体的结构特性，可增加IL-10在受损区域的留滞率，保障受损区域长时间有高浓度的IL-10，抑制受损区域单核/巨噬细胞的活性，进而抑制TNF-α等炎性因子的产生，降低炎性因子的水平，减轻心肌梗死的病理过程，发挥心肌保护作用，进而促进心脏自身分泌促血管生成素，修复心肌梗死细胞，改善射血功能。
本发明的优点在于：人体脂肪可以从皮下脂肪获得，取材方法较为简单，使用人脂肪制备自体脂肪间充质干细胞外泌体时，更容易被患者从心理上接受，同时，由于是自体外泌体，不会发生排斥反应。同时，脂肪间充质干细胞增殖能力强，受年龄影响较小，就算是年龄较大的患者，依然可以获得活力较好的脂肪间充质干细胞外泌体。因此，本发明提供的人脂肪间充质干细胞来源外泌体制备方法可简单高效的制备大量高纯度效果好的外泌体，可以进一步应用于心肌梗死的治疗当中。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于治疗心肌梗死的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：培养过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞，收集细胞培养液；将细胞培养液差速离心，收集上清液，将上清液超速离心，获得目的微球，再将目的微球过滤、纯化和灭菌，即得到所述外泌体。
2.根据权利要求1所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞通过如下方式制备而成：制备IL-10过表达载体，将IL-10过表达载体转染入所述人脂肪间充质干细胞，筛选鉴定，得到过表达IL-10的人脂肪间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，将IL-10过表达载体转染入所述人脂肪间充质干细胞所用工具包括腺病毒、慢病毒、Lip2000和Lip3000。
4.根据权利要求3所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述鉴定筛选包括向所述人脂肪间充质干细胞中加入700μg/mL的G418，培养10～14天。
5.根据权利要求4所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞通过消化人体脂肪组织、接种和传代培养制得，消化所述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.06～0.16％的IV型胶原酶和质量百分数为0.015～0.02％的BSA。
6.根据权利要求5所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞为P2～P8代。
7.根据权利要求6所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，消化所述人体脂肪组织的酶为体积百分数为0.1％的IV型胶原酶和质量百分数为0.02％的BSA，消化的时间为30～35min。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，培养所述人脂肪间充质干细胞的培养液为体积百分数为10％的无外泌体的胎牛血清培养基。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，接种时，所述人脂肪间充质干细胞接种的密度为2～6×104cells/cm2。
10.根据权利要求1-7任意一项所述的高表达IL-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，对所述上清液进行超速离心时，所述差速离心包括以1500g离心10min后再以10000g离心10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010821052.0A CN111925983A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010821052.0A CN111925983A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111925983A true CN111925983A (zh) | 2020-11-13 |
Family
ID=73312150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010821052.0A Pending CN111925983A (zh) | 2020-08-14 | 2020-08-14 | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111925983A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114941011A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-08-26 | 生物岛实验室 | 慢病毒载体及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2687219A1 (en) * | 2012-07-18 | 2014-01-22 | Universität Duisburg-Essen | Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSCs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions |
| CN105483081A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-04-13 | 中国人民解放军第二军医大学 | miRNA145-5p修饰脐带间充质干细胞分泌的外泌体及其制备与应用 |
| CN105861430A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-17 | 南京大学 | 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用 |
| CN107007627A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 山东大学 | 脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗脂肪组织炎症药物中的应用 |
| CN110577931A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-17 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 |
| WO2019241910A1 (zh) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | 中国医学科学院阜外医院 | 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法 |
| CN111514166A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-11 | 天津医科大学眼科医院 | 过表达白介素10的间充质干细胞源性小细胞外囊泡在自身免疫性疾病药物中的应用 |
-
2020
- 2020-08-14 CN CN202010821052.0A patent/CN111925983A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2687219A1 (en) * | 2012-07-18 | 2014-01-22 | Universität Duisburg-Essen | Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSCs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions |
| CN105483081A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-04-13 | 中国人民解放军第二军医大学 | miRNA145-5p修饰脐带间充质干细胞分泌的外泌体及其制备与应用 |
| CN105861430A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-17 | 南京大学 | 一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用 |
| CN107007627A (zh) * | 2017-03-30 | 2017-08-04 | 山东大学 | 脂肪来源间充质干细胞外泌体在制备治疗脂肪组织炎症药物中的应用 |
| WO2019241910A1 (zh) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | 中国医学科学院阜外医院 | 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法 |
| CN110577931A (zh) * | 2019-10-29 | 2019-12-17 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 |
| CN111514166A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-08-11 | 天津医科大学眼科医院 | 过表达白介素10的间充质干细胞源性小细胞外囊泡在自身免疫性疾病药物中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 王成等: "间充质干细胞过表达IL-10对心肌梗死模型大鼠心功能的影响", 《实用医学杂志》, vol. 34, no. 4, pages 556 - 561 * |
| 王香云等: "二甲基乙二酰基甘氨酸对间充质干细胞外泌体生物学特性的影响", 《重庆医学》, vol. 48, no. 24, pages 4151 - 4156 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114941011A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-08-26 | 生物岛实验室 | 慢病毒载体及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101310578B1 (ko) | 심혈관 증상의 치료에 지방조직-유래 세포를 사용하는 방법 | |
| JP5450072B2 (ja) | 組織修復および再生における腎臓由来細胞およびその使用方法 | |
| CN111944748A (zh) | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途 | |
| CN110577931B (zh) | 间断缺氧处理干细胞来源外泌体及在心肌组织中的应用 | |
| CN105985985A (zh) | Crispr技术编辑并用igf优化的异体间充质干细胞的制备方法及在治疗心梗中应用 | |
| JP2014054550A (ja) | 瘻の治療における脂肪組織由来間質幹細胞の使用 | |
| CN111471650B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞来源的外泌体、鉴定方法及应用 | |
| CN112430567B (zh) | 一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用 | |
| CN105769910B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞的应用 | |
| CN113278591B (zh) | 一种心脏靶向性基因工程外泌体及其制备方法和应用 | |
| JP2020534344A (ja) | 表皮水疱症を処置するための方法及び組成物 | |
| CN108588026A (zh) | 高表达il10的临床级间充质干细胞的制备方法及其用途 | |
| CN113274411A (zh) | 经基因修饰的骨髓间充质干细胞来源的微囊泡在制备治疗肾损伤药物中的应用 | |
| CN115478048A (zh) | 培养脂肪间充质干细胞制备外泌体 | |
| CN109402175B (zh) | 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用 | |
| CN111925983A (zh) | 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 | |
| RU2662675C1 (ru) | Клетки, производные от кардиальной ткани | |
| CN107119020B (zh) | 一种基于miR-9的肝损伤靶向间充质干细胞及其制备方法与应用 | |
| CN113234811A (zh) | CircRNA000338的应用及其药物 | |
| CN111944747A (zh) | 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途 | |
| US20240034997A1 (en) | Myogenin-expressing fibroblast-like cell (meflc) line and construction method and use thereof | |
| US20140242142A1 (en) | Cell secreted proteins for the treatment of myocardial infarction | |
| CN101182493A (zh) | 一种治疗放射性肠炎的转基因间充质干细胞及其制备方法 | |
| CN114984219B (zh) | Pd1抑制剂在制备心脏成纤维细胞转分化抑制剂中的用途 | |
| CN115671137A (zh) | 人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201113 |