CN115671137A - 人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用，属于组织工程修复与再生领域，涉及人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体经实验证明具有新的医药用途。本发明利用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体建立了衰老肌腱干细胞的体外培养、大量扩增的方法，能够获得足够数量的肌腱干细胞，维持其良好的增殖、自我更新能力，抑制成骨向分化能力，促进肌腱向分化能力，利用自然衰老肌腱退化模型再次验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体能够应用于抑制衰老肌腱退化药物的制备。

Description

人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于组织工程修复与再生领域，涉及人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体经实验证明具有新的医药用途，特别涉及人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用。

背景技术

肌腱损伤是临床上的一种常见疾病，常常由于创伤、剧烈运动或者继发于慢性肌腱炎症、肿瘤等。成年后肌腱细胞密度低，血管含量少，导致其自身修复再生能力差。目前，传统的肌腱再生修复的治疗方法依然存在众多问题，例如功能恢复不理想、二次损伤率高等。近年来，组织工程技术的发展给肌腱损伤治疗提供了新的选择。组织工程由种子细胞、支架材料和生物活性因子三个重要的因素组成。生物材料的内源性再生效果与宿主干细胞功能关系密切。

然而，目前的研究大多聚焦在使用传统的生长因子TGF-β、IGF等促进肌腱定向分化，而这些生长因子存在来源有限、半衰期短的问题，限制了其临床应用。值得关注的是，临床上中老年患者肌腱损伤发病率高，常常伴有慢性炎症或者系统性疾病，肌腱干/祖细胞(Tendon stem/progenitor cells,TSPCs)干性功能下降，肌腱再生能力低下。因此，探究更为特异、安全的生物干预措施替代传统生物因子用于修复早期增强TSPCs干性，增强支架材料在病理情况下的肌腱再生效果成为现阶段亟需解决的技术问题。

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是外泌体和微泡的总称，是干细胞的主要旁分泌成分，也是发挥再生能力的重要因素。与基因编辑、生长因子相比，EVs来源广泛、安全性高，是组织再生有效的治疗载体。研究表明“年轻”间充质干细胞的EVs可以通过传递分子信号增强干细胞干性，逆转衰老特征，从而改善组织修复能力。乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是发育早期的牙髓间充质细胞，可以从脱落的乳牙中获得。再生医学角度，SHED最接近胚胎时期细胞特征，干性功能更强，且前期临床研究显示SHED通过旁分泌效应在组织损伤中起到治疗性作用，在临床转化应用中具有显著的优势。人脱落乳牙牙髓干细胞是一种具有高增殖、多潜能分化能力且容易获得的干细胞，其来源的细胞外囊泡如外泌体的有效内容物及其修饰应用尚未有研究报道。

儿童人脱落乳牙牙髓干细胞是牙源性的间充质干细胞，有较强的自我更新及多向分化潜能，关于其外泌体在抑制肌腱干细胞衰老或治疗肌腱退化疾病药物的应用尚未有研究报道。

发明内容

本发明提出了人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用，以解决现有技术中如何构建特异、安全的生物干预措施替代传统生物因子用于修复早期增强TSPCs干性，增强支架材料在病理情况下的肌腱再生效果的问题。

本发明的目的之一，是提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用。

本发明的目的之二，是提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备抑制肌腱退化药物中的应用。

进一步地，所述肌腱退化为自然衰老下的肌腱退化。

本发明的目的之三，是提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备抑制肌腱干细胞衰老药物中的应用。

进一步地，所述肌腱干细胞为衰老肌腱干细胞。

本发明的目的之四，是提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在抑制肌腱干细胞成骨向分化药物中的应用。

进一步地，所述应用使用的培养基为成骨诱导培养基。

本发明的目的之五，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在促进肌腱干细胞肌腱向分化药物中的应用。

进一步地，所述应用使用的培养基为成肌腱诱导培养基。

与现有技术相比，本发明提供了人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用，具备以下有益效果：

1.本发明利用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体建立了衰老肌腱干细胞的体外培养、大量扩增的方法，能够获得足够数量的肌腱干细胞，维持其良好的增殖、自我更新能力，抑制成骨向分化能力，促进肌腱向分化能力，利用自然衰老肌腱退化模型再次验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体能够应用于抑制衰老肌腱退化药物的制备；

2.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体来源广泛，制备简单，易于保存，具备来源细胞的优势性能，副作用小。因此，可以应用于制备抑制肌腱干细胞衰老或治疗肌腱退化疾病药物，能够有效、长期的用于治疗或预防年龄化肌腱丢失相关疾病。

附图说明

图1示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞的形态光镜图；

图2示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体透射电镜图；

图3示出了本发明实施例的一种Western Blot鉴定人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)及SHED的条件培养基浓缩(SHED-CM)所表达的外泌体特异性表面标志物；

图4中，图4a左图示出了本发明实施例的一种增殖标志物Ki67免疫荧光图，反映人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)处理第2-3代肌腱干细胞2-3天后细胞增殖情况(图中白色亮点细胞代表Ki67阳性细胞)；右图示出了左图中阳性细胞比例的统计图；图4b左图示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)处理情况下肌腱干细胞衰老相关的β-半乳糖苷酶染色图，其中，带有黑色斑点细胞为染色阳性细胞；右图示出了左图对应的染色阳性细胞比例的统计图；

图5中，图5a左图示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在成骨诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后的茜素红染色图，图中着色较深区域为染色阳性区域；右图为左图对应的染色强度的统计图；图5b示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在成骨诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后成骨标志物Runx2、Bglap基因表达检测结果；

图6中，图6a左图示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在成肌腱诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后的天狼星红染色图，图中着色较深区域为染色阳性区域；右图示出了左图对应的染色强度的统计图；图6b左图示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在成肌腱诱导培养基情况下刺激肌腱干细胞后的肌腱标志物Col1、Fmod的免疫荧光染色图，图中白色亮点区域为阳性表达区域；右图为左图对应的阳性细胞比例的统计图；

图7中，图7a左图示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)制剂抑制老年肌腱异位成骨的Micro-CT；右图为左图对应的骨体积的统计图；图7b示出了本发明实施例的一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)制剂抑制老年肌腱退化的HE染色组织图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，将给出具体实施例对本发明做出进一步说明，然而应当理解，所阐述实施例为示例性实施例，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

下述实施例中，若未特别指明，所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，本发明中的试剂和材料为市场或其他公共渠道获得。本发明所涉统计学分析使用t检验进行分析，组间P值小于0.05认为具有显著性差异。

实施例1

在本发明的一些实施例中，提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)培养。

包括SHED提取和SHED培养步骤，具体为：

(1)SHED提取

1)取符合临床乳牙拔除适应症的离体牙，暴露牙髓腔并取出牙髓，放入含2×抗生素的D-Hank’s液在4℃浸泡0.5-1小时；

2)将牙髓组织移入一新培养皿修剪后，移入1.5mL离心管中，用眼科小弯剪，剪成1～2mm³小块；加酶消化液(4mg/ml I型胶原酶+3mg/ml II型分解酶)0.5mL，37℃恒温水浴振荡消化30～60分钟；

3)收集细胞悬液，100目细胞筛过滤，离心1000rpm 5min；用D-Hank’s洗二次，最后漂洗弃上清，加DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素)，放入37℃，5％CO₂孵育箱内孵育；以后隔日或隔二日换液，待细胞80％汇合后可以传代。

(2)SHED培养

配制含10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素的DMEM培养基，在100mm的培养皿中培养SHED至第4-7代细胞；收集细胞培养基用于后续外泌体制剂提取：细胞融合度达到70％时，吸弃旧培养基，PBS洗涤，重复2次，加入含1％青霉素/链霉素但不含血清的DMEM培养基培养24小时后，收集细胞培养液，更换含血清DMEM的培养基；培养至第4-7代的SHED，细胞在培养皿底部贴壁生长，增长速度稳定，显微镜下形态如图1所示，为大小均匀的梭形或纺锤状形态。

实施例2

在本发明的一些实施例中，提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体的提取与制备。

包括蔗糖垫联合超速离心法离心；外泌体的洗涤、收集及人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)的鉴定步骤，具体为：

(1)蔗糖垫联合超速离心法离心

细胞培养基收集至50ml离心管(上清液体积不超过离心管体积的2/3)，使用Beckman台式冷冻离心机进行如下离心步骤：300×g 4℃离心10min去除死细胞，2000×g 4℃离心10min去除细胞碎片，5000×g 4℃离心30min去除大分子囊泡；离心结束后将上清分别转移到10KD和100KD超滤管中进行浓缩，使用10KD超滤管5000×g 4℃离心30min后得到SHED的条件培养基浓缩液(Conditional Medium，CM)，命名为SHED-CM；使用100KD超滤管5000×4℃离心10min得到培养基浓缩液；100KD超滤浓缩液置于离心管中，应用无菌注射器抽取5ml 30％蔗糖垫，所述30％蔗糖垫为蔗糖与重水按照质量/体积比等于30％配制，将针头抵住管底，缓慢注入30％蔗糖垫溶液，培养基和蔗糖垫出现分层后，将剩余浓缩培养基沿离心管上1/3管壁缓慢加入，使液面高度至管口3mm处，使用Beckman OptimaTM XPN-100超速离心机SW 32Ti水平转子在100000×g 4℃下离心70min，离心结束后，小心吸弃蔗糖垫上培养基，收集下方含外泌体的蔗糖垫。

(2)外泌体的洗涤、收集

将含外泌体的蔗糖垫使用PBS稀释后置于100KD的超滤管中，5000×g4℃离心10min，重复离心3次去除蔗糖重水溶液，收集到的浓缩液即为人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)来源的外泌体(Exo)，即，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)，随后以0.22μm针头式滤器过滤除菌，分装、保存于-80℃冰箱。

(3)人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)的鉴定

1)透射电子显微镜(TEM)观察

取少量SHED-Exo浓缩液于2％多聚甲醛中进行固定，然后PBS洗涤并装载到聚乙烯甲醛-碳涂层载网上，PBS再次洗涤后，2％的戊二醛固定2min，2％的磷钨酸固定5min后，将样品洗涤、干燥并通过透射电子显微镜观察外泌体形态；结果如图2所示，人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)是直径范围小于100nm的球性膜包裹结构，符合外泌体直径范围为30-150nm囊泡的形态特征。

2)Western blot

取适量SHED-Exo溶液，加入含蛋白酶抑制剂的PIPA裂解液冰上裂解30min，通过超声破碎仪破碎后，分装并置于-20℃保存，长期保存置于-80℃；采用Western blot分别检测SHED-Exo、SHED-CM以及SHED中HSP70、TSG101、CD9以及Calnexin。结果如图3所示，收集的人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)中HSP70、TSG101、CD9呈现阳性，Calnexin在SHED-Exo均呈阴性，而在来源细胞(SHED)中呈阳性。

实施例3

在本发明的一些实施例中，提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在对肌腱干细胞(TSPCs)衰老抑制药物中的生物学功能。

获取16-18月龄大鼠Achilles肌腱，充分切碎，使用胶原酶和分散酶消化后，使用DMEM培养基重悬，置于5％CO²浓度的37℃孵箱中培养，每隔2-3天更换新鲜培养基。

培养至P1、P2代的细胞呈梭形用于后续实验；

为了验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)对肌腱干细胞增殖、衰老的影响，本发明通过Ki67免疫荧光染色以及β-半乳糖苷酶染色实验进行验证。

对照组TSPCs加入普通培养基溶液，实验组TSPCs加入相同体积的含人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)的培养基，进行以下处理：

1.在相同条件下连续培养48-72h后，进行Ki67免疫荧光染色，镜下随机选取拍照并统计Ki67阳性的细胞数目；

2.相同条件下连续培养10天后，用β-半乳糖苷酶染色，镜下随机拍照并分别统计阳性染色细胞数目。

结果显示：

(1)实验组的Ki67阳性细胞数目多，而对照组的Ki67阳性细胞数目较少，实验组和对照组相比具有统计学意义。通过Ki67免疫荧光染色实验证明：体外使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)可以明显促进TSPCs的增殖能够力，见图4a；

(2)对照组衰老细胞数目较多，实验组衰老细胞数目较多，实验组和对照组相比具有统计学意义。通过β-半乳糖苷酶染色实验证明：体外使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)可以抑制肌腱干细胞衰老，见图4b。

实施例4

在本发明的一些实施例中，提供一种为了验证人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)对肌腱干细胞成骨向分化能力的影响，本发明通过茜素红染色和RT-qCR实验进行验证。

对照组TSPCs加入基础培养基溶液，实验组TSPCs加入人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成骨诱导培养基，进行以下处理：

1.在连续培养14天后，进行茜素红染色，镜下随机拍照并统计染色阳性强度；

2.相同条件下连续培养14天后，使用RT-qPCR技术，统计成骨相关基因Runx2、Bglap表达情况。

结果显示：

(1)对照组阳性染色面积比例较高，而实验组阳性染色面积比例较低，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5a；

(2)实验组相较于对照组成骨相关基因Runx2、Bglap表达明显降低，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图5b；

结论：

通过茜素红染色和RT-qCR实验证明，使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)可以明显抑制肌腱干细胞成骨分化能力。

实施例5

在本发明的一些实施例中，提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)促进肌腱干细胞肌腱定向分化的实例，本发明通过天狼星红染色、细胞免疫荧光染色实验进行证明。

对照组TSPCs加入基础培养基溶液，实验组TSPCs加入人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)，对照组和实验组每隔2-3天加入更换新鲜的成肌腱诱导培养基，进行以下处理：

1.在连续培养14天后，进行天狼星红染色，镜下随机拍照并统计染色阳性区域比例；

2.相同条件下连续培养14天后，使用细胞免疫荧光技术，统计成肌腱相关标志物Col、Fmod的表达情况。

结果显示：

(1)对照组阳性染色面积比例较低，而实验组阳性染色面积比例较高，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图6a；

(2)实验组相较于对照组成肌腱相关标志物Col1、Fmod表达明显降低，实验组和对照组相比具有统计学意义，见图6b；

结论：

通过天狼星红红染色和细胞免疫荧光实验证明，使用人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)可以明显促进肌腱干细胞成肌腱分化能力。

实施例6

在本发明的一些实施例中，提供一种人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体(SHED-Exo)在抑制自然衰老情况下肌腱退化病变药物应用中的生物学功能，本发明通过Micro-CT、HE染色实验进行验证。

1)人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体注射液制备：选择冻存的SHED-Exo，室温复温后，利用生理盐水稀释至1μg/μl，置于冰上暂存，得到SHED–Exo注射液；

2)PBS或SHED-Exo注射治疗：选取18月龄的雄性C57J小鼠为自然衰老肌腱退化模型，对小鼠使用4％水合氯醛以每10g小鼠体重按照100μl剂量范围进行腹腔注射麻醉，进入深麻醉状态后，俯卧位固定小鼠，每周进行尾静脉注射，连续注射8周后实行安乐处死，并取肌腱组织进行检测分析；取小鼠跟腱于4％多聚甲醛固定24小时进行Micro CT扫描备用，之后用于HE染色实验。

进行以下处理：

1.连续注射8周后，应用微计算机断层扫描技术(Micro-CT)扫描小鼠跟腱，将小鼠跟腱样本于4％多聚甲醛固定24小时后，使用Micro-CT以8.99μm像素尺寸、80kv电压、500μA电流、1500ms曝光时间等设置参数进行放置和扫描，根据CT图像计算肌腱区域异位骨块的骨体积；

2.连续注射8周后，进行HE染色，检测胶原纤维完整程度。

结果显示：

(1)实验组阳性异位骨块体积小，而PBS对照组异位骨块体积较大，实验组和对照组相比具有统计学意义。见图7a；

(2)实验组胶原纤维完整且排列较为整齐，而PBS对照组胶原纤维断裂且不整齐，见图7b；

结论：

通过Micro-CT、HE染色实验证明，长期注射人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体可以抑制衰老肌腱退化病变，减少异位骨块，维持肌腱胶原纤维结构。

以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (9)

1.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备肌腱损伤药物中的应用。

2.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备抑制肌腱退化药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肌腱退化为自然衰老下的肌腱退化。

4.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在制备抑制肌腱干细胞衰老药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肌腱干细胞为衰老肌腱干细胞。

6.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在抑制肌腱干细胞成骨向分化药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用使用的培养基为成骨诱导培养基。

8.人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体在促进肌腱干细胞肌腱向分化药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用使用的培养基为成肌腱诱导培养基。

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